Summary
このプロトコルでは、マウス腰椎の単軸圧縮試験をより達成可能にするために、2つのアプローチが説明されています。まず、三点曲げ機から圧縮試験機への改造について説明する。第2に、骨セメントを用いた荷重面を作製するための包埋方法をマウス腰椎に適合させた。
Abstract
皮質骨と海綿骨は、加齢に伴う骨量減少に対する薬物療法、ホルモン療法、およびその他の治療法の調節と反応において異なるという認識が高まっています。3点曲げは、皮質骨が豊富な長骨の中間骨幹領域に対する治療の影響を評価するために使用される一般的な方法です。マウス椎骨の一軸圧迫試験は、海綿骨に富む骨を評価することができますが、技術的な課題のためにあまり一般的には行われていません。さらに一般的には行われていないのは、3点曲げ試験と圧縮試験の組み合わせで、治療が長骨の中間骨幹領域と椎体中心に類似または異なる影響を与える可能性があるかどうかを判断することです。ここでは、マウス腰椎の圧縮試験を3点曲げと並行して行う難易度の低い方法として、3点曲げ機を圧縮試験機に改造する手順と、マウス腰椎荷重面を準備する埋め込み方法の2つの手順について説明します。
Introduction
加齢に伴う骨の変化は、これらの変化に伴う骨折のリスクが高まるため、問題があると広く認識されています。ヒトの骨折は、慢性疼痛、運動能力の低下、長期的な障害、死亡リスクの増加、経済的負担につながる可能性があります1。加齢に伴う骨の変化の症状に対処するために調査された一般的な治療法には、栄養補助食品、ホルモン治療、および薬物が含まれます2,3,4,5,6,7,8,9。ヒト被験者に対するそのような治療の初期研究は、ヒト骨格に見出される2つの主要なタイプの骨を有する小動物モデル(例えば、実験用ラットおよびマウス)を用いて一般的に行われる10。上腕骨、大腿骨、脛骨などの付属肢長骨は皮質(緻密骨)に富んでいるのに対し、椎骨には海綿骨(編み骨、海綿骨、海綿骨、海綿骨)が豊富です4。骨調節とシグナル伝達経路のメカニズムは、皮質骨(例:長骨中骨幹)と海綿骨(例:椎体中心)で異なるという知識が増えています2。このため、治療法は、同じ骨内で骨特異的または部位特異的な異なる効果をもたらす可能性があります2,3,4。
オブジェクト(ボーンなど)に力を加えると、オブジェクトの境界条件に応じて、オブジェクトが加速、変形、またはその両方を受けます。ボーンが拘束されると、同じ大きさの反対の力がボーンの加速に抵抗し、変形が発生します。骨が変形すると、応力と呼ばれる内部抵抗が発生し、その2つの基本的なタイプがあります:引張または圧縮の形での垂直抗力とせん断力10。多くの場合、加えられる力システム10に応じて、基本的なタイプの応力の組み合わせが生成される。材料の強度は、故障することなくストレスに耐える能力です。材料に加えられる力がますます大きくなると、最終的には永久変形を起こし、その時点で弾性状態(つまり、力が取り除かれると元の形状に戻る)から塑性状態(つまり、力が取り除かれても元の形状に戻らない)に移行したと言われます11。弾性状態から塑性状態への遷移が発生する点は、降伏点と呼ばれます。降伏点を超えてさらに大きな力が材料に加えられると、完全な破壊が発生するまで、微小破壊(つまり損傷)がますます持続します。この時点で、材料は11,12に失敗したと言われています。骨の骨折は、構造レベルと組織レベル10の両方での失敗を表します。例えば、椎骨の破損は、複数の小柱が構造レベルで機能しなくなるだけでなく、個々の小柱のコラーゲンやハイドロキシアパタイト結晶などの細胞外マトリックス要素が組織レベルで機能しなくなるために起こります。
材料の破損につながる機械的事象は、さまざまな試験方法を使用して測定できます。3点曲げは、付属肢骨格からの長骨の機械的特性をテストするための一般的な方法です。この方法はシンプルで再現性があり、多くの研究者に好まれる生体力学的試験の方法となっています13。この方法は、2つの下部支持ビームに載っている長骨の骨幹の中間にクロスヘッドビームを下降させることにより、密に組織化された皮質骨である中骨幹領域の機械的特性を特異的に試験します。荷重-変位曲線から、弾性、靭性、破壊力、骨材料の弾性から塑性への挙動への遷移に対する引張力の影響などを決定できます。
海綿骨、海綿骨、織物骨、海綿骨と呼ばれる2番目のタイプの骨では、骨要素は小柱と呼ばれる棒と梁の配列に形成され、「海綿状」の外観を与えます。主要な椎体(すなわち、中心)は海綿骨に富んでおり、ヒトの加齢に伴う圧迫骨折の部位であることがよくあります14。腰椎(腰椎)は最大の椎骨であり、体重のほとんどを支え、椎体骨折の最も一般的な部位です15,16。椎体の機械的特性は、軸方向の圧縮がin vivoで脊柱に課せられる垂直力の負荷であるため、一軸圧縮試験法を使用して直接評価するのが最適です17。in vivoでの椎体の圧迫は、筋肉と靭帯の収縮、重力、および地面反力の結果として発生します18。
小動物の椎骨のEx vivo圧迫試験は、サイズが小さく、形状が不規則で、壊れやすいため、困難な場合があります。椎体の形状は、軽度の腹側傾斜とわずかな頭蓋凹みを有する平行四辺形として推定することができる17。この形状は、荷重面に十分な準備を行わないと、圧縮力が荷重面の一部にのみ適用され、「局所接触」が発生するため、ex vivoで一軸圧縮試験を達成する上で課題となります17,19。これにより、一貫性のない結果や早期の故障が発生する可能性があります19.これは、荷重面が椎骨関節の椎間板で囲まれているため、in vivoには当てはまりません。椎間板 - 頭蓋端板複合体は、椎体全体に力を加えることおよび椎体への骨折の生体力学において重要な役割を果たす14,20。圧縮試験は生物学の分野では新しいものではありませんが、骨の機械的試験の現在の方法には限界があります。これらの制限には、骨力学の予測モデルとシミュレーションの欠如、独自の幾何学的空間構造、さらには固有のサンプルベースの生物学的変異が含まれます21。さらに重要なことに、この分野は、方法間の標準化の欠如と、文献で報告された方法の全体的な欠如によって課題となっています22。
