Mus lumbal vertebra uniaksial kompresjonstesting med innebygging av lasteoverflaten

Summary

I denne protokollen er to tilnærminger beskrevet for å gjøre uniaxial kompresjonstesting av musens lumbale ryggvirvler mer oppnåelig. Først beskrives konverteringen av en trepunkts bøyemaskin til en kompresjonstestmaskin. For det andre er en innebyggingsmetode for å forberede lasteflaten som bruker beinsement tilpasset musens lumbale ryggvirvler.

Abstract

Det er økende bevissthet om at kortikal og avbrytende bein er forskjellig i regulering og respons på farmasøytiske terapier, hormonbehandlinger og andre behandlinger for aldersrelatert bentap. Trepunktsbøyning er en vanlig metode som brukes til å vurdere påvirkning av en behandling på midtdiafyseområdet av lange bein, som er rik på kortikal bein. Uniaxial kompresjonstesting av musevirvler, selv om de er i stand til å vurdere bein rik på kansellerende bein, utføres mindre vanlig på grunn av tekniske utfordringer. Enda mindre vanlig utført er sammenkoblingen av trepunkts bøyning og kompresjonstesting for å bestemme hvordan en behandling kan påvirke et langt beins midtdiafyseregion og et vertebralt centrum på samme måte eller annerledes. Her beskriver vi to prosedyrer for å gjøre kompresjonstesting av musens lumbale ryggvirvler til en mindre utfordrende metode å utføre parallelt med trepunktsbøying: For det første en prosedyre for å konvertere en trepunkts bøyemaskin til en kompresjonstestmaskin, og for det andre en innebyggingsmetode for å forberede en lumbal ryggvirvelbelastningsflate for mus.

Introduction

Aldersrelaterte beinendringer er allment anerkjent som problematiske på grunn av økt risiko for beinfrakturer forbundet med disse endringene. Benbrudd hos mennesker kan føre til kroniske smerter, redusