Summary
In questo protocollo, vengono descritti due approcci per rendere più praticabili i test di compressione uniassiale delle vertebre lombari dei topi. Innanzitutto, viene descritta la conversione di una piegatrice a tre punti in una macchina per prove di compressione. In secondo luogo, un metodo di inclusione per preparare la superficie di carico che utilizza cemento osseo è adattato per le vertebre lombari dei topi.
Abstract
C'è una crescente consapevolezza che l'osso corticale e l'osso spongioso differiscono nella regolazione e nella risposta alle terapie farmacologiche, alle terapie ormonali e ad altri trattamenti per la perdita ossea legata all'età. La flessione a tre punti è un metodo comune utilizzato per valutare l'influenza di un trattamento sulla regione della diafisi media delle ossa lunghe, che è ricca di osso corticale. I test di compressione uniassiale delle vertebre dei topi, sebbene in grado di valutare le ossa ricche di osso spongioso, sono meno comunemente eseguiti a causa di sfide tecniche. Ancora meno comunemente eseguito è l'accoppiamento di test di flessione e compressione a tre punti per determinare in che modo un trattamento può influenzare la regione della diafisi media di un osso lungo e un centro vertebrale in modo simile o diverso. Qui, descriviamo due procedure per rendere il test di compressione delle vertebre lombari del topo un metodo meno impegnativo da eseguire in parallelo con la flessione a tre punti: in primo luogo, una procedura per convertire una macchina di piegatura a tre punti in una macchina per prove di compressione e, in secondo luogo, un metodo di inclusione per preparare una superficie di carico della vertebra lombare del topo.
Introduction
I cambiamenti ossei legati all'età sono ampiamente riconosciuti come problematici a causa dell'aumento del rischio di fratture ossee associate a questi cambiamenti. Le fratture ossee nell'uomo possono portare a dolore cronico, mobilità ridotta, disabilità a lungo termine, aumento del rischio di morte e oneri economici1. Le terapie comuni studiate per affrontare i sintomi dei cambiamenti ossei legati all'età includono integratori alimentari, trattamenti ormonali e farmaci 2,3,4,5,6,7,8,9. Le indagini iniziali su tali trattamenti per soggetti umani sono comunemente condotte utilizzando piccoli modelli animali (ad esempio, ratti e topi da laboratorio), che possiedono i due principali tipi di ossa presenti nello scheletro umano10. Le ossa lunghe appendicolari, come l'omero, il femore e la tibia, sono ricche di osso corticale (cioè compatto), mentre le vertebre sono ricche di osso spongioso (cioè osso intrecciato, spugnoso o trabecolare)4. È sempre più noto che i meccanismi di regolazione ossea e le vie di segnalazione differiscono tra l'osso corticale (ad esempio, l'osso lungo della diafisi mediana) e l'osso spongioso (ad esempio, il centro vertebrale)2. Per questo motivo, le terapie possono avere effetti differenziali che sono specifici per l'osso o addirittura sito-specifici all'interno dello stesso osso 2,3,4.
L'applicazione di una forza a un oggetto (ad esempio, l'osso) fa sì che l'oggetto subisca accelerazione, deformazione o entrambe, a seconda delle condizioni al contorno dell'oggetto. Quando l'osso è vincolato, una forza opposta di uguale grandezza resiste all'accelerazione dell'osso e si verifica la deformazione. Quando l'osso subisce una deformazione, si genera una resistenza interna chiamata stress, di cui esistono due tipi fondamentali: forza normale, sotto forma di tensione o compressione, e forza di taglio10. Spesso, viene generata una combinazione dei tipi di sollecitazione di base, a seconda del sistema di forze applicate10. La forza di un materiale è la sua capacità di resistere alle sollecitazioni senza cedere. Man mano che forze sempre maggiori vengono applicate a un materiale, alla fine subisce una deformazione permanente, a quel punto si dice che sia passato da uno stato elastico (cioè, tornerà alla sua forma originale se la forza viene rimossa) a uno stato plastico (cioè, non tornerà alla sua forma originale se la forza viene rimossa)11. Il punto in cui si verifica la transizione da uno stato elastico a uno stato plastico è chiamato punto di snervamento. Man mano che vengono applicate forze ancora maggiori al materiale oltre il punto di snervamento, esso subisce sempre più microfratture (cioè danni) fino a quando non si verifica la frattura totale; A questo punto, si dice che il materiale non è riuscito11,12. La frattura di un osso rappresenta un cedimento sia a livello strutturale che a livello tissutale10. Ad esempio, la rottura di un osso vertebrale si verifica perché non solo più trabecole falliscono a livello strutturale, ma c'è anche un fallimento di elementi della matrice extracellulare come i cristalli di collagene e idrossiapatite in una trabecola individuale a livello tissutale.
Gli eventi meccanici che portano al cedimento di un materiale possono essere misurati utilizzando una varietà di metodi di prova. La flessione a tre punti è un metodo comune per testare le proprietà meccaniche delle ossa lunghe dello scheletro appendicolare. Questo metodo è semplice e riproducibile, il che lo rende il metodo preferito di test biomeccanici da molti ricercatori13. Abbassando una trave a croce sulla diafisi mediana di un osso lungo appoggiato su due travi di supporto inferiori, questo metodo testa in modo specifico le proprietà meccaniche della regione della diafisi mediana, che è un osso corticale densamente organizzato. Dalle curve carico-spostamento, è possibile determinare gli effetti della forza di trazione sull'elasticità, la tenacità, la forza a rottura e la transizione dal comportamento elastico a quello plastico dei materiali ossei, tra le altre proprietà.