一軸圧縮試験を達成するためのげっ歯類の腰椎の調製については、切断法と包埋法の2つの方法が報告されています17,19,23,24,25,26。切断方法は、椎体から椎骨突起、頭蓋端板、尾側端板を切断する必要があります。Pendletonら19は、マウスの腰椎にこの方法を使用するための詳細な方法を以前に報告しています。この方法では、サンプルへの損傷を回避しながら、尾側と頭蓋側の両方のエンドプレートで完全に平行なカットを実現するという課題があります。また、頭蓋端板が取り除かれるという制限もあります。頭蓋端板は皮質骨の密な殻を含み、in vivoで椎間板からの荷重を分散させる上で重要な役割を果たし、in vivo骨折の骨の失敗に関与しています17,20,27。対照的に、包埋法は、椎体の頭蓋端板をそのまま維持しながら、椎骨突起を除去することを含みます。次に、少量の骨セメントを椎体の頭蓋端に配置することにより、荷重面をほぼ水平にします。この方法は、切断方法に関連する技術的課題を克服し、頭蓋端板の保存により、in vivoでの荷重適用および骨不全のメカニズムをよりよく模倣する可能性があるという利点を有する。このアプローチは、ラットの骨の一軸圧縮試験を含む研究で以前に文書化されています。しかし、私たちが知る限り、それは以前により小さなマウス腰椎の文脈で文書化されていません17,25,26。問題の方法は、以前にChachraらによって詳細に説明されており25、当初は、それぞれに円筒形の空洞を持つ2つのプレートの間に保持された骨標本を使用し、ポリメチルメタクリレート(PMMA)で満たされました。同じ研究グループは後に、一方の端を穏やかに研磨し(尾側)、もう一方の端に骨セメントの小さな斑点を添加する(頭蓋)方法を改良しました26。この方法は、プラテン間の材料を最小限に抑えるため、以前の方法を改善したもので、この記事の焦点です。一軸椎圧迫試験に関連する課題にもかかわらず、これは、特に3点曲げと組み合わせた場合に、提案された治療法が骨に及ぼす影響に関する貴重な情報を提供する可能性のある方法です。
ここでは、1台の機械で長骨と椎体の両方の試験を簡単に行うことができるコンバーチブル3点曲げ/圧縮試験機の使用を紹介します。さらに、マウス腰椎の一軸圧迫試験を実現するための包埋法の使用が提示されます。本研究は、成長期の若い雌のC57BL/6マウスの骨格骨の特性に対する食物麻実補給の影響を調査することを目的とした大規模な研究の一部として実施されました5,6。この3点曲げ試験機は、もともとコロラド州立大学プエブロ校の工学部の教員と学生によって作成され、私たちの研究グループが長骨の3点曲げ試験に使用しました[ラット大腿骨と脛骨7、マウス上腕骨、大腿骨、脛骨5,6,8,9].しかし、マウスの椎体圧迫試験に使用するためのその変更と応用は検討されていませんでした。3点曲げ機の設計及び施工については、前述した7。このレポートでは、圧縮試験用に機械を改造し、システム変位を補正するために使用される方法に焦点を当てます。次に、マウスの椎体荷重面調製のための埋め込み法と、一軸圧縮試験の方法、および荷重-変位データの解析について説明します。
Protocol
すべての実験とプロトコルは、米国国立衛生研究所の実験動物のケアと使用に関するガイドに準拠して実施され、コロラド州立大学プエブロ機関動物管理および使用委員会(プロトコル番号:000-000A-021)から承認を受けました。動物の飼育に関する詳細な手順については、すでに説明しました5,6。このマウスは、成長期の若い雌のC57BL/6マウスに対するヘンプシード補給食の効果を調査することを目的とした広範な研究の一環として、生後3週間で得られた(資料表参照)。5週齢から29週齢まで、マウスは3つの食事のいずれかで飼育されました:コントロール(0%ヘンプシード)、50 g / kg(5%)ヘンプシード、または150 g / kg(15%)ヘンプシード、グループあたり8匹のマウス5,6。研究全体を通して、マウスはそれぞれの餌と水に自由にアクセスでき、ポリカーボネートケージにペアで収容され、12時間の明:12時間の暗サイクル(06:00から18:00までライトが点灯)に維持されました。マウスの体重と健康状態は毎週評価され、すべてのマウスは有害な健康状態を発症することなく研究を無事に完了しました。29週齢で、マウスはイソフルランガスを使用して深く麻酔され、子宮頸部脱臼によって安楽死させられました5,6。胸骨から尾部までの腹面を正中線切開し、胸腔内臓器、腹膜臓器、後腹膜臓器をすべて死骸から取り除いた。内臓を摘出された死骸は、約1年後に行われた椎骨検査のための骨解剖時まで、-70°Cの0.9%塩化ナトリウム溶液中に保存されました。
1. 三点曲げ機から圧縮試験機への転換
- 3点曲げ機7 の荷重センサーに取り付けられているクロスヘッドビームを緩めます( 材料表を参照)(図1A、B)。
- クロスヘッドビームと同じねじ切りで、自動調心トッププラテンを荷重センサー( 材料表を参照)にねじ込みます(図1C)。
- 下部の支持体のそれぞれに2つの水平穴を開け、下部のプラテンを後で取り付けます(図1D)。
- ステンレス鋼の底板の両側にねじ山をタップして、下部サポートにドリルで開けた穴に合わせます(図1E)。
- ネジ付きの六角ネジを使用して下部プラテンを2つの下部サポートに固定し、固定されるまで締めます(図1F)。
注意: 六角ネジには、下部サポートおよび上部/下部プラテンのタップ穴と一致するねじ山が必要です。自動調心トッププラテンの使用は、トッププラテンと荷重面との間の均一な接触を達成するのに役立つかもしれないが、椎体の頭蓋端の凹みを考えると十分ではない。さらに、ローディング表面処理法を用いた調製が必要です。多くの工業材料やエンジニアリング材料よりも小さくて弱い小動物の骨の圧縮試験機を構築する場合、荷重センサの耐荷重と荷重フレームのサイズを考慮することが不可欠です。さらに、正確な結果と円滑な操作を確保するために、機械を定期的に洗浄および注油する必要があります。
