Summary
이 프로토콜에서는 마우스 요추의 단축 압축 테스트를 보다 쉽게 수행할 수 있도록 하는 두 가지 접근 방식을 설명합니다. 먼저, 3점 벤딩 머신을 압축 시험기로 변환하는 방법에 대해 설명합니다. 둘째, 골시멘트를 이용한 하중면을 제조하기 위한 매립법은 생쥐의 요추에 적합하다.
Abstract
피질골과 해면골이 약물 요법, 호르몬 요법 및 노화와 관련된 뼈 손실에 대한 기타 치료법을 조절하고 반응하는 데 차이가 있다는 인식이 높아지고 있습니다. 3점 굽힘은 피질골이 풍부한 긴 뼈의 중간 골격 영역에 대한 치료의 영향을 평가하는 데 사용되는 일반적인 방법입니다. 쥐 척추의 단축 압축 시험은 해면골이 풍부한 뼈를 평가할 수 있지만 기술적인 문제로 인해 덜 일반적으로 수행됩니다. 이보다 덜 일반적으로 수행되는 것은 3점 굽힘 및 압박 테스트의 쌍을 이루어 치료가 긴 뼈의 중간 골격 영역과 척추 중심에 유사하거나 다르게 영향을 미칠 수 있는 방법을 결정하는 것입니다. 여기에서는 마우스 요추의 압축 시험을 3점 굽힘과 병행하여 수행하기 어려운 덜 어려운 방법으로 만드는 두 가지 절차, 즉 첫 번째는 3점 굽힘기를 압축 시험기로 변환하는 절차이고, 두 번째는 마우스 요추 하중 표면을 준비하기 위한 임베딩 방법입니다.
Introduction
노화와 관련된 뼈 변화는 이러한 변화와 관련된 골절의 위험이 증가하기 때문에 문제가 되는 것으로 널리 인식되고 있습니다. 인간의 골절은 만성 통증, 이동성 감소, 장기적인 장애, 사망 위험 증가 및 경제적 부담으로 이어질 수 있습니다1. 노화와 관련된 뼈 변화의 증상을 해결하기 위해 조사된 일반적인 치료법에는 식이 보충제, 호르몬 치료 및 약물 2,3,4,5,6,7,8,9가 포함됩니다. 인간 피험자에 대한 이러한 치료법의 초기 조사는 일반적으로 인간 골격(10)에서 발견되는 두 가지 주요 유형의 뼈를 가지고 있는 소동물 모델(예를 들어, 실험용 쥐 및 생쥐)을 사용하여 수행된다. 상완골, 대퇴골, 경골과 같은 충수골의 긴 뼈는 피질(즉, 조밀한) 뼈가 풍부한 반면, 척추뼈는 해면골, 해면골 또는 섬유주골)이 풍부합니다.4. 뼈 조절 및 신호 전달 경로의 메커니즘이 대뇌 피질 뼈(예: 긴 뼈 중간 골)와 해면골(예: 척추 중심)에 따라 다르다는 사실이 점점 더 많이 알려져 있습니다2. 이 때문에 치료법은 동일한 뼈 2,3,4 내에서 뼈 특이적 또는 부위 특이적 차별적 효과를 가질 수 있습니다.
물체(예: 뼈)에 힘을 가하면 물체의 경계 조건에 따라 물체가 가속, 변형 또는 둘 다를 겪게 됩니다. 골격이 구속되면 동일한 크기의 반대 힘이 골격의 가속도에 저항하고 변형이 발생합니다. 뼈가 변형을 지속함에 따라 응력이라는 내부 저항이 발생하며, 여기에는 장력 또는 압축 형태의 수직력과 전단력10의 두 가지 기본 유형이 있습니다. 종종, 응력의 기본 유형들의 조합이 인가된 힘 시스템(10)에 따라 생성된다. 재료의 강도는 실패 없이 응력을 견딜 수 있는 능력입니다. 재료에 점점 더 큰 힘이 가해짐에 따라 결국 영구적인 변형을 겪게 되며, 이 시점에서 탄성 상태(즉, 힘이 제거되면 원래 모양으로 돌아감)에서 플라스틱 상태(즉, 힘이 제거되어도 원래 모양으로 돌아가지 않음)로 전환되었다고 합니다.11 탄성 상태에서 소성 상태로의 전환이 발생하는 지점을 항복점이라고 합니다. 항복점을 넘어 재료에 더 큰 힘이 가해지면 전체 파괴가 발생할 때까지 미세 파괴(즉, 손상)가 점점 더 지속됩니다. 이 시점에서 재료는11,12에 실패했다고합니다. 뼈의 골절은 구조적 수준과 조직 수준10 모두에서 실패를 나타냅니다. 예를 들어, 척추뼈의 파손은 구조적 수준에서 여러 섬유주가 실패할 뿐만 아니라 조직 수준에서 개별 섬유주에서 콜라겐 및 하이드록시아파타이트 결정과 같은 세포외 기질 요소의 실패가 발생하기 때문에 발생합니다.
재료의 고장으로 이어지는 기계적 사건은 다양한 테스트 방법을 사용하여 측정할 수 있습니다. 3점 굽힘은 충수 골격에서 긴 뼈의 기계적 특성을 테스트하는 일반적인 방법입니다. 이 방법은 간단하고 재현 가능하여 많은 연구자들이 선호하는 생체 역학 테스트 방법입니다13. 두 개의 하부 지지 빔에 놓인 긴 뼈의 중간 직경에 크로스헤드 빔을 낮춤으로써, 이 방법은 조밀하게 조직된 피질 뼈인 중간 직경 영역의 기계적 특성을 구체적으로 테스트합니다. 하중-변위 곡선에서 탄성, 인성, 파괴력에 대한 인장력 효과, 뼈 재료의 탄성에서 소성 거동으로의 전환 등을 결정할 수 있습니다.