Nel secondo tipo di osso, indicato come osso trabecolare, spugnoso, intrecciato o spongioso, gli elementi ossei sono formati in una serie di aste e travi chiamate trabecole, dando un aspetto "spugnoso". I principali corpi vertebrali (cioè i centri) sono ricchi di osso spongioso e sono spesso i siti di fratture ossee da compressione legate all'età nell'uomo14. Le vertebre lombari (cioè la parte bassa della schiena) sono le vertebre più grandi, sopportano la maggior parte del peso del corpo e sono il sito più comune per le fratture vertebrali15,16. Le proprietà meccaniche dei corpi vertebrali possono essere valutate direttamente utilizzando metodi di prova di compressione uniassiale poiché la compressione assiale è il normale carico di forza imposto alle colonne vertebrali in vivo17. La compressione dei corpi vertebrali in vivo si verifica a causa delle contrazioni muscolari e legamentose, della forza di gravità e delle forze di reazione al suolo18.
I test di compressione ex vivo di piccole vertebre animali possono essere difficili a causa delle loro piccole dimensioni, della forma irregolare e della fragilità. La forma dei corpi vertebrali può essere stimata come un parallelogramma con lieve inclinazione ventrale e leggera concavità cranica17. Questa forma presenta sfide per ottenere prove di compressione uniassiale ex vivo perché, senza un'adeguata preparazione alla superficie di carico, le forze di compressione verranno applicate solo a una parte della superficie di carico, con conseguente "contatto locale"17,19. Ciò può causare risultati incoerenti e guasti prematuri19. Questo non è il caso in vivo perché la superficie di carico è circondata da dischi intervertebrali in corrispondenza delle articolazioni vertebrali, il che consente di distribuire il carico in tutta la placca terminale cranica. Il complesso disco intervertebrale-placca terminale cranica svolge un ruolo importante nell'applicazione della forza in tutto il corpo vertebrale e nella biomeccanica della frattura al corpo vertebrale14,20. Sebbene i test di compressione non siano nuovi nel campo della biologia, ci sono limitazioni negli attuali metodi di test meccanici delle ossa. Queste limitazioni includono la mancanza di modelli predittivi e simulazioni per la meccanica ossea, un'architettura spaziale geometrica unica e persino variazioni biologiche intrinseche basate su campioni21. Ancora più importante, il campo è messo alla prova da una mancanza di standardizzazione tra i metodi e da una generale mancanza di metodi riportati in letteratura22.
Esistono due metodi riportati in letteratura per la preparazione delle vertebre lombari dei roditori per ottenere prove di compressione uniassiale: il metodo di taglio e il metodo di inclusione 17,19,23,24,25,26. Il metodo di taglio richiede che i processi vertebrali, la placca terminale cranica e la placca terminale caudale vengano tagliati dal corpo vertebrale. Pendleton et al.19 hanno precedentemente riportato un metodo dettagliato per l'uso di questo metodo sulle vertebre lombari del topo. Questo metodo presenta la sfida di ottenere tagli perfettamente paralleli sia alla placca caudale che a quella cranica, evitando al contempo danni al campione. Ha anche la limitazione che la placca terminale cranica viene rimossa. La placca terminale cranica contiene un denso guscio di osso corticale e svolge un ruolo importante nella distribuzione dei carichi dai dischi intervertebrali in vivo ed è coinvolta nel cedimento dell'osso per le fratture in vivo 17,20,27. Al contrario, il metodo di inclusione comporta la rimozione dei processi vertebrali mantenendo intatta la placca terminale cranica del corpo vertebrale. La superficie di carico viene quindi resa approssimativamente orizzontale posizionando una piccola quantità di cemento osseo sull'estremità cranica del corpo vertebrale. Questo metodo ha il vantaggio di superare le sfide tecniche associate al metodo di taglio e può imitare meglio il meccanismo di applicazione del carico e di cedimento osseo in vivo grazie alla conservazione della placca terminale cranica. Questo approccio è stato precedentemente documentato in studi che hanno coinvolto test di compressione uniassiale su ossa di ratto. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, non è stato precedentemente documentato nel contesto delle vertebre lombari di topo più piccole 17,25,26. Il metodo in questione è stato precedentemente dettagliato da Chachra et al.25 e originariamente utilizzava un campione osseo tenuto tra due piastre, ciascuna con una cavità cilindrica, che è stata poi riempita con polimetilmetacrilato (PMMA). Lo stesso gruppo di ricerca ha successivamente migliorato il metodo in cui un'estremità viene levigata delicatamente (caudale) e l'altra estremità ha una piccola macchia di cemento osseo aggiunto (cranio)26. Questo metodo è un miglioramento rispetto al metodo precedente perché riduce al minimo il materiale tra i piani ed è l'obiettivo di questo articolo. Nonostante le sfide associate ai test di compressione vertebrale uniassiale, si tratta di un metodo che può fornire informazioni preziose sugli effetti di una terapia proposta sull'osso, soprattutto se abbinato alla flessione a tre punti.
Qui viene presentato l'uso di una macchina di prova di flessione/compressione a tre punti convertibile per consentire un facile test sia delle ossa lunghe che dei corpi vertebrali utilizzando un'unica macchina. Inoltre, viene presentato l'uso di un metodo di inclusione per ottenere test di compressione uniassiale delle vertebre lombari del topo. Il presente studio è stato eseguito come parte di uno studio più ampio che mirava a indagare le influenze dell'integrazione alimentare di semi di canapa sulle proprietà dell'osso scheletrico nei topi C57BL/6 femminagiovani e in crescita 5,6. Il tester di flessione a tre punti è stato originariamente costruito da docenti e studenti del Dipartimento di Ingegneria della Colorado State University-Pueblo e utilizzato dal nostro gruppo di ricerca nei test di flessione a tre punti su ossa lunghe [femore e tibiadi ratto 7 e omero, femore e tibia di topo 5,6,8,9]. Tuttavia, la sua modifica e applicazione per l'uso nei test di compressione del corpo vertebrale del topo non è stata esplorata. La progettazione e la costruzione della piegatrice a tre punti sono state descritte in precedenza7. Questo rapporto si concentrerà sui metodi utilizzati per modificare la macchina per le prove di compressione e per correggere lo spostamento del sistema. In secondo luogo, viene descritto il metodo di inclusione per la preparazione della superficie di carico del corpo vertebrale del topo, insieme ai metodi per le prove di compressione uniassiale e l'analisi dei dati di carico-spostamento.
Protocol
Tutti gli esperimenti e i protocolli sono stati condotti in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del National Institutes of Health e hanno ricevuto l'approvazione dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Colorado State University-Pueblo (numero di protocollo: 000-000A-021). Le procedure dettagliate per la cura degli animali sono state descritte in precedenza 5,6. I topi sono stati ottenuti a tre settimane di età come parte di uno studio più ampio volto a studiare gli effetti di una dieta integrata con semi di canapa su topi C57BL/6 femmine giovani e in crescita (vedi Tabella dei materiali). Da 5 a 29 settimane di età, i topi sono stati allevati con una delle tre diete: controllo (0% semi di canapa), 50 g/kg (5%) semi di canapa, o 150 g/kg (15%) semi di canapa, con otto topi per gruppo 5,6. Durante lo studio, i topi hanno avuto accesso ad libitum alle rispettive diete e all'acqua, sono stati alloggiati in coppie in gabbie di policarbonato e mantenuti su un ciclo di 12 ore luce:12 ore di buio (con luci accese dalle 06:00 alle 18:00). Il peso e la salute dei topi sono stati valutati settimanalmente e tutti i topi hanno completato con successo lo studio senza sviluppare condizioni di salute avverse. A ventinove settimane di età, i topi sono stati anestetizzati in profondità con gas isoflurano e sottoposti a eutanasia tramite lussazione cervicale 5,6. È stata praticata un'incisione sulla linea mediana sulla superficie ventrale dallo sterno alla coda e tutti gli organi intratoracici, peritoneali e retroperitoneali sono stati rimossi dalle carcasse. Le carcasse eviscerate sono state conservate in una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% a -70 °C fino al momento della dissezione ossea per il test delle vertebre, avvenuto circa un anno dopo.
1. Conversione di una piegatrice a tre punti in una macchina per prove di compressione
- Svitare la traversa fissata al sensore di carico sulla piegatrice a tre punti7 (vedi Tabella dei materiali) (Figura 1A,B).
- Avvitare una piastra superiore autoallineante sul sensore di carico (vedere la tabella dei materiali) con filettatura identica alla traversa (Figura 1C).
- Praticare due fori orizzontali in ciascuno dei supporti inferiori, dove verrà fissata la piastra inferiore in un secondo momento (Figura 1D).
- Battere le filettature sui due lati di una piastra inferiore in acciaio inossidabile per allinearle con i fori praticati nei supporti inferiori (Figura 1E).
- Fissare la piastra inferiore ai due supporti inferiori utilizzando viti esagonali filettate e serrare fino a fissarla (Figura 1F).
NOTA: Le viti esagonali devono avere filettature che corrispondano ai fori filettati sui supporti inferiori e sulle piastre superiore/inferiore. L'uso di una piastra superiore autoallineante può aiutare a ottenere un contatto uniforme tra la piastra superiore e la superficie di carico, ma non è sufficiente data la concavità dell'estremità cranica dei corpi vertebrali. È necessaria un'ulteriore preparazione con un metodo di preparazione del piano di carico. Quando si costruisce una macchina per prove di compressione per ossa di animali di piccole dimensioni, che sono più piccole e più deboli di molti materiali industriali/ingegneristici, è essenziale considerare la capacità di carico del sensore di carico e le dimensioni del telaio di carico. Inoltre, le macchine devono essere pulite e lubrificate regolarmente per garantire risultati accurati e un funzionamento regolare.
2. Correzione dello spostamento della macchina per prove di compressione
- Senza materiale di prova tra la piastra superiore e la piastra inferiore, abbassare la piastra superiore sulla piastra inferiore fino a quando non si è verificato un leggero contatto (~0,3-0,5 N forza di precarico).
- Accendere la macchina a una velocità di abbassamento costante (~1 mm/min) per iniziare la prova di compressione. Raccogliere le misure di carico (N) e spostamento (mm) utilizzando un software di raccolta dati digitale (vedere la tabella dei materiali) per la raccolta dei dati delle prove meccaniche.
NOTA: Poiché non c'è materiale tra il piano superiore e quello inferiore, tutti gli spostamenti osservati saranno dovuti al solo spostamento della macchina (macchina Δx) (telaio, cella di carico, piani, giunti, ecc.). - Continuare ad abbassare la piastra superiore sulla piastra inferiore a una velocità costante (cioè monotona) fino a raggiungere forze superiori a quelle che si otterranno da tutti i campioni ossei.
- Ripetere i passaggi da 2.1 a 2.3 per un totale di tre volte.
- Tracciare i dati per lo spostamento del sistema (macchina Δx, mm) rispetto a. carico applicato (Forza, N).
- Adattare una linea di regressione di adattamento ottimale ai dati (Figura 2A-D).
- In un foglio di calcolo con i dati di un test di compressione ossea, utilizzare l'equazione fornita dall'analisi di regressione per determinare la quantità di spostamento della macchina (macchina Δx) che influenza lo spostamento registrato (Δxtotale registrato) per un punto dati di un test di compressione della vertebra lombare del topo.