2. 圧縮試験機の変位補正
- トッププラテンとボトムプラテンの間に試験材料がない状態で、軽い接触(~0.3-0.5 Nの予圧)が行われるまで、トッププラテンをボトムプラテンに下げます。
- 一定の下降速度(~1 mm/分)で機械の電源を入れ、圧縮試験を開始します。機械的試験のデータ収集のために、デジタルデータ収集ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して荷重(N)と変位(mm)の測定値を収集します。
注:上部と下部のプラテンの間に材料がないため、観察されるすべての変位は、機械のみ(Δxマシン)(フレーム、ロードセル、プラテン、カップリングなど)の変位によるものです。 - すべての骨サンプルから得られる力よりも高い力に達するまで、一定の(つまり、単調な)速度で上部プラテンを下部プラテンに下げ続けます。
- 手順 2.1 から 2.3 を合計 3 回繰り返します。
- システム変位(Δxマシン、mm) 対のデータをプロットします。適用荷重(力、N)。
- データに最も適合する回帰直線を当てはめます(図2A-D)。
- 骨圧迫試験のデータを含むスプレッドシートで、回帰分析によって提供される式を使用して、マウス腰椎圧迫試験のデータポイントの記録された変位(記録された合計Δx)に影響を与える機械変位の量(Δxマシン)を決定します。
注: たとえば、18 N の力が加えられ、2.730 mm の変位が記録されたデータ点(合計 Δxが記録された)があるとします。例の3次多項式回帰式(図2D)[Δxマシン=(4 × 10-7 x 適用荷重3)-(8 × 10-5 x適用荷重2)+(0.0044 x適用荷重)]によると、記録された変位の0.056 mmは機械の変位(Δxマシン)によるものです。
記録されたΔx合計=Δxマシン+Δx試験片 - データ点の記録された変位を修正します。
注: たとえば、上記の例について考えてみます。2.730 mmの変位が記録され(Δx合計記録)、機械変位 (Δxマシン)が合計の0.056 mmを占める場合、対象の試験片(つまり、骨)が受けた変位(Δx試験片)は2.664 mmです。 したがって、2.664 mmは椎骨が受けた実際の変位(Δx試験片)であり、荷重-変位曲線解析に使用される値です。
Δx試料 = 記録されたΔx合計 - Δxマシン - すべての標本(骨)について収集されたすべてのデータポイントについて、手順2.7〜2.8を繰り返します。
注:圧縮試験中に観察される変位は試験片の変位だけでなく、観察された変位は機械の変位(Δxマシン)(フレーム、ロードセル、プラテン、カップリングなどの圧縮/変位など)と試験片(Δx試験片)の組み合わせであるため、このステップは重要です).したがって、小動物(マウスなど)の変位が比較的小さい標本では、システム変位(Δxマシン)が大きな誤差を引き起こす可能性があります。ここで説明したシステムの変位を補正する手順は、Kalidindi と Abusafieh28 によって以前に報告されており、ここで説明した方法に加えて、他の 2 つの方法も詳しく説明しています。何人かの研究者は、システムの変位を決定するために複数の方法を使用することが指摘されています17。各機械は、荷重が加えられたときに、システム変位の独自のパターンと程度を示す場合があります。このため、システム変位補正係数は機械ごとに決定する必要があり、2台の機械間で同じになることはありません。椎骨の圧縮試験とは対照的に、上盤と下盤の間に材料がないため、システム変位を測定する場合、大きな力の減少は観察されません。
3. マウス死骸からの第5腰椎 (L5)の解剖
- 冷凍マウスの死骸を室温で解凍し、0.9%NaClの等張溶液を定期的に塗布して軟部組織と骨の水分補給に注意します。
- 尾の付け根近くの背側正中線の皮膚に小さな(<0.5 cm)の切開を行い、切り口を各後肢に広げ、ゆっくりと引っ張って尾の付け根から動物の頭まで毛皮を取り除きます。
- 脊柱が見やすいまで腹壁の筋肉組織を切り取ります。
- 解剖顕微鏡で、2つの仙腸関節と仙骨の頭蓋端を視覚化します。
- カミソリの刃またはメスを使用して、最後の腰椎(L6)を仙骨の頭蓋端から分離するために細かい切り込みを入れます。
- 再び、椎間腔の間を切断し、L6とL5を脊柱から取り出し、L5を分析用に取っておきます(図3)。
- 解剖顕微鏡で椎骨を検査し、椎間板を含むすべての軟部組織を骨から除去し、主にガーゼパッドを使用し、必要に応じて鉗子で優しく使用します。
注:本研究では、L5が関心のある椎骨として選択されましたが、他の腰椎を圧迫試験用に選択することができます。
4. PMMA骨セメント包埋法を用いた一軸圧縮試験のためのL5椎骨荷重面の準備
- 回転工具に取り付けられたダイヤモンドカットオフホイール( 材料表を参照)を使用して、各椎弓根に切り込みを入れ、横方向および棘状の突起を取り除きます(図4)。椎体に取り付けたままにしておくと、椎体突起は、中心全体に荷重が分散されるのではなく、突起自体の上部/下部プラテンとの局所的な接触を引き起こす可能性があります。
- 120グリットの細かいサンドペーパー( 資料表を参照)を使用して椎骨の尾端をやさしく研磨し、椎間板、軟部組織、および凹凸をすべて取り除きます。
- サンディングされた尾端に油性ペンで印を付けて、後で簡単に識別できるようにします。
- 製造元の指示に従ってPMMA骨セメントを混合します( 材料表を参照)。
- PMMA骨セメントがまだ半軟らかい状態で、椎骨の頭蓋(マークのない)端に最小限の量を上に向けて置き、椎骨が生理食塩水浴に座っている間、表面全体が覆われるようにして、骨サンプルを水分補給して冷却します。
- PMMAがまだ半軟らかい状態で、尾側(マーク付き)を下に向けて椎骨を底板に配置します(図5)。