섬유주, 해면골, 짠 뼈 또는 해면골이라고 하는 두 번째 유형의 뼈에서는 뼈 요소가 섬유주라고 하는 막대와 빔의 배열로 형성되어 "해면질" 모양을 제공합니다. 주요 척추체(즉, 중심)는 해면골(cancellous bone)이 풍부하며, 종종 인간의 노화와 관련된 압박 골절의 부위가 된다14. 요추(즉, 허리)는 가장 큰 척추뼈로 신체 체중의 대부분을 지탱하며 척추 골절의 가장 흔한 부위입니다15,16. 척추체의 기계적 특성은 단축 압축 시험 방법을 사용하여 가장 잘 평가될 수 있는데, 그 이유는 축방향 압축이 생체 내 척추 기둥에 가해지는 수직력 하중이기 때문이다 17. 생체 내 척추체의 압축은 근육 및 인대 수축, 중력 및 지면 반력의 결과로 발생한다18.
소동물 척추의 체외 압축 시험은 작은 크기, 불규칙한 모양 및 취약성으로 인해 어려울 수 있습니다. 척추체의 형태는 완만한 복부 기울기와 약간의 두개골 오목한 평행사변형으로 추정할 수 있다17. 이 모양은 하중 표면에 대한 적절한 준비 없이 하중 표면의 일부에만 압축력이 가해져 "국부 접촉"17,19이 발생하기 때문에 생체 외 단축 압축 테스트를 달성하는 데 어려움이 있습니다. 이로 인해 일관되지 않은 결과와 조기 고장이 발생할 수 있다19. 이는 생체 내에서 그렇지 않은데, 이는 하중 표면이 척추 관절의 추간판으로 둘러싸여 있어 하중이 두개골 엔드 플레이트 전체에 분산될 수 있기 때문입니다. 추간판-두개골 종판 복합체는 척추체 전체에 힘을 가하고 척추체에 대한 골절의 생체역학에 중요한 역할을 한다14,20. 압축 시험은 생물학 분야에서 새로운 것은 아니지만, 현재의 뼈 기계적 시험 방법에는 한계가 있습니다. 이러한 한계에는 골역학에 대한 예측 모델 및 시뮬레이션의 부족, 독특한 기하학적 공간 구조, 심지어 내재된 샘플 기반 생물학적 변이가 포함된다21. 더 중요한 것은, 이 분야는 방법들 간의 표준화 부족과 문헌22에 보고된 방법의 전반적인 부족으로 인해 어려움을 겪고 있다는 것이다.
단축 압축 시험을 달성하기 위해 설치류 요추를 준비하기 위해 문헌에 보고된 두 가지 방법이 있습니다: 절단 방법 및 매립 방법 17,19,23,24,25,26. 절단 방법은 척추 돌기, 두개골 엔드 플레이트 및 꼬리 엔드 플레이트를 척추체에서 절단해야 합니다. 펜들턴(Pendleton) 등[19]은 이전에 쥐의 요추에 이 방법을 사용하는 상세한 방법을 보고한 바 있다. 이 방법은 꼬리 및 두개골 엔드 플레이트 모두에서 완벽하게 평행한 절단을 달성하는 동시에 샘플의 손상을 방지하는 데 어려움이 있습니다. 또한 두개골 엔드 플레이트가 제거된다는 제한이 있습니다. 두개골 종판은 피질뼈의 조밀한 껍질을 포함하고 있으며 생체 내 추간판으로부터의 하중을 분산시키는 데 중요한 역할을 하며 생체 내 골절에 대한 뼈의 파괴에 관여합니다 17,20,27. 대조적으로, 임베딩 방법은 척추체의 두개골 엔드 플레이트를 손상되지 않은 상태로 유지하면서 척추 돌기를 제거하는 것을 포함합니다. 그런 다음 하중 표면은 척추체의 두개골 끝에 소량의 뼈 시멘트를 놓아 거의 수평으로 만듭니다. 이 방법은 절단 방법과 관련된 기술적 도전을 극복하고 두개골 엔드 플레이트의 보존으로 인한 생체 내 하중 적용 및 골 파괴의 메커니즘을 더 잘 모방할 수 있다는 장점이 있습니다. 이 접근법은 이전에 쥐 뼈에 대한 단축 압축 테스트와 관련된 연구에서 문서화되었습니다. 그러나, 우리가 알고 있는 한, 그것은 더 작은 쥐의 요추 17,25,26의 맥락에서 이전에 문서화되지 않았다. 문제의 방법은 이전에 Chachra et al.25에 의해 자세히 설명되었으며 원래 각각 원통형 구멍이 있는 두 판 사이에 있는 뼈 표본을 사용한 다음 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA)로 채웠습니다. 같은 연구 그룹은 나중에 한쪽 끝을 부드럽게 샌딩하고(꼬리), 다른 쪽 끝에는 뼈 시멘트의 작은 반점이 추가된(두개골) 방법을 개선했습니다.26 이 방법은 플래튼 사이의 재료를 최소화하고 이 기사의 초점이기 때문에 이전 방법을 개선한 것입니다. 단축 척추 압박 검사와 관련된 어려움에도 불구하고, 이 방법은 특히 3점 굽힘과 함께 사용할 때 제안된 치료법이 뼈에 미치는 영향에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있는 방법입니다.
여기에서는 하나의 기계를 사용하여 긴 뼈와 척추체를 쉽게 시험할 수 있는 컨버터블 3점 굽힘/압축 시험기를 사용하는 방법을 제시합니다. 또한, 마우스 요추의 단축 압축 시험을 달성하기 위한 임베딩 방법의 사용이 제시됩니다. 본 연구는 젊은식이 대마 보충제가 젊은, 성장하는 암컷 C57BL / 6 마우스 5,6에서 골격 뼈의 특성에 미치는 영향을 조사하는 것을 목표로하는 더 큰 연구의 일환으로 수행되었습니다. 3점 굽힘 시험기는 원래 콜로라도 주립 대학-푸에블로 공학과의 교수진과 학생들이 제작했으며 우리 연구 그룹이 긴 뼈[쥐 대퇴골 및 경골7 및 쥐 상완골, 대퇴골 및 경골 5,6,8,9]에 대한 3점 굽힘 시험에 사용했습니다.]. 그러나 마우스 척추체 압박 시험에 사용하기 위한 수정 및 적용은 연구되지 않았습니다. 3점 벤딩 머신의 설계 및 구성은 이전에 설명되었습니다7. 이 보고서는 압축 테스트를 위해 기계를 수정하고 시스템 변위를 수정하는 데 사용되는 방법에 중점을 둡니다. 둘째, 마우스 척추체 하중 표면 준비를 위한 임베딩 방법과 단축 압축 시험 방법 및 하중 변위 데이터 분석에 대해 설명합니다.