NOTA: Si consideri, ad esempio, un punto dati in cui viene applicata una forza di 18 N e sono stati registrati 2.730 mm di spostamento (Δxtotale registrato). Secondo l'equazione di regressione polinomiale del terzo ordine di esempio (Figura 2D) [Δxmacchina = (4 × 10-7 x Carico applicato3) - (8 × 10-5 x Carico applicato2) + (0,0044 x Carico applicato)], 0,056 mm dello spostamento registrato è dovuto allo spostamento della macchina (macchina Δx).
Δxtotale registrato= Δxmacchina + Δxprovino - Correggere lo spostamento registrato per il punto dati.
NOTA: Si consideri, ad esempio, l'esempio precedente. Se si registrano 2.730 mm di spostamento (Δxtotale registrato) e lo spostamento della macchina (macchina Δx) rappresenta 0,056 mm del totale, allora lo spostamento che il provino (cioè l'osso) di interesse ha subito (campione Δx) è 2.664 mm. Pertanto, 2.664 mm è lo spostamento effettivo che la vertebra ha subito (provino Δx) ed è il valore da utilizzare per l'analisi della curva carico-spostamento.
Campione Δx = Δxtotale registrato - macchina Δx - Ripetere i passaggi 2.7-2.8 per ogni punto dati raccolto per ogni singolo campione (osso).
NOTA: Questo passaggio è importante perché durante la prova di compressione, lo spostamento osservato non è dovuto solo allo spostamento del provino, ma è invece una combinazione dello spostamento della macchina (macchina Δx) (ad esempio, compressione/spostamento del telaio, cella di carico, piastre, giunti, ecc.) e del provino (provino Δx). Pertanto, per gli esemplari che subiscono quantità relativamente piccole di spostamento, come quelli di un piccolo animale (ad esempio, un topo), lo spostamento del sistema (macchina Δx) può causare grandi errori. Le procedure qui descritte per correggere lo spostamento del sistema sono state precedentemente riportate da Kalidindi e Abusafieh28, che descrivono anche altri due metodi oltre a quello qui descritto. È stato notato che alcuni ricercatori utilizzano più di un metodo per determinare lo spostamento del sistema17. Ogni macchina può visualizzare modelli e gradi di spostamento del sistema univoci quando vengono applicati dei carichi. Per questo motivo, il fattore di correzione dello spostamento del sistema deve essere determinato per ogni macchina e non sarà lo stesso tra due macchine qualsiasi. A differenza della prova di compressione di un osso vertebrale, non si osserverà una grande riduzione della forza durante la misurazione dello spostamento del sistema perché non c'è materiale tra la piastra superiore e quella inferiore.
3. Dissezione della 5a vertebra lombare (L5) dalla carcassa del topo
- Scongelare la carcassa di topo congelata a temperatura ambiente, avendo cura di mantenere idratati i tessuti molli e le ossa applicando regolarmente una soluzione isotonica di NaCl allo 0,9%.
- Fai una piccola incisione (<0,5 cm) nella pelle sulla linea mediana dorsale vicino alla base della coda, quindi estendi il taglio su ciascun arto posteriore e tira delicatamente per rimuovere la pelle dalla base della coda alla testa dell'animale.
- Tagliare la muscolatura della parete addominale fino a quando la colonna vertebrale non è facilmente visibile.
- Sotto un microscopio da dissezione, visualizza le due articolazioni sacroiliache e l'estremità cranica dell'osso sacro.
- Usando una lama di rasoio o un bisturi, fai un taglio sottile per separare l'ultima vertebra lombare (L6) dall'estremità cranica dell'osso sacro.
- Ancora una volta, tagliando tra lo spazio intervertebrale, rimuovere L6 e L5 dalla colonna vertebrale, mettendo da parte L5 per l'analisi (Figura 3).
- Ispezionare la vertebra al microscopio da dissezione e rimuovere tutti i tessuti molli dall'osso, compreso il disco intervertebrale, utilizzando principalmente garze e delicatamente con una pinza dove necessario.
NOTA: Nel presente studio, la L5 è stata scelta come vertebra di interesse, ma altre vertebre lombari possono essere scelte per i test di compressione.
4. Preparazione della superficie di carico della vertebra L5 per la prova di compressione uniassiale utilizzando il metodo di inclusione del cemento osseo PMMA
- Utilizzando un disco da taglio diamantato (vedere la tabella dei materiali) collegato a un utensile rotante, eseguire un taglio su ciascun peduncolo per rimuovere il processo trasversale e spinoso (Figura 4). Se lasciati attaccati al centro, i processi vertebrali possono provocare contatti locali con le piastre superiori/inferiori in corrispondenza dei processi stessi, al contrario di una distribuzione del carico in tutto il centro.
- Carteggiare delicatamente l'estremità caudale della vertebra utilizzando carta vetrata fine a grana 120 (vedi Tabella dei materiali) per rimuovere tutti i dischi intervertebrali, i tessuti molli e le irregolarità.
- Contrassegnare l'estremità caudale levigata con un pennarello indelebile per una facile identificazione in seguito.
- Miscelare il cemento osseo PMMA secondo le istruzioni del produttore (vedi Tabella dei materiali).
- Con il cemento osseo in PMMA ancora semi-morbido, posizionarne una quantità minima sull'estremità cranica (non marcata) della vertebra rivolta verso l'alto, assicurandosi che l'intera superficie sia coperta mentre la vertebra si trova in un bagno salino per mantenere il campione osseo idratato e fresco.
- Con il PMMA ancora semimorbido, posizionare la vertebra sulla piastra inferiore con il lato caudale (marcato) rivolto verso il basso (Figura 5).