- 機械の電源を入れてドライブギアを噛み合わせ、骨セメントと接触し、最小限の力(<0.5 N)が加えられてPMMAが骨表面に均等に分布するまで、トッププラテンを椎骨+ PMMA骨セメント複合体にゆっくりと下げます。中立位置にあるトッププラテンは水平と推定でき、セミソフトPMMAを押すと、PMMAが椎骨の頭蓋端のくぼみを埋め、トッププラテンの下に平らな水平面を形成します。
- 上部プラテンがPMMA骨セメントを静かに押し下げた状態で、PMMA骨セメントが完全に硬化するまでサンプルをそのままにします(本研究で使用したPMMA骨セメントの製造元の指示に従って~10分)。この期間中は、サンプルを生理食塩水浴に浸すか、生理食塩水で頻繁にミストして、サンプルを水分補給して冷却します。
- PMMA骨セメントが完全に硬化したら、圧縮試験を開始できます。機械的試験のデータ収集用に設計されたデジタルソフトウェアを使用して、センサーからの荷重(力)(N)と変位(たわみ)(mm)のデータをリアルタイムでスプレッドシートに収集します( 材料表を参照)。
- <0.5 Nの最小予圧で5秒間ベースラインデータを収集した後、圧縮試験を開始するために、圧縮試験を開始するために、事前に決定された下降速度(~1 mm/min)で、トッププラテンをサンプルに下降させます。
- 荷重(N)の大幅な減少が観察され、材料の破損が示されたら、データの収集を停止します。
注意: メーカーの指示には、PMMA骨セメントのおおよその硬化時間が指定されています。PMMA骨セメントの硬化時間は、使用するPMMA骨セメントの種類によって異なる場合があります。製造元の指示に従って、PMMA硬化の待機時間を決定します。ただし、PMMA骨セメントが完全に硬化したことを示す指標として、PMMA骨セメントの追加サンプルを、椎骨に置きますが、脇に置いておき、まだ柔らかいか完全に硬化しているかを確認するサンプルと同時に混合することができます。完全に硬化している場合、これは、骨+ PMMA複合体を妨げることなく、骨上のPMMAも完全に硬化していることを示している可能性があります。骨サンプルは、PMMAの硬化および試験期間中、十分に水分を補給し、冷却する必要があります。乾燥した空気に数分さらされるだけで、生体力学的特性が変化する可能性があります。一部の研究者は、生理食塩水浴19を備えた圧縮試験機を使用しています。圧縮試験機は、本研究では生理食塩水浴を備えていなかった。代わりに、生理食塩水の細かい霧がPMMA硬化期間とテスト期間を通じて定期的に適用されました。
5. L5椎骨一軸圧縮試験における荷重-変位曲線の解析
- 荷重(N)と補正変位(mm)のデータをスプレッドシートからコピーして、技術的なグラフ作成およびデータ解析ソフトウェアに貼り付けます( 材料表を参照)。
- 荷重(N)をy軸、補正試験片変位(Δx試験片、mm)をx軸にグラフを生成します(図6)。ソフトウェアでこれを行うには、最初に Windows、 新しいテーブル、次に [実行 ]をクリックしてテーブルを作成します。補正された変位(mm)と荷重(N)のデータを生データスプレッドシートから新しいテーブルにコピーします。
- 次に、 データをクリックして生データを表す波形を生成し、 次にXY波形ペア をクリックして、X-Waveの補正変位データとY-Waveのロードデータを選択します。「Number of Points」ボックスに正しいデータポイント数があることを確認し、波形に名前を付けて、「 Make Waveform」をクリックします。波形を作成したら、 Windows→ New Graphをクリックしてグラフを生成し、Y軸に波形を配置し、X軸に「計算」を配置します。
- カーソルツールを使用して、分析するグラフ上のポイント/関心領域をマークします。ステップ5.4-5.8(図6)では、一般的な全骨の機械的特性を計算するためのいくつかのポイント/領域について述べており、 破壊までの作業 (N x mm)、 最大荷重 (N)、 剛性 (N/mm)、 降伏荷重 (N)、降伏 後変位 (mm)が含まれます。
- 故障までの作業量(N x mm)を計算するには、カーソル(A)を試験の開始点に置き、カーソル(B)を材料が破損する直前のポイント(つまり、荷重の大幅な減少が観察される前に試験中に到達した最大荷重)に置きます。
注:したがって、カーソルA-Bは、材料が力に耐え始め、変位を起こしてから材料が破損するポイントまでのテスト全体を括弧で囲みます。 故障までの作業 量(N x mm)は、曲線の下の総面積(つまり、カーソルAとBの間の曲線の下の面積)として測定できます。 - 最大荷重(N)は、テスト中に観察された荷重(つまり、カーソルBでの荷重)の最高値として計算します。
- 材料の 剛性( N/mm)を線形弾性領域の傾き(つまり、カーソルCとDの間の傾き)として計算します。
- 降伏荷重(N)は、荷重-変位曲線が線形性から逸脱して塑性領域に入り、永久変形(点Dでの荷重)を維持する荷重です。これは、カーソル D での負荷を測定することによって計算します。
- 降伏後の変位(mm)は、材料の延性の指標です。これを降伏点と材料破壊点の間の変位(つまり、カーソルDとBの間の変位)として測定します。
注:上記のパラメータは、報告されている一般的な全骨の機械的特性の一部にすぎません。これは、荷重-変位曲線から取得できるすべての骨全体の機械的特性の完全なリストではありません。その他の骨全体の機械的特性パラメータには、総変位(mm)、吸収弾性エネルギー(N x mm)、弾性変位(mm)、吸収される塑性エネルギー(N x mm)、および塑性変位(mm)が含まれます。さらに、組織レベルの骨の機械的特性は記載されていません。これらには、骨の直径などの特定の解剖学的測定値を使用したデータ変換が必要です。ソフトウェアで荷重-変位曲線から測定を行うコード例は、 補足ファイル1にリストされています。
Representative Results