Protocol
모든 실험 및 프로토콜은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 실험동물 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 수행되었으며 콜로라도 주립대학교-푸에블로 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Colorado State University-Pueblo Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다(프로토콜 번호: 000-000A-021). 동물 관리에 대한 자세한 절차는 이전에 5,6에서 설명되었습니다. 생쥐는 젊은, 성장하는 암컷 C57BL/6 쥐에 대한 대마씨 보충 식단의 효과를 조사하는 것을 목표로 하는 광범위한 연구의 일환으로 생후 3주에 얻어졌다(자료표 참조). 5주에서 29주까지, 생쥐는 세 가지 식단 중 하나로 자랐습니다: 대조군 (0% 대마씨), 50g/kg(5%) 대마씨, 또는 150g/kg(15%) 대마씨, 그룹 당 8마리의 생쥐 5,6. 연구 전반에 걸쳐, 쥐는 각자의 식단과 물에 대한 자유 접근을 가졌고, 폴리카보네이트 케이지에 한 쌍으로 수용되었으며, 12시간 빛:12시간 어두운 주기(06:00에서 18:00 사이에 조명이 켜진 상태)로 유지되었습니다. 쥐의 체중과 건강은 매주 평가되었으며, 모든 쥐는 불리한 건강 상태를 발전시키지 않고 연구를 성공적으로 완료했습니다. 생후 29주가 되었을 때, 마우스는 이소플루란 가스를 사용하여 깊이 마취되고 자궁경부 탈구를 통해 안락사되었다 5,6. 흉골에서 꼬리까지 복부 표면에 정중선을 절개하고 흉곽내, 복막내, 후복막 기관을 모두 사체에서 제거했습니다. 내장이 제거된 사체는 약 1년 후 발생한 척추 검사를 위한 뼈 절개 시점까지 -70°C에서 0.9% 염화나트륨 용액에 보존되었습니다.
1. 3점 벤딩 머신을 압축 시험기로 변환
- 3점 벤딩 머신7(재료 표 참조)의 부하 센서에 부착된 크로스헤드 빔의 나사를 풉니다(그림 1A,B).
- 자동 정렬 상단 플래튼을 크로스헤드 빔과 동일한 나사산을 사용하여 부하 센서( 재료 표 참조)에 나사로 고정합니다(그림 1C).
- 하단 지지대가 나중에 부착될 각 하단 지지대에 두 개의 수평 구멍을 뚫습니다(그림 1D).
- 스테인리스강 바닥 압반의 양쪽에 나사산을 두드려 하부 지지대의 뚫린 구멍에 맞춥니다(그림 1E).
- 나사산 육각 나사를 사용하여 하단 플래튼을 두 개의 하단 지지대에 고정하고 고정될 때까지 조입니다(그림 1F).
알림: 육각 나사에는 하부 지지대 및 상단/하단 플래튼의 탭 구멍과 일치하는 나사산이 있어야 합니다. 자동 정렬 상단 플래튼을 사용하면 상단 플래튼과 하중 표면 사이에 균일한 접촉을 달성하는 데 도움이 될 수 있지만 척추체의 두개골 끝의 오목한 부분을 감안할 때 충분하지 않습니다. 하중 표면 처리 방법을 사용한 추가 준비가 필요합니다. 많은 산업/엔지니어링 재료보다 작고 약한 작은 동물 뼈에 대한 압축 시험기를 제작할 때 하중 센서의 하중 용량과 하중 프레임의 크기를 고려하는 것이 필수적입니다. 또한 정확한 결과와 원활한 작동을 위해 기계를 정기적으로 청소하고 윤활해야 합니다.
2. 압축 시험기의 변위 보정
- 상단 플래튼과 하단 플래튼 사이에 테스트 재료가 없는 상태에서 가벼운 접촉이 이루어질 때까지 상단 플래튼을 하단 플래튼 위로 내립니다(~0.3-0.5N 예압력).
- 일정한 하강 속도(~1mm/min)로 기계를 켜서 압축 테스트를 시작합니다. 기계적 시험의 데이터 수집을 위해 디지털 데이터 수집 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 하중(N) 및 변위(mm) 측정값을 수집합니다.
알림: 상단 및 하단 플래튼 사이에 재료가 없기 때문에 관찰된 모든 변위는 기계(Δx기계)(프레임, 로드셀, 플래튼, 커플링 등)의 변위로 인한 것입니다. - 모든 뼈 샘플에서 얻을 수 있는 것보다 더 높은 힘에 도달할 때까지 일정한(즉, 단조로운) 속도로 상단 플래튼을 하단 플래튼 위로 계속 내립니다.
- 2.1단계부터 2.3단계까지 총 3회 반복합니다.
- 시스템 변위(Δx기계, mm)에 대한 데이터를 플로팅합니다. 적용된 하중(힘, N).
- 데이터에 가장 적합한 회귀선을 맞춥니다(그림 2A-D).
- 뼈 압박 테스트의 데이터가 포함된 스프레드시트에서 회귀 분석에서 제공하는 방정식을 사용하여 마우스 요추 압박 테스트의 데이터 포인트에 대해 기록된 변위(Δx총 기록)에 영향을 미치는 기계 변위(Δx기계)의 양을 결정합니다.