- Accendere la macchina per innestare gli ingranaggi di trasmissione e abbassare lentamente la piastra superiore sul complesso di cemento osseo vertebre + PMMA fino a quando non si entra in contatto con il cemento osseo e viene applicata una forza minima (<0,5 N) per distribuire uniformemente il PMMA sulla superficie ossea. La piastra superiore in posizione neutra può essere stimata come orizzontale e, quando si preme sul PMMA semi-morbido, farà sì che il PMMA riempia la concavità sull'estremità cranica della vertebra e formi una superficie orizzontale piatta sotto la piastra superiore.
- Con la piastra superiore che preme delicatamente sul cemento osseo in PMMA, lasciare riposare il campione indisturbato fino a quando il cemento osseo in PMMA non si è completamente indurito (~10 minuti secondo le istruzioni del produttore per il cemento osseo in PMMA utilizzato nel presente studio). Conservare il campione in un bagno salino o nebulizzarlo frequentemente con soluzione fisiologica durante questo periodo per mantenere il campione idratato e fresco.
- Una volta che il cemento osseo in PMMA si è completamente indurito, si può iniziare la prova di compressione. Raccogli i dati per il carico (cioè la forza) (N) e lo spostamento (cioè la deflessione) (mm) dai sensori in un foglio di calcolo in tempo reale utilizzando un software digitale progettato per la raccolta dei dati dei test meccanici (vedi Tabella dei materiali).
- Dopo la raccolta dei dati di base per 5 s, applicata a una forza di precarico minima di <0,5 N, iniziare ad abbassare la piastra superiore sul campione a una velocità di abbassamento singola (cioè monotona) predeterminata per avviare la prova di compressione (~1 mm/min).
- Interrompere la raccolta dei dati una volta osservata una forte riduzione del carico (N), che indica un cedimento del materiale.
NOTA: Le istruzioni del produttore specificano il tempo approssimativo di indurimento per il cemento osseo PMMA. Il tempo di indurimento del cemento osseo in PMMA può variare a seconda del tipo di cemento osseo in PMMA utilizzato. Seguire le istruzioni del produttore per determinare il tempo di attesa per l'indurimento del PMMA. Tuttavia, come indicatore che il cemento osseo PMMA si è completamente indurito, è possibile miscelare un ulteriore campione di cemento osseo PMMA contemporaneamente al campione che verrà posizionato sulla vertebra ma tenuto da parte e controllato per vedere se è ancora morbido o completamente indurito. Se completamente indurito, questo può indicare che anche il PMMA sull'osso è completamente indurito senza disturbare il complesso osso + PMMA. Il campione osseo deve rimanere ben idratato e fresco durante i periodi di indurimento e test del PMMA. Bastano pochi minuti di esposizione all'aria secca per modificare le proprietà biomeccaniche. Alcuni ricercatori utilizzano macchine per prove di compressione dotate di un bagno salino19. La macchina per prove di compressione non aveva un bagno salino nel presente studio. Invece, una sottile nebbia di soluzione salina è stata regolarmente applicata durante il periodo di indurimento del PMMA e il periodo di prova.
5. Analisi delle curve carico-spostamento per prove di compressione uniassiale della vertebra L5
- Copia e incolla i dati di carico (N) e di spostamento corretto (mm) dal foglio di calcolo in un software di grafici tecnici e analisi dei dati (vedi Tabella dei materiali).
- Generare un grafico con il carico (N) sull'asse y e lo spostamento corretto del provino (provino Δx, mm) sull'asse x (Figura 6). Fallo nel software facendo prima clic su Windows, Nuova tabella, quindi Fallo per creare una tabella. Copiare i dati di spostamento (mm) e caricamento (N) corretti dal foglio di calcolo dei dati grezzi nella nuova tabella.
- Successivamente, generare una forma d'onda per rappresentare i dati grezzi facendo clic su Dati, quindi fare clic su Coppia XY a forma d'onda e selezionare i dati di spostamento corretti per l'onda X e caricare i dati per l'onda Y. Assicurati che il numero corretto di punti dati sia nella casella "Numero di punti", assegna un nome alla forma d'onda, quindi fai clic su Crea forma d'onda. Una volta creata una forma d'onda, generare un grafico facendo clic su Windows, quindi su Nuovo grafico e posizionare la forma d'onda sull'asse Y e "calcolata" sull'asse X.
- Utilizzare lo strumento cursore per contrassegnare punti/regioni di interesse sul grafico per l'analisi. Alcuni dei punti/regioni di interesse per calcolare le proprietà meccaniche comuni dell'osso intero sono menzionati nei passaggi 5.4-5.8 (Figura 6) e includono il lavoro a rottura (N x mm), il carico massimo (N), la rigidità (N/mm), il carico di snervamento (N) e lo spostamento post-snervamento (mm).
- Per il calcolo del lavoro a rottura (N x mm), posizionare un cursore (A) all'inizio della prova e un cursore (B) nel punto immediatamente prima che il materiale si rompa (cioè al carico massimo raggiunto durante la prova prima che si osservi una forte diminuzione del carico).
NOTA: Pertanto, i cursori A-B metteranno tra parentesi l'intero test dal momento in cui il materiale inizia a resistere alle forze e subisce lo spostamento fino al punto in cui il materiale si rompe. Il work-to-failure (N x mm) può essere misurato come l'area totale sotto la curva (cioè l'area sotto la curva tra i cursori A e B). - Calcolare il carico massimo (N) come il valore più alto per il carico osservato durante la prova (cioè il carico sul cursore B).
- Calcolare la rigidezza (N/mm) del materiale come pendenza della regione elastica lineare (cioè la pendenza tra i cursori C e D).
- Il carico di snervamento (N) è il carico al quale la curva carico-spostamento si discosta dalla linearità ed entra nella regione plastica, sostenendo così una deformità permanente (cioè carico nel punto D). Calcolalo misurando il carico sul cursore D.
- Lo spostamento post-snervamento (mm) è un indicatore della duttilità di un materiale. Misurarlo come lo spostamento tra il punto di snervamento e il punto di rottura del materiale (cioè lo spostamento tra i cursori D e B).
NOTA: I parametri sopra elencati sono solo alcune delle comuni proprietà meccaniche dell'osso intero riportate. Non è un elenco completo di tutte le proprietà meccaniche dell'osso intero che possono essere ottenute da una curva carico-spostamento. Altri parametri delle proprietà meccaniche dell'osso intero includono lo spostamento totale (mm), l'energia elastica assorbita (N x mm), lo spostamento elastico (mm), l'energia plastica assorbita (N x mm) e lo spostamento plastico (mm), solo per citarne alcuni. Inoltre, le proprietà meccaniche ossee a livello tissutale non sono elencate; Questi richiedono trasformazioni di dati utilizzando misurazioni anatomiche specifiche, come il diametro osseo. Il codice di esempio per effettuare le misurazioni dalla curva carico-spostamento nel software è stato elencato nel file supplementare 1.
Representative Results
Con questo protocollo passo-passo che utilizza l'incorporazione della superficie di carico L5 e una macchina di piegatura a tre punti convertibile/macchina per prove di compressione, è possibile eseguire test di compressione sulla vertebra lombare del topo per confronti intergruppo. Un totale di ventiquattro vertebre L5 di topo sono state preparate utilizzando il metodo di inclusione. Tre dei campioni, tuttavia, sono stati danneggiati durante la rimozione dei processi vertebrali utilizzando un disco da taglio diamantato su un utensile rotante e, quindi, non sono stati testati. Alla luce di ciò, le proprietà meccaniche elencate sono state ottenute con successo da ventuno dei ventiquattro campioni utilizzando il metodo di inclusione. I campioni sono stati ispezionati visivamente dopo ogni test e il tappo in PMMA non ha subito danni in nessuno dei test. Come notato, i topi utilizzati nel presente studio facevano parte di uno studio più ampio che mirava a determinare gli effetti dei semi di canapa dietetici sulle ossa di topi femmina C57BL/6 giovani e in crescita. Le statistiche descrittive di cinque proprietà meccaniche dell'osso intero comunemente riportate sono offerte nella Tabella 1. Le curve carico-spostamento per tutti i ventuno campioni sono fornite nella Figura 7.
Figura 1: La conversione di una piegatrice a tre punti in una macchina per prove di compressione. (A) La macchina è completamente attrezzata per funzionare come piegatrice a tre punti con il sensore di spostamento e il sensore di carico indicati (frecce bianche). (B) La macchina dopo che la traversa è stata rimossa. (C) La macchina dopo che una piastra superiore autoallineante è stata posizionata dove in precedenza era posizionata la trave della traversa. (D) Le travi di supporto inferiori con fori praticati in esse. (E) La piastra inferiore in acciaio inossidabile con quattro fori filettati filettati e una vite parzialmente avvitata in uno dei fori. Gli altri due fori che non si vedono nella foto sono sul lato opposto. (F) Le travi di supporto inferiori con la piastra inferiore fissata ad esse da quattro viti esagonali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Un esempio di spostamento del sistema (macchina Δx) rispetto al grafico del carico dotato di una regressione lineare (A), logaritmica (B), polinomio del secondo ordine (C) e polinomio del terzo ordine (D). In questo esempio, il polinomio del terzo ordine fornisce l'adattamento migliore per ogni valore R2 e la relativa regressione viene utilizzata come fattore di correzione dello spostamento del sistema. Le immagini rappresentano dati di esempio per dimostrare l'adattamento della regressione e dovranno essere ottenute dai ricercatori per le singole macchine. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Colonna vertebrale lombare del topo. Una colonna vertebrale lombare di topo sotto un microscopio da dissezione prima che L6 fosse rimossa (A) e dopo che L6 fosse stata rimossa, lasciando L5 attaccato (B). L5 verrà successivamente rimosso e preparato per la prova di compressione. Le bande di colore bianco sono i dischi intervertebrali che sono stati sezionati e rimossi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Anatomia della vertebra L5. Una vertebra L5 di topo rappresentativa nelle viste craniale, caudale, dorsale e ventrale sotto un microscopio da dissezione. Le dimensioni importanti per il corpo vertebrale includono l'altezza, la larghezza dorso-ventrale e la larghezza laterale, come mostrato dalle linee colorate. Le linee tratteggiate nere mostrano approssimativamente dove devono essere effettuati i tagli per rimuovere i processi vertebrali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Periodo di indurimento del cemento osseo PMMA. Un esempio di vertebra L5 con cemento osseo in PMMA (verde) posizionato sulla placca terminale cranica e la piastra superiore abbassata sul complesso cemento osseo in PMMA + osso. Una volta che il cemento osseo PMMA si è completamente indurito, inizierà la prova di compressione. La piastra superiore verrà ulteriormente abbassata fino a quando non si osserva un guasto del materiale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Curva carico-spostamento del test di compressione ossea vertebrale di topo e analisi dei dati. Il cursore A indica l'inizio del test di compressione. Il cursore B contrassegna il punto di rottura del materiale. Il cursore C segna l'inizio della regione elastica lineare, mentre il cursore D segna la fine (cioè il punto di snervamento). L'area ombreggiata in grigio chiaro è la regione elastica lineare, dove il materiale tornerà alla sua forma originale se il carico viene rimosso. L'area ombreggiata in grigio scuro è la regione plastica, dove il materiale ha subito una deformità permanente e non tornerà alla sua forma originale se il carico viene rimosso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Curve carico-spostamento per tutti i ventuno campioni ossei. I modelli variavano tra le ossa. In generale, la maggiore variabilità si è verificata nello spostamento post-cedimento, con alcune (n = 5) ossa che hanno uno spostamento post-rendimento relativamente piccolo e altre (n = 16) che hanno uno spostamento post-rendimento relativamente grande. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Gruppo | Lavoro a guasto (N*mm) | Carico massimo (N) | Rigidità (N/mm) | Carico di snervamento (N) | Spostamento post-snervamento (mm) |
| CON (n = 7) | 13,43 ± 2,44 A,B | 37.93 ± 3.28 | 109.14 ± 11.86 | 22.68 ± 2.04 | 0,34 ± 0,06 |
| 5HS (n = 8) | 12,12 ± 1,23 A | 33,62 ± 2,43 | 99.70 ± 16.62 | 20.88 ± 2.69 | 0,38 ± 0,08 |
| 15HS (n = 6) | 19,55 ± 2,13 B | 41,82 ± 1,85 | 134.58 ± 19.73 | 28.07 ± 3.20 | 0.51 ± 0.07 |
| Gruppi combinati (n = 21) | 14.68 ± 1.27 | 37.40 ± 1.63 | 121.82 ± 9.43 | 23.54 ± 1.60 | 0,40 ± 0,04 |
Tabella 1: Valori rappresentativi delle proprietà meccaniche dell'osso intero comunemente riportate, ottenuti utilizzando il metodo di inclusione della preparazione della superficie di carico. I valori sono stati ottenuti utilizzando tutti i protocolli descritti nel presente studio. Pertanto, i valori rappresentano quelli che possono essere ottenuti utilizzando i metodi qui descritti. I valori sono espressi ± SEM. I gruppi rappresentano topi femmina C57BL/6 alimentati con una dieta arricchita con semi di canapa interi a concentrazioni di 0% (CON), 50 g/kg (5%) (5HS) o 150 g/kg (15%) (15HS) di età compresa tra 5 e 29 settimane. Per uno dei parametri (work-to-failure), sembra che la dieta abbia influenzato i valori per un'ANOVA unidirezionale (p < 0,05). I valori che condividono lo stesso apice della lettera non sono significativamente diversi (p > 0,05), mentre i valori con apici di lettere diverse sono significativamente diversi (p < 0,05), secondo l'analisi post hoc di Tukey-Kramer.
File supplementare 1: Codice di esempio per ottenere le proprietà meccaniche dell'osso intero. Fare clic qui per scaricare il file.
Discussion
L'obiettivo del presente studio è stato quello di descrivere la costruzione di una macchina di piegatura a tre punti/macchina per prove di compressione convertibile, nonché l'uso di un metodo di inclusione di cemento osseo in PMMA per la preparazione di campioni di vertebre lombari di topo prima della prova di compressione uniassiale. Per i campioni ossei sono state ottenute e riportate statistiche descrittive, che saranno utili per il confronto in studi futuri. Nel presente studio sono state analizzate alcune delle proprietà meccaniche dell'osso intero più comunemente riportate. Tuttavia, vale la pena notare che ci sono diverse proprietà meccaniche aggiuntive a livello di osso intero e tessuto che non sono state studiate qui.
Non è chiaro come le proprietà meccaniche ottenute dai campioni preparati con il metodo di inclusione si confrontino con quelle preparate con il metodo di taglio per le vertebre lombari di topo. Schumancher17 ha precedentemente valutato le proprietà meccaniche delle vertebre di ratto preparate utilizzando i due diversi metodi e ha scoperto che le vertebre preparate utilizzando il metodo di inclusione avevano una rigidità significativamente inferiore, uno spostamento di snervamento più elevato e una deformazione di snervamento più elevata rispetto ai campioni preparati con il metodo di taglio. È necessaria un'ulteriore caratterizzazione per capire come le proprietà meccaniche vertebrali dei topi o di altri modelli animali si confrontano quando vengono misurate utilizzando i due diversi metodi di preparazione della superficie di carico. Ci si aspetta che alcuni parametri differiscano tra le vertebre preparate con metodi diversi, dato che il metodo di inclusione aggiunge materiale al campione ma preserva la placca terminale, che è una struttura importante nelle fratture vertebrali in vivo17,27. L'aggiunta di cemento osseo all'estremità cranica aggiunge altezza al campione, mentre il taglio delle piastre terminali rimuove l'altezza, alterando il rapporto d'aspetto e quindi modificando le proprietà meccaniche come la rigidità. Inoltre, sebbene il PMMA sia più rigido dell'osso spongioso vertebrale, è possibile che il PMMA subisca uno spostamento e l'entità di questo spostamento necessita di un'ulteriore caratterizzazione. Inoltre, non è chiaro come i risultati ottenuti dal metodo di inclusione o dal metodo di taglio si confrontino con le previsioni dei parametri ossei utilizzando l'analisi degli elementi finiti per le vertebre del topo o come i risultati varino in condizioni diverse (ad esempio, velocità di abbassamento, diversi livelli vertebrali, composizioni di PMMA). Tuttavia, poiché tutti i campioni sono preparati in modo simile, questo metodo è appropriato e consente un mezzo semplice ed economico per effettuare confronti tra gruppi di trattamento in un unico studio in cui i campioni vengono preparati e testati in condizioni simili.
Per quanto riguarda la preparazione del campione prima della prova di compressione, è essenziale preparare i campioni in modo riproducibile. Una possibile limitazione del metodo descritto nel presente studio è l'uso di uno strumento rotante per rimuovere i processi vertebrali. Un altro metodo per rimuovere i processi vertebrali delle vertebre lombari di topo è stato descritto da Pendleton et al.19, che può consentire una preparazione del campione più coerente. Inoltre, possono derivare incongruenze dall'applicazione del cemento osseo PMMA. Pertanto, è importante applicare il cemento osseo in modo coerente in termini di volume, posizionamento e tempo di indurimento. Tuttavia, il metodo di inclusione può fornire un mezzo più semplice per ottenere una preparazione coerente del campione rispetto al metodo di taglio, poiché può essere difficile ottenere tagli perfettamente uniformi e paralleli in modo coerente tra tutti i campioni a causa delle loro piccole dimensioni e fragilità. Saranno necessari studi futuri per valutare la precisione dei risultati ottenuti da campioni preparati utilizzando l'embedding vs. metodo di taglio.
Come accennato, sono necessarie ulteriori caratterizzazioni e indagini sul metodo di inclusione per la preparazione dei campioni delle vertebre lombari di topo prima della prova di compressione uniassiale. Ciononostante, questo studio dimostra che tale metodo può essere impiegato, fornisce una descrizione dettagliata del metodo proposto e offre statistiche descrittive dei parametri misurati da campioni preparati utilizzando il metodo. Questo protocollo è prezioso per il settore a causa dell'attuale mancanza di metodologia disponibile. Inoltre, questo metodo può imitare meglio il meccanismo con cui si verificano le fratture vertebrali in vivo rispetto ad altri metodi17,27. Il metodo ha anche il vantaggio di superare le difficoltà tecniche associate ad altri metodi attualmente riportati, rendendo i test di compressione uniassiale più fattibili nella ricerca ossea. Ciò è particolarmente significativo perché farmaci, diete o altri interventi possono influenzare in modo diverso le ossa ricche di corticali (ad esempio, le ossa lunghe della diafisi mediana) e le ossa ricche di trabecolo (ad esempio, i corpi vertebrali), ma la flessione a tre punti è il metodo predominante per valutare le proprietà meccaniche delle ossa13. La combinazione di prove di flessione a tre punti e di compressione uniassiale può diventare ancora più facilmente realizzabile attraverso l'uso di una macchina di prova di flessione/compressione a tre punti convertibile. Pertanto, il presente studio propone due possibili mezzi per rendere più disponibile ai ricercatori la valutazione sia dell'osso ricco di corticali che di quello ricco di trabecolare nello stesso studio, portando potenzialmente a una migliore comprensione di come un determinato trattamento influisce su diversi tipi di osso tra i gruppi sperimentali.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Siamo grati per gli sforzi significativi che il Dipartimento di Ingegneria della Colorado State University-Pueblo ha fornito nella costruzione della piegatrice a tre punti e della sua modifica in una macchina convertibile per prove di piegatura/compressione a tre punti. Siamo particolarmente grati al signor Paul Wallace, coordinatore dell'officina meccanica, per i suoi sforzi nella pianificazione e nell'esecuzione della costruzione e della modifica della macchina. Anche l'esperienza e il feedback del Dr. Bahaa Ansaf (Colorado State University-Pueblo, Dipartimento di Ingegneria) e della Dott.ssa Franziska Sandmeier (Colorado State University-Pueblo, Dipartimento di Biologia) hanno contribuito in modo significativo a questo progetto. L'Institute of Cannabis Research Grant della Colorado State University-Pueblo ha finanziato il progetto più ampio di cui faceva parte questo esperimento e ha permesso l'acquisto dei topi, dei reagenti e di alcune delle attrezzature utilizzate.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120-Grit Sand Paper | N/A | N/A | For removal of caudal end plate soft tissues and irregularities |
| 24-bit Load Cell Interface | LoadStar Sensors, Freemont, California, USA | DQ-1000 | To connect load and displacement sensors to personal coputer |
| Base Mouse Diet | Dyets, Inc, Bethlehem, PA, USA | AIN-93G | Diet the mice were fed, without added hempseed |
| Diamond Cutoff Wheel w/ Rotary Tool | Dremel US, Mt. Prospect, Illinois, USA | F0130200AK | To remove vertebral proccesses |
| Displacement Sensor | Mitutoyo, Aurora, Illinois, USA | ID-S112EX | Displacement sensor with 0.001 mm resolution and 0.00305 mm accuracy |
| External Variable Voltage Power Source | Extech Instruments, Nashua, New Hampshire, USA | 382213 | To provide power to compression testing machine |
| Female C57BL/6 Mice | Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts, USA | 027 (Strain Code) | Mouse model used in present study |
| Hempseed | Natera, Pitt Meadows, Canada | 670834012199 | Hempseed added to Base Mouse Diet |
| Igor Pro Software (Version 8.04) | Wave Metrics, Portland, Oregon, USA | N/A | Sofware used for load-displacement curve analysis |
| iLoad Mini Force Sensor | LoadStar Sensors, Freemont, California, USA | MFM-010-050-S | Load (force) sensor with 1.0% accuracy |
| Isotonic (0.9%) Saline Solution | N/A | N/A | To keep bone sampels hydrated |
| Leica EZ4 W Miscoscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | NC1601884 | For bone dissections and vertebral process removal |
| Microsoft Excel Software | Microsoft Corporation, Redmond, Washington, USA | N/A | For data transfer from SensorVue software |
| PALACOS R Bone Cement | Hareus Medical, Wehreim, Germany | 00-1112-140-01 | PMMA bone cement for embedding of the loading surface |
| Personal Computer | N/A | N/A | For data recording (see 24-bit Load Cell Interface, SensorVue Software, Microsoft Excel Software) and analysis (see Igor Pro Software) |
| SensorVue Software | LoadStar Sensors, Freemont, California, USA | N/A | Software used for real-time data collection during compression testing |
| Small Animal Dissecting Kit | N/A | N/A | Dissecting scissors, forceps, scalpel, blades, pins, gauze pads |
| Stainless Steel Top Platen (Self-Alligning) and Bottom Platen Pair | N/A | N/A | Constructed by Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering |
| Three-Point Bending Machine | N/A | N/A | Constructed by Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering. Refer to Sarper et al. (2014) for further details regarding construction |
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