L5荷重面の埋め込みとコンバーチブル3点曲げ機/圧縮試験機を用いたステップバイステップのプロトコルにより、マウス腰椎の圧迫試験を行い、グループ間比較を行うことが可能です。合計24個のマウスL5椎骨を包埋法を用いて作製した。しかし、サンプルのうち3つは、回転工具のダイヤモンドカットオフホイールを使用して椎骨突起を除去する際に損傷したため、テストは行われませんでした。このことから、24個のサンプルのうち21個を包埋法で得ることに成功しました。試験片は各試験後に目視検査され、PMMAキャップはいずれの試験でも損傷を受けませんでした。前述のように、本研究で使用したマウスは、若く成長中のC57BL/6雌マウスの骨に対する食餌性ヘンプシードの効果を決定することを目的とした大規模な研究の一部でした。一般的に報告されている5つの全骨機械的特性の記述統計を 表1に示します。21個のサンプルすべての荷重-変位曲線を 図 7に示します。
図1:3点曲げ機から圧縮試験機への改造。 (A)変位センサと荷重センサ(白矢印)が表示されている3点曲げ機として動作する設備が整った機械。(B)クロスヘッドビームを取り外した後の機械。(C)クロスヘッドビームが以前に配置された場所に自動調心トッププラテンが配置された後の機械。(D)穴が開けられた下部支持梁。(E)4つのネジ穴がタップで固定されたステンレス製の底板と、穴の1つにネジが部分的にねじ込まれています。写真に写っていない他の2つの穴は反対側にあります。(F)下部のプラテンが4本の六角ネジで取り付けられた下部支持ビーム。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:線形(A)、対数(B)、2次多項式(C)、および3次多項式(D)回帰を当てはめたシステム変位(Δxマシン) 対荷重プロットの例。 この例では、3 次多項式が R2 値ごとに最適に適合し、その回帰がシステムの変位補正係数として使用されます。画像は回帰フィッティングを示すためのサンプルデータを表しており、研究者は個々のマシンについて取得する必要があります。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:マウスの腰椎柱。 L6を切除する前(A)とL6を切除した後、L5を付着させたままのマウスの腰椎柱を解剖顕微鏡で観察した。その後、L5は除去され、圧縮試験の準備が整います。白い帯は、解剖して除去された椎間板です。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:L5椎骨の解剖学。 解剖顕微鏡下での頭蓋、尾、背、腹面の代表的なマウスL5椎骨。椎体の重要な寸法には、色付きの線で示されているように、高さ、背腹幅、および横方向の幅が含まれます。黒い破線は、椎骨突起を除去するためにカットが行われるおおよその場所を示しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:PMMA骨セメントの硬化期間。 頭蓋端板にPMMA骨セメント(緑色)を置き、PMMA骨セメント+骨複合体に下げた上部プラテンを含むL5椎骨の例。PMMA骨セメントが完全に硬化すると、圧縮試験が始まります。トッププラテンは、材料の破損が観察されるまでさらに下げられます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:マウスの椎骨圧迫試験荷重-変位曲線とデータ解析。 カーソル A は、圧縮テストの開始をマークします。カーソル B は、材料破損点をマークします。カーソル C は線形弾性領域の開始をマークし、カーソル D は終了(降伏点)をマークします。薄い灰色で網掛けされた領域は線形弾性領域で、荷重が取り除かれると材料は元の形状に戻ります。濃い灰色の網掛けされた領域は、材料が永久に変形し、荷重が取り除かれても元の形状に戻らない塑性領域です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図7:21個の骨サンプルすべての荷重-変位曲線。 パターンは骨によって異なっていた。一般に、最大の変動は降伏後の変位にあり、いくつかの骨(n = 5)は 降伏後の変位 が比較的小さく、他の骨(n = 16)は 降伏後の変位が比較的大きい。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 群 | 故障までの作業 (N*mm) | 最大荷重 (N) | 剛性 (N/mm) | 降伏荷重 (N) | 降伏後変位 (mm) |
| CON (n = 7) | 13.43 ± 2.44 A、B | 37.93 ± 3.28 | 109.14 ± 11.86 | 22.68 ± 2.04 | 0.34 ± 0.06 |
| 5HS (n = 8) | 12.12 ± 1.23 A | 33.62 ± 2.43 | 99.70±16.62 | 20.88 ± 2.69 | 0.38 ± 0.08 |
| 15HS (n = 6) | 19.55 ± 2.13 B | 41.82 ± 1.85 | 134.58 ± 19.73 | 28.07 ± 3.20 | 0.51 ± 0.07 |
| 結合グループ (n = 21) | 14.68 ± 1.27 | 37.40 ± 1.63 | 121.82 ± 9.43 | 23.54 ± 1.60 | 0.40±0.04 |
表1:一般的に報告されている全骨の機械的特性の代表値 ローディング表面処理埋め込み法を使用して得られた。 値は、本研究で詳述されているすべてのプロトコルを使用して取得されました。したがって、値は、ここで説明する方法を使用して取得できる値を表します。値は平均±SEMです。 グループは、5週齢から29週齢まで、0%(CON)、50 g/kg(5%)(5HS)、または150 g/kg(15%)(15HS)の濃度でヘンプシード全体を豊富に含む食事を与えられたC57BL/6雌マウスを表しています。パラメータの1つ(故障までの作業量)では、食事が一元配置分散分析(p < 0.05)あたりの値に影響を与えたようです。Tukey-Kramer事後分析によると、同じ文字の上付き文字を共有する値は有意差>ありませんが(p 0.05)、異なる文字の上付き文字を持つ値は有意に異なります(p < 0.05)。
補足ファイル1:骨全体の機械的特性を得るためのサンプルコード。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
本研究の目的は、コンバーチブル3点曲げ機/圧縮試験機の構築、および一軸圧縮試験前のマウス腰椎サンプルの調製のためのPMMA骨セメント包埋法の使用を説明することでした。骨サンプルの記述統計が得られ、報告されており、今後の研究での比較に役立ちます。本研究では、最も一般的に報告されている全骨の機械的特性のいくつかが分析されました。ただし、ここで調査されなかった骨全体および組織レベルの機械的特性がいくつか追加されていることは注目に値します。
包埋法を用いて作製した試料から得られた機械的特性が、マウス腰椎の切断法を用いて作製された試料とどのように比較されるかは不明のままである。Schumancher17は、以前に2つの異なる方法を使用して調製されたラット椎骨の機械的特性を評価し、包埋法を使用して調製された椎骨は、切断法を使用して調製されたサンプルよりも有意に低い剛性、高い降伏変位、および高い降伏ひずみを有することを発見しました。マウスや他の動物モデルの脊椎の機械的特性を、2つの異なる負荷表面処理方法を用いて測定した場合に比較される方法を理解するには、さらなる特性評価が必要である。包埋法はサンプルに材料を追加しますが、in vivoでの椎体骨折の重要な構造であるエンドプレートを保存することを考えると、異なる方法を使用して調製された椎骨間でいくつかのパラメータが異なることが予想されます17,27。頭蓋端に骨セメントを添加するとサンプルに高さが加わりますが、エンドプレートを切断すると高さがなくなり、アスペクト比が変わり、剛性などの機械的特性が変化します。さらに、PMMAは脊椎海綿骨よりも硬いですが、PMMAが変位する可能性があり、この変位の程度はさらに特徴付ける必要があります。さらに、包埋法または切断法のいずれかから得られた結果が、マウス椎骨の有限要素解析を使用した骨パラメータの予測とどのように比較されるか、または異なる条件(速度の低下、椎体レベルの違い、PMMA組成など)で結果がどのように変化するかは不明です。それにもかかわらず、すべての検体は同様の方法で調製されるため、この方法は適切であり、サンプルが同様の条件下で調製およびテストされる単一の研究で治療群間の比較を行う簡単で費用対効果の高い手段を可能にします。
圧縮試験前の試験片の準備では、再現性のある方法で試料を作製することが不可欠です。本研究で記載の方法の1つの可能な制限は、脊椎突起を除去するための回転工具の使用である。マウスの腰椎の脊椎突起を除去する別の方法は、Pendletonらによって報告されており19、より一貫したサンプル調製を可能にする可能性があります。さらに、PMMA骨セメントの塗布により不整合が生じる可能性があります。したがって、骨セメントは、体積、配置、硬化時間の点で一貫して塗布することが重要です。ただし、包埋法は、サイズが小さく壊れやすいため、すべてのサンプル間で完全に均一で平行な切断を一貫して達成することが困難な場合があるため、切断法と比較して一貫したサンプル調製を達成するためのより簡単な手段を提供する可能性があります。包埋と 埋め込みを使用して調製されたサンプルから得られた結果の精度を評価するには、今後の研究が必要です。切断方法。
前述のように、一軸圧縮試験の前に、マウス腰椎の標本調製のための包埋法のさらなる特性評価と調査が必要です。それにもかかわらず、この研究は、そのような方法が採用できることを実証し、提案された方法の詳細な説明を提供し、方法を使用して調製されたサンプルから測定されたパラメータの記述統計を提供します。このプロトコルは、現在利用可能な方法論が不足しているため、この分野にとって価値があります。さらに、この方法は、他の方法と比較して、in vivo脊椎骨折が発生するメカニズムをよりよく模倣する可能性があります17,27。また、この方法には、現在報告されている他の方法に関連する技術的な困難を克服するという利点もあり、骨研究において一軸圧縮試験をより実現可能にします。これは、薬物、食事療法、またはその他の介入が皮質に富む骨(例えば、長骨中骨幹)と海綿に富む骨(例えば、椎体)に異なる影響を与える可能性があるため、特に重要であるが、3点曲げは骨の機械的特性を評価するための主要な方法である13。3点曲げ試験と一軸圧縮試験の組み合わせは、コンバーチブル3点曲げ/圧縮試験機を使用することで、さらに簡単に達成できます。したがって、本研究は、同じ研究で皮質に富む骨と海綿に富む骨の両方の評価を研究者がより利用できるようにするための2つの可能な手段を提案し、特定の治療が実験グループ間の異なる骨タイプにどのように影響するかをよりよく理解することにつながる可能性があります。
Disclosures
著者らは、利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
コロラド州立大学プエブロ校の工学部が、3点曲げ機を製作し、コンバーチブル3点曲げ/圧縮試験機に改造するにあたり、多大な努力を払ってくださったことに感謝しています。特に、機械工場のコーディネーターであるポール・ウォレス氏には、機械の製作と改造の計画と実行に尽力していただき、感謝しています。また、バハア・アンサフ博士(コロラド州立大学プエブロ校工学部)とフランツィスカ・サンドマイヤー博士(コロラド州立大学プエブロ校生物学科)の専門知識とフィードバックも、このプロジェクトに大きく貢献しました。コロラド州立大学プエブロ校の大麻研究所の助成金は、この実験が一環であったより大きなプロジェクトに資金を提供し、マウス、試薬、および使用された機器の一部を購入することを許可しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120-Grit Sand Paper | N/A | N/A | For removal of caudal end plate soft tissues and irregularities |
| 24-bit Load Cell Interface | LoadStar Sensors, Freemont, California, USA | DQ-1000 | To connect load and displacement sensors to personal coputer |
| Base Mouse Diet | Dyets, Inc, Bethlehem, PA, USA | AIN-93G | Diet the mice were fed, without added hempseed |
| Diamond Cutoff Wheel w/ Rotary Tool | Dremel US, Mt. Prospect, Illinois, USA | F0130200AK | To remove vertebral proccesses |
| Displacement Sensor | Mitutoyo, Aurora, Illinois, USA | ID-S112EX | Displacement sensor with 0.001 mm resolution and 0.00305 mm accuracy |
| External Variable Voltage Power Source | Extech Instruments, Nashua, New Hampshire, USA | 382213 | To provide power to compression testing machine |
| Female C57BL/6 Mice | Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts, USA | 027 (Strain Code) | Mouse model used in present study |
| Hempseed | Natera, Pitt Meadows, Canada | 670834012199 | Hempseed added to Base Mouse Diet |
| Igor Pro Software (Version 8.04) | Wave Metrics, Portland, Oregon, USA | N/A | Sofware used for load-displacement curve analysis |
| iLoad Mini Force Sensor | LoadStar Sensors, Freemont, California, USA | MFM-010-050-S | Load (force) sensor with 1.0% accuracy |
| Isotonic (0.9%) Saline Solution | N/A | N/A | To keep bone sampels hydrated |
| Leica EZ4 W Miscoscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | NC1601884 | For bone dissections and vertebral process removal |
| Microsoft Excel Software | Microsoft Corporation, Redmond, Washington, USA | N/A | For data transfer from SensorVue software |
| PALACOS R Bone Cement | Hareus Medical, Wehreim, Germany | 00-1112-140-01 | PMMA bone cement for embedding of the loading surface |
| Personal Computer | N/A | N/A | For data recording (see 24-bit Load Cell Interface, SensorVue Software, Microsoft Excel Software) and analysis (see Igor Pro Software) |
| SensorVue Software | LoadStar Sensors, Freemont, California, USA | N/A | Software used for real-time data collection during compression testing |
| Small Animal Dissecting Kit | N/A | N/A | Dissecting scissors, forceps, scalpel, blades, pins, gauze pads |
| Stainless Steel Top Platen (Self-Alligning) and Bottom Platen Pair | N/A | N/A | Constructed by Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering |
| Three-Point Bending Machine | N/A | N/A | Constructed by Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering. Refer to Sarper et al. (2014) for further details regarding construction |
References
- Kemmak, A. R., et al. Economic burden of osteoporosis in the world: A systematic review. Medical Journal of The Islamic Republic of Iran. 34, 153 (2020).