참고: 예를 들어ample, 18N의 힘이 가해지고 2.730mm의 변위가 기록된 데이터 포인트를 고려하십시오(총 Δx 기록). 예제 3차 다항식 회귀 방정식(그림 2D) [Δx기계 = (4 × 10-7 x 적용 하중3) - (8 × 10-5 x 적용 하중2) + (0.0044 x 적용 하중)], 기록된 변위의 0.056mm는 기계 변위(Δx기계)로 인한 것입니다.
Δx 총 기록 = Δx기계 + Δx시편 - 데이터 포인트에 대해 기록된 변위를 수정합니다.
참고: 예를 들어 위의 예를 고려하십시오. 2.730mm의 변위가 기록되고(Δx총 기록) 기계 변위 (Δx기계)가 전체의 0.056mm를 설명하는 경우 관심 시편(즉, 뼈)이 받은 변위(Δx시편)는 2.664mm입니다. 따라서 2.664mm는 척추가 받은 실제 변위(Δx표본)이며 하중-변위 곡선 해석에 사용되는 값입니다.
Δx시편 = Δx 총 기록 - Δx기계 - 모든 단일 표본(뼈)에 대해 수집된 모든 데이터 포인트에 대해 2.7-2.8단계를 반복합니다.
참고: 이 단계는 압축 시험 중에 관찰된 변위가 시편의 변위로 인한 것일 뿐만 아니라 관찰된 변위가 기계 변위(Δx기계)(예: 프레임, 로드셀, 압반, 커플링 등의 압축/변위)와 시편(Δx시편). 따라서 작은 동물(예: 마우스)과 같이 상대적으로 적은 양의 변위를 겪는 시편의 경우 시스템 변위(Δx기계)로 인해 큰 오류가 발생할 수 있습니다. 시스템 변위를 보정하기 위해 여기에 설명된 절차는 이전에 Kalidindi와 Abusafieh28에 의해 보고되었으며, 여기에 설명된 방법 외에 두 가지 다른 방법도 자세히 설명합니다. 일부 연구자들은 시스템 변위(system displacement)17를 결정하기 위해 하나 이상의 방법을 사용하는 것으로 알려져 있다. 각 기계에 하중이 가해질 때 고유한 패턴과 시스템 변위 정도를 표시할 수 있습니다. 이러한 이유로 시스템 변위 보정 계수는 각 기계에 대해 결정되어야 하며 두 기계 간에 동일하지 않습니다. 척추뼈의 압축 시험과 달리, 상부와 하부 플래튼 사이에 재료가 없기 때문에 시스템 변위를 측정할 때 큰 힘 감소가 관찰되지 않습니다.
3. 쥐 사체에서 나온 제5 요추 (L5) 해부
- 냉동 쥐 사체를 실온에서 해동하고 0.9% NaCl의 등장성 용액을 정기적으로 도포하여 연조직과 뼈에 수분을 공급하도록 주의합니다.
- 꼬리 기저부 근처의 등쪽 정중선의 피부를 작게(<0.5cm) 절개한 다음 각 뒷다리를 가로질러 절단면을 확장하고 부드럽게 당겨 꼬리 기저부에서 동물의 머리까지 가죽을 제거합니다.
- 척추가 쉽게 보일 때까지 복벽 근육을 잘라냅니다.
- 해부 현미경으로 두 개의 천장관절과 천골의 두개골 끝을 시각화합니다.
- 면도날이나 메스를 사용하여 마지막 요추(L6)를 천골의 두개골 끝에서 분리하기 위해 미세하게 자릅니다.
- 다시 말하지만, 추간 공간 사이를 절단하여 척추에서 L6과 L5를 제거하고 분석을 위해 L5를 따로 둡니다(그림 3).
- 해부 현미경으로 척추를 검사하고 추간판을 포함한 뼈의 모든 연조직을 대부분 거즈 패드를 사용하고 필요한 경우 집게로 부드럽게 제거합니다.
참고: 본 연구에서는 L5가 관심 척추로 선택되었지만 다른 요추는 압박 테스트를 위해 선택될 수 있습니다.
4. PMMA 골시멘트 매립법을 이용한 단축 압축시험을 위한 L5 척추 하중면 준비
- 회전 공구에 부착된 다이아몬드 절단 휠( 재료 표 참조)을 사용하여 각 척추경을 절단하여 횡돌기 및 가시돌기를 제거합니다(그림 4). 중심에 부착된 상태로 두면 척추 돌기가 중심 전체에 하중이 분산되는 것과는 반대로 과정 자체에서 상부/하부 압반과 국부적으로 접촉할 수 있습니다.
- 미세한 120방 사포( 재료 표 참조)를 사용하여 척추의 꼬리 끝을 부드럽게 샌딩하여 모든 추간판, 연조직 및 불규칙성을 제거합니다.
- 나중에 쉽게 식별할 수 있도록 샌딩된 꼬리 끝을 영구 마커로 표시하십시오.
- 제조업체의 지침에 따라 PMMA 뼈 시멘트를 혼합합니다( 재료 표 참조).
- PMMA 뼈 시멘트가 여전히 반쯤 부드러워진 상태에서 척추뼈의 두개골(표시가 없는) 끝이 위를 향하도록 하여 척추뼈가 식염수조에 있는 동안 전체 표면이 덮이도록 하여 뼈 샘플을 수분과 시원하게 유지합니다.
- PMMA가 여전히 반쯤 부드러운 상태에서 꼬리(표시된) 면이 아래를 향하도록 척추뼈를 바닥 플래튼에 놓습니다(그림 5).
- 기계를 켜서 구동 기어를 맞물리고 골시멘트와 접촉하고 PMMA가 뼈 표면에 고르게 분포되도록 최소한의 힘(<0.5N)이 가해질 때까지 상단 플래튼을 척추 + PMMA 골시멘트 복합체 위로 천천히 내립니다. 중립 위치의 상단 플래튼은 수평으로 추정할 수 있으며, 반 연질 PMMA를 누르면 PMMA가 척추 두개골 끝의 오목한 부분을 채우고 상단 플래튼 아래에 평평한 수평 표면을 형성합니다.
- 상단 플래튼이 PMMA 골 시멘트를 부드럽게 누른 상태에서 PMMA 골 시멘트가 완전히 굳을 때까지 샘플을 방해하지 않고 그대로 두십시오(본 연구에 사용된 PMMA 골 시멘트에 대한 제조업체 지침에 따라 ~10분). 샘플을 식염수 수조에 보관하거나 이 기간 동안 식염수로 자주 분무하여 샘플을 수분과 시원하게 유지합니다.
- PMMA 골시멘트가 완전히 굳으면 압축 시험을 시작할 수 있습니다. 기계적 테스트의 데이터 수집을 위해 설계된 디지털 소프트웨어를 사용하여 센서의 하중(즉, 힘)(N) 및 변위(즉, 처짐)(mm)에 대한 데이터를 실시간으로 스프레드시트로 수집합니다( 재료 표 참조).
- <0.5N의 최소 예압력으로 적용된 5초 동안 기준선 데이터 수집 후, 압축 테스트를 시작하기 위해 미리 결정된 단일(즉, 단조)의 하강 속도(~1mm/min)로 상부 플래튼을 샘플 위로 내리기 시작합니다.
- 하중(N)이 크게 감소하여 재료 고장이 관찰되면 데이터 수집을 중지합니다.
알림: 제조업체 지침에는 PMMA 골시멘트의 대략적인 경화 시간이 명시되어 있습니다. PMMA 골시멘트의 경화 시간은 사용되는 PMMA 골시멘트의 종류에 따라 다를 수 있습니다. 제조업체 지침에 따라 PMMA 경화 대기 시간을 결정하십시오. 그러나 PMMA 골시멘트가 완전히 굳었다는 지표로서 PMMA 골시멘트의 추가 시료를 척추뼈에 놓을 시료와 동시에 혼합할 수 있지만 따로 보관하고 여전히 부드러운지 완전히 굳었는지 확인할 수 있습니다. 완전히 굳어지면 뼈의 PMMA도 뼈 + PMMA 복합체를 방해하지 않고 완전히 굳어짐을 나타낼 수 있습니다. 뼈 샘플은 PMMA 경화 및 테스트 기간 동안 수분이 풍부하고 시원한 상태를 유지해야 합니다. 건조한 공기에 몇 분만 노출되어도 생체역학적 특성이 변할 수 있습니다. 일부 연구자들은 식염수조(19)가 장착된 압축 시험기를 사용한다. 본 연구에서 압축 시험기에는 식염수 수조가 없었습니다. 대신, PMMA 경화 기간과 테스트 기간 동안 미세한 식염수 미스트를 정기적으로 도포했습니다.
5. L5 척추 단축 압축 시험을 위한 하중-변위 곡선 분석
- 스프레드시트에서 하중(N) 및 수정된 변위(mm) 데이터를 복사하여 기술 그래프 작성 및 데이터 분석 소프트웨어에 붙여넣습니다( 재료 표 참조).
- y축에 하중(N)이 있고 x축에 보정된 시편 변위(Δx시편, mm)가 있는 그래프를 생성합니다(그림 6). 먼저 Windows, 새 테이블을 클릭한 다음 Do it to make a table을 클릭하여 소프트웨어에서 이 작업을 수행합니다. 수정된 변위(mm) 및 로드(N) 데이터를 원시 데이터 스프레드시트에서 새 테이블로 복사합니다.
- 그런 다음 Data(데이터)를 클릭하여 원시 데이터를 나타내는 파형을 생성한 다음 XY Pair to Waveform(XY 쌍을 파형 으로 연결)을 클릭하고 X-Wave에 대한 보정된 변위 데이터를 선택하고 Y-Wave에 대한 데이터를 로드합니다. "Number of Points" 상자에 올바른 데이터 포인트 수가 있는지 확인하고 파형의 이름을 지정한 다음 Make Waveform을 클릭합니다. 파형이 만들어지면 Windows를 클릭한 다음 새 그래프를 클릭하여 그래프를 생성하고 파형을 Y축에 배치하고 X축에 "계산"합니다.
- 커서 도구를 사용하여 분석을 위해 그래프에 관심 있는 포인트/영역을 표시합니다. 일반적인 전체 골격의 기계적 특성을 계산하기 위한 몇 가지 관심 지점/영역은 5.4-5.8단계(그림 6)에 언급되어 있으며, 여기에는 공품-실패 (N x mm), 최대 하중 (N), 강성 (N/mm), 항복 하중 (N) 및 항복 후 변위 (mm)가 포함됩니다.
- 재공품(N x mm)을 계산하려면 테스트 시작 지점에 커서(A)를 놓고 재료가 파손되기 직전 지점(즉, 하중이 크게 감소하기 전에 테스트 중에 도달한 최대 하중)에 커서(B)를 놓습니다.
알림: 따라서 커서 AB는 재료가 힘을 견디기 시작하고 재료가 파손되는 지점까지 변위를 겪기 시작할 때부터 전체 테스트를 브래킷으로 묶습니다. 공품-실패 (N x mm)는 곡선 아래의 전체 면적(즉, 커서 A와 B 사이의 곡선 아래 면적)으로 측정할 수 있습니다. - 최대 하중(N)을 테스트 중에 관찰된 하중(즉, 커서 B에서의 하중)에 대한 가장 높은 값으로 계산합니다.
- 재료의 강성 (N/mm)을 선형 탄성 영역의 기울기(즉, 커서 C와 D 사이의 기울기)로 계산합니다.
- 항복 하중(N)은 하중-변위 곡선이 선형성에서 벗어나 소성 영역으로 들어가 영구적인 변형(즉, 점 D에서의 하중)을 유지하는 하중입니다. 커서 D에서 하중을 측정하여 이를 계산합니다.