- Li, J., et al. Different bone remodeling levels of trabecular and cortical bone in response to changes in Wnt/β-catenin signaling in mice. Journal of Orthopaedic Research. 35 (4), 812-819 (2016).
- Crandall, C. Parathyroid hormone for treatment of osteoporosis. JAMA Internal Medicine. 162 (20), 2297-2309 (2002).
- Ott, S. M. Cortical or trabecular bone: what's the difference. American Journal of Nephrology. 47 (6), 373-375 (2018).
- Sparks, C. A., Streff, H. M., Williams, D. W., Blanton, C. A., Gabaldón, A. M. Dietary hempseed decreases femur maximum load in a young female C57BL/6 mouse model but does not influence bone mineral density or micro-architecture. Nutrients. 14 (20), 4224 (2022).
- Blanton, C. A., Barrott, J. J., Kunz, K., Bunde, E., Streff, H. M., Sparks, C. A., et al. The Impact of Hempseed Consumption on Bone Parameters and Body Composition in Growing Female C57BL/6 Mice. International Journal of Environmental Research and Public Health. 19 (10), 5839 (2022).
- Sarper, H., Blanton, C., Depalma, J., Melnykov, I. V., Gabaldón, A. M. Simulated weightlessness and synbiotic diet effects on rat bone mechanical strength. Life Sciences in Space Research. 3, 45-54 (2014).
- Choman, M. The Effect of a synbiotic diet on the structure and strength of cortical bone in aging male mice. , Colorado State University-Pueblo. Pueblo, CO. (2015).
- Sparks, C. A., Giltner, Z. T., Blanton, C. A., Gabaldón, A. M. The Effects of a synbiotic diet on humerus bone mineralization and mechanical strength in aging male mice. El Río. 4 (1), 3-12 (2021).
- Bilezikian, J. P., Martin, T. J., Clemens, T. L., Rosen, C. J. Principles of bone biology (Fourth Edition). , Academic Press. Cambridge, MA, USA. (2019).
- Jepsen, K. J., et al. Establishing biomechanical mechanisms in mouse models: practical guidelines for systematically evaluating phenotypic changes in the diaphyses of long bones. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (6), 951-966 (2015).
- Vashith, D., Tanner, K. E., Bonfield, W. Contribution, development and morphology of microcracking in cortical bone during crack propagation. Journal of Biomechanics. 33 (9), 1169-1174 (2000).
- Turner, C. H., Burr, D. B. Basic biomechanical measurements of bone: A tutorial. Bone. 14 (4), 595-608 (1993).
- Warriner, A. H., et al. Which fractures are most attributable to osteoporosis. Journal of Clinical Epidemiology. 64 (1), 46-53 (2011).
- Donally, C. I., DiPompeo, C., Varcallo, M. Vertebral compression fractires. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL, USA. (2022).
- Alhadhoud, M., Alsiri, N. The epidemiology of spinal fractures in a level 2 trauma center in Kuwait. SAGE Open Medicine. 9, 1-11 (2021).
- Schumancher, Y. Comparison of two loading surface preparation methods on rat vertebral bodies for compression testing. , Queens University. Kingston, Ontario, Canada. (2013).
- Rathore, M., Sharma, D., Sinha, M., Siddiqui, A., Trivedi, S. A. Focused review - thoracolumbar spine: anatomy, biomechanics and clinical significance. Indian Journal of Clinical Anatomy and Physiology. 1 (1), 41-48 (2014).
- Pendleton, M. M., et al. High-precision method for cyclic loading of small-animal vertebrae to assess bone quality. Bone Reports. 9, 165-172 (2018).
- Lundon, K., Bolton, K. Structure and function of the lumbar intervertebral disk in health, aging, and pathologic conditions. Journal of Orthopaedic & Sports Physical Therapy. 31 (6), 291-306 (2011).
- Sharir, A., Barak, M. M., Shahar, R. Whole bone mechanics and mechanical testing. The Veterinary Journal. 177 (1), 8-17 (2008).
- Zhao, S., et al. Standardizing compression testing for measuring the stiffness of human bone. Bone & Joint Research. 7 (8), 524-538 (2018).
- Akhter, M. P., Jung, L. K. L. Decreased bone strength in HLA-B27 transgenic rat model of spondyloarthropathy. Rheumatology. 46 (8), 1258-1262 (2007).
- Shahnazari, M., et al. Higher doses of bisphosphonates further improve bone mass, architecture, and strength but not the tissue material properties in aged rats. Bone. 46 (5), 1267-1274 (2011).
- Chachra, D., Kasra, M., Vanin, C., MacLusky, N., Casper, R., Grynpas, M. The effect of different hormone replacement therapy regimens on the mechanical properties of rat vertebrae. Calified Tissue International. 56 (2), 130-134 (1995).
- Bushinsky, D. A., Willet, T., Asplin, J. R., Culbertson, C., Sara, C., Grynpas, M. Chlorthalidone improves vertebral bone quality in genetic hypercalciuric stone-forming rats. The Journal of Bone and Mineral Research. 26 (8), 1904-1912 (2011).
- Fujiwara, T., Akeda, K., Yamada, J., Kondo, T., Sudo, A. Endplate and intervertebral disc injuries in acute and single level osteoporotic vertebral fractures: is there any association with the process of bone healing. BMC Musculoskeletal Disorders. 20 (1), 336 (2019).
- Kalidindi, S. R., Abusafieh, A. Accurate characterization of machine compliance for simple compression testing. Experimental Mechanics. 37 (2), 210-215 (1997).