- 항복 후 변위(mm)는 재료의 연성을 나타내는 지표입니다. 이를 항복점과 재료 파손 지점 사이의 변위(즉, 커서 D와 B 사이의 변위)로 측정합니다.
참고: 위에 나열된 매개변수는 보고된 일반적인 전체 뼈 기계적 특성 중 일부일 뿐입니다. 하중-변위 곡선에서 얻을 수 있는 모든 전체 골격 기계적 특성의 전체 목록은 아닙니다. 다른 전체 뼈 기계적 특성 매개변수에는 총 변위(mm), 흡수된 탄성 에너지(N x mm), 탄성 변위(mm), 흡수된 플라스틱 에너지(N x mm) 및 소성 변위(mm)가 포함됩니다. 또한, 조직 수준의 뼈 기계적 특성은 나열되지 않습니다. 이를 위해서는 뼈 직경과 같은 특정 해부학적 측정값을 사용한 데이터 변환이 필요합니다. 소프트웨어의 하중-변위 곡선에서 측정하기 위한 예제 코드는 보충 파일 1에 나열되어 있습니다.
Representative Results
L5 하중 표면의 임베딩과 컨버터블 3점 벤딩 머신/압축 시험기를 사용하는 이 단계별 프로토콜을 사용하면 그룹 간 비교를 위해 마우스 요추에 대한 압박 테스트를 수행할 수 있습니다. 총 24개의 마우스 L5 척추뼈를 임베딩 방법을 사용하여 준비하였다. 그러나 샘플 중 3개는 회전 공구의 다이아몬드 절단 휠을 사용하여 척추 돌기를 제거하는 동안 손상되어 테스트되지 않았습니다. 이를 감안할 때, 나열된 기계적 특성은 임베딩 방법을 사용하여 24개의 샘플 중 21개에서 성공적으로 얻어졌습니다. 각 테스트 후 시편을 육안으로 검사했으며 PMMA 캡은 어떤 테스트에서도 손상되지 않았습니다. 언급되는 바와 같이, 본 연구에서 이용된 쥐는 젊고 성장하는 C57BL/6 여성 쥐의 뼈에 대한 규정식 대마씨의 효력을 결정하는 것을 겨냥하는 더 큰 학문의 일부이었다. 일반적으로 보고되는 5가지 전골 기계적 특성에 대한 기술 통계가 표 1에 나와 있습니다. 21개 샘플 모두에 대한 하중-변위 곡선은 그림 7에 나와 있습니다.
그림 1: 3점 절곡기를 압축 시험기로 변환 . (A) 변위 센서와 하중 센서가 표시된 3점 벤딩 머신으로 작동하도록 완전히 장착된 기계(흰색 화살표). (B) 크로스 헤드 빔이 제거된 후의 기계. (C) 자동 정렬 상단 플래튼을 이전에 배치한 위치에 배치한 후의 기계. (D) 구멍이 뚫린 하부 지지 빔. (E) 4개의 나사 구멍이 있는 스테인리스 스틸 바닥 플래튼에 두드려지고 나사가 구멍 중 하나에 부분적으로 나사로 고정됩니다. 사진에서 보이지 않는 다른 두 개의 구멍은 반대쪽에 있습니다. (F) 4개의 육각 나사로 부착된 바닥 플래튼이 있는 하부 지지 빔. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 시스템 변위(Δx기계) 와 선형(A), 로그(B), 2차 다항식(C) 및 3차 다항식(D) 회귀에 적합한 하중 플롯의 예. 이 예제에서는 3차 다항식이R2 값에 가장 적합하며, 이 회귀가 시스템 변위 보정 인자로 사용됩니다. 이미지는 회귀 피팅을 보여주기 위한 예제 데이터를 나타내며 개별 기계에 대한 연구원이 얻어야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 쥐의 요추 척추. L6을 제거하기 전(A)과 L6을 제거한 후(B)에 L5를 남겨둔 후 해부 현미경 아래의 쥐 요추 척추. L5는 이후에 제거되고 압축 테스트를 위해 준비됩니다. 흰색 띠는 해부되어 제거된 추간판입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: L5 척추의 해부학. 해부 현미경으로 본 두개골, 꼬리, 등쪽, 복부 모습의 대표적인 쥐 L5 척추. 척추체의 중요한 치수에는 컬러 선으로 표시된 것처럼 높이, 등쪽 너비 및 측면 너비가 포함됩니다. 검은색 점선은 척추 돌기를 제거하기 위해 절단해야 하는 대략적인 위치를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: PMMA 골시멘트의 경화 기간. PMMA 골 시멘트(녹색)가 두개골 종판에 배치되고 상단 플래튼이 PMMA 골 시멘트 + 골 복합체 위로 내려간 L5 척추의 예. PMMA 골시멘트가 완전히 굳으면 압축 시험이 시작됩니다. 재료의 파손이 관찰될 때까지 상단 플래튼이 더 낮아집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 마우스 척추 뼈 압축 테스트, 하중-변위 곡선 및 데이터 분석. 커서 A 는 압축 테스트의 시작을 표시합니다. 커서 B 는 재료 실패 지점을 표시합니다. 커서 C 는 선형 탄성 영역의 시작을 표시하는 반면, 커서 D 는 끝(즉, 항복점)을 표시합니다. 밝은 회색으로 음영 처리된 영역은 선형 탄성 영역으로, 하중이 제거되면 재료가 원래 모양으로 돌아갑니다. 짙은 회색으로 음영 처리된 영역은 재료가 영구적인 변형을 겪었고 하중이 제거되어도 원래 모양으로 돌아가지 않는 소성 영역입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 21개의 모든 뼈 샘플에 대한 하중-변위 곡선. 패턴은 뼈마다 달랐다. 일반적으로 가장 큰 변동성은 항복 후 변위에 있었으며, 뼈 중 일부(n = 5)는 상대적으로 항복 후 변위 가 작았고 다른 골격(n = 16)은 상대적으로 항복 후 변위가 컸습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 그룹 | 작업 대 고장 (N*mm) | 최대 하중 (N) | 뻣뻣함 (N/mm) | 항복 하중 (N) | 항복 후 변위 (mm) |
| CON (n = 7) | 13.43 ± 2.44 A,B | 3.28 ± 37.93 | 109.14 ± 11.86 | 2.04 ± 22.68 | 0.34 ± 0.06 |
| 5HS (n = 8) | 12.12 ± 1.23 암페어 | 33.62 ± 2.43 | 99.70 ± 16.62 | 2.69± 20.88 | 0.38 ± 0.08 |
| 15HS (n = 6) | 19.55 ± 2.13 B | 41.82 ± 1.85 | 134.58 ± 19.73 | 28.07 ± 3.20 | 0.51 ± 0.07 |
| 결합된 그룹(n = 21) | 1.27± 14.68 | 37.40 ± 1.63 | 121.82 ± 9.43 | 23.54 ± 1.60 | 0.40 ± 0.04 |
표 1: 일반적으로 보고되는 전체 골의 기계적 특성에 대한 대표 값으로, 로딩 표면 준비 임베딩 방법을 사용하여 얻은 것입니다. 값은 본 연구에 자세히 설명된 모든 프로토콜을 사용하여 얻었습니다. 따라서 값은 여기에 설명된 방법을 사용하여 얻을 수 있는 값을 나타냅니다. 값은 SEM± 의미합니다. 그룹은 5-29 주에서 0 % (CON), 50 g / kg (5 %) (5HS) 또는 150 g / kg (15 %) (15HS)의 농도로 전체 대마씨로 강화 된 식단을 먹인 C57BL / 6 암컷 마우스를 나타냅니다. 매개변수 중 하나(work-to-failure)의 경우 다이어트가 일원 분산 분석(p < 0.05)당 값에 영향을 미친 것으로 보입니다. Tukey-Kramer 사후 분석에 따르면 동일한 문자 위 첨자를 공유하는 값은 크게 다르지 않지만(p > 0.05), 문자 위 첨자가 다른 값은 크게 다릅니다(p < 0.05).
보충 파일 1: 전체 뼈의 기계적 특성을 얻기 위한 예제 코드. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
본 연구의 목적은 컨버터블 3점 벤딩 머신/압축 시험기의 구성과 단축 압축 시험 전에 마우스 요추 샘플 준비를 위한 PMMA 골시멘트 임베딩 방법의 사용을 설명하는 것이었습니다. 뼈 샘플에 대한 기술 통계를 얻어 보고했으며, 이는 향후 연구에서 비교하는 데 유용할 것입니다. 가장 일반적으로 보고된 전체 뼈 기계적 특성 중 일부는 본 연구에서 분석되었습니다. 그러나 여기에서 조사되지 않은 몇 가지 추가 전체 뼈 및 조직 수준의 기계적 특성이 있다는 점은 주목할 가치가 있습니다.
임베딩 방법을 사용하여 준비된 샘플에서 얻은 기계적 특성이 마우스 요추에 대한 절단 방법을 사용하여 준비된 기계적 특성과 어떻게 비교되는지는 여전히 불분명합니다. Schumancher17은 이전에 두 가지 다른 방법을 사용하여 준비된 쥐 척추의 기계적 특성을 평가한 결과, 임베딩 방법을 사용하여 준비된 척추뼈가 절단 방법을 사용하여 준비된 샘플보다 강성이 현저히 낮고 항복 변위가 높으며 항복 변형률이 높다는 것을 발견했습니다. 생쥐 또는 다른 동물 모델의 척추 기계적 특성이 두 가지 다른 로딩 표면 처리 방법을 사용하여 측정했을 때 어떻게 비교되는지 이해하려면 추가 특성화가 필요합니다. 임베딩 방법이 샘플에 재료를 추가하지만 생체 내 척추 골절에서 중요한 구조인 엔드 플레이트를 보존한다는 점을 감안할 때 다른 방법을 사용하여 준비한 척추뼈 간에 일부 매개변수가 다를 것으로 예상됩니다 17,27. 두개골 끝에 골 시멘트를 추가하면 샘플에 높이가 추가되는 반면, 엔드 플레이트를 절단하면 높이가 제거되어 종횡비가 변경되어 강성과 같은 기계적 특성이 변경됩니다. 또한, PMMA는 척추 해면골보다 더 뻣뻣하지만, PMMA가 변위를 겪을 수 있으며, 이 변위의 정도는 추가적인 특성화가 필요합니다. 또한 임베딩 방법 또는 절단 방법으로 얻은 결과가 마우스 척추에 대한 유한 요소 분석을 사용하여 뼈 매개변수를 예측하는 것과 어떻게 비교되는지 또는 결과가 다른 조건(예: 속도 저하, 다른 척추 수준, PMMA 구성)에서 어떻게 달라지는지도 불분명합니다. 그럼에도 불구하고 모든 검체가 유사한 방식으로 준비되기 때문에 이 방법이 적절하며 유사한 조건에서 검체를 준비하고 테스트하는 단일 연구에서 치료 그룹 간의 비교를 쉽고 비용 효율적인 수단으로 사용할 수 있습니다.
압축 시험 전 시편 준비와 관련하여 재현 가능한 방식으로 시료를 준비하는 것이 중요합니다. 본 연구에서 기술된 방법의 한 가지 가능한 한계는 척추 돌기를 제거하기 위해 회전 도구를 사용하는 것입니다. 쥐 요추의 척추 돌기를 제거하는 또 다른 방법은 Pendleton et al.19에 의해 설명되었으며, 이는 보다 일관된 샘플 준비를 허용할 수 있습니다. 또한 PMMA 골시멘트의 적용으로 인해 불일치가 발생할 수 있습니다. 따라서 골시멘트를 부피, 배치, 경화 시간 측면에서 일관되게 도포하는 것이 중요하다. 그러나 임베딩 방법은 작은 크기와 취약성으로 인해 모든 시료 간에 일관되게 완벽하게 균일한 평행 절단을 달성하는 것이 어려울 수 있기 때문에 절단 방법에 비해 일관된 시료 전처리를 달성하는 더 간단한 방법을 제공할 수 있습니다. 임 베딩을 사용하여 준비된 샘플에서 얻은 결과의 정밀도를 평가하기 위해 향후 연구가 필요할 것입니다. 절단 방법.
앞서 언급한 바와 같이, 단축 압박 시험 전에 쥐 요추의 시편 준비를 위한 임베딩 방법에 대한 추가 특성화 및 조사가 필요합니다. 그럼에도 불구하고, 본 연구는 그러한 방법이 채용될 수 있음을 보여주고, 제안된 방법에 대한 상세한 설명을 제공하며, 상기 방법을 사용하여 제조된 샘플로부터 측정된 파라미터에 대한 기술적 통계를 제공한다. 이 프로토콜은 현재 사용 가능한 방법론이 없기 때문에 현장에 가치가 있습니다. 더욱이, 이 방법은 다른 방법에 비해 생체내 척추 골절이 발생하는 기전을 더 잘 모방할 수 있다(17,27). 이 방법은 또한 현재 보고된 다른 방법과 관련된 기술적 어려움을 극복할 수 있는 장점이 있어 뼈 연구에서 단축 압축 테스트를 보다 실현 가능하게 만듭니다. 이는 약물, 식이요법 또는 기타 중재가 피질이 풍부한 뼈(예: 긴 뼈 중간 골격)와 섬유주가 풍부한 뼈(예: 척추체)에 다르게 영향을 미칠 수 있지만, 3점 굽힘이 뼈의 기계적 특성을 평가하는 주된 방법이기 때문에 특히 중요하다13. 3점 굽힘 시험과 단축 압축 시험의 조합은 컨버터블 3점 굽힘/압축 시험기를 사용하면 훨씬 더 쉽게 달성할 수 있습니다. 따라서 본 연구는 동일한 연구에서 피질이 풍부한 뼈와 섬유주가 풍부한 뼈의 평가를 연구자들이 더 쉽게 이용할 수 있도록 하는 두 가지 가능한 방법을 제안하며, 잠재적으로 주어진 치료법이 실험 그룹 간의 다른 뼈 유형에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 더 나은 이해로 이어질 수 있습니다.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
콜로라도 주립대학교 푸에블로 공학과가 3점 굽힘기를 제작하고 컨버터블 3점 굽힘/압축 시험기로 개조하는 데 상당한 노력을 기울인 것에 감사드립니다. 기계 공장 코디네이터인 Paul Wallace가 기계의 구성 및 수정을 계획하고 수행하는 데 기울인 노력에 대해 특히 감사드립니다. Bahaa Ansaf 박사(콜로라도 주립대학교 푸에블로 공학과)와 Franziska Sandmeier 박사(콜로라도 주립대학교 푸에블로 생물학과)의 전문 지식과 피드백도 이 프로젝트에 크게 기여했습니다. 콜로라도 주립 대학 - 푸에블로 (Colorado State University-Pueblo)의 대마초 연구 보조금 연구소 (Institute of Cannabis Research Grant)는이 실험이 참여한 더 큰 프로젝트에 자금을 지원했으며 마우스, 시약 및 사용 된 장비 중 일부를 구입할 수있었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120-Grit Sand Paper | N/A | N/A | For removal of caudal end plate soft tissues and irregularities |
| 24-bit Load Cell Interface | LoadStar Sensors, Freemont, California, USA | DQ-1000 | To connect load and displacement sensors to personal coputer |
| Base Mouse Diet | Dyets, Inc, Bethlehem, PA, USA | AIN-93G | Diet the mice were fed, without added hempseed |
| Diamond Cutoff Wheel w/ Rotary Tool | Dremel US, Mt. Prospect, Illinois, USA | F0130200AK | To remove vertebral proccesses |
| Displacement Sensor | Mitutoyo, Aurora, Illinois, USA | ID-S112EX | Displacement sensor with 0.001 mm resolution and 0.00305 mm accuracy |
| External Variable Voltage Power Source | Extech Instruments, Nashua, New Hampshire, USA | 382213 | To provide power to compression testing machine |
| Female C57BL/6 Mice | Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts, USA | 027 (Strain Code) | Mouse model used in present study |
| Hempseed | Natera, Pitt Meadows, Canada | 670834012199 | Hempseed added to Base Mouse Diet |
| Igor Pro Software (Version 8.04) | Wave Metrics, Portland, Oregon, USA | N/A | Sofware used for load-displacement curve analysis |
| iLoad Mini Force Sensor | LoadStar Sensors, Freemont, California, USA | MFM-010-050-S | Load (force) sensor with 1.0% accuracy |
| Isotonic (0.9%) Saline Solution | N/A | N/A | To keep bone sampels hydrated |
| Leica EZ4 W Miscoscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | NC1601884 | For bone dissections and vertebral process removal |
| Microsoft Excel Software | Microsoft Corporation, Redmond, Washington, USA | N/A | For data transfer from SensorVue software |
| PALACOS R Bone Cement | Hareus Medical, Wehreim, Germany | 00-1112-140-01 | PMMA bone cement for embedding of the loading surface |
| Personal Computer | N/A | N/A | For data recording (see 24-bit Load Cell Interface, SensorVue Software, Microsoft Excel Software) and analysis (see Igor Pro Software) |
| SensorVue Software | LoadStar Sensors, Freemont, California, USA | N/A | Software used for real-time data collection during compression testing |
| Small Animal Dissecting Kit | N/A | N/A | Dissecting scissors, forceps, scalpel, blades, pins, gauze pads |
| Stainless Steel Top Platen (Self-Alligning) and Bottom Platen Pair | N/A | N/A | Constructed by Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering |
| Three-Point Bending Machine | N/A | N/A | Constructed by Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering. Refer to Sarper et al. (2014) for further details regarding construction |
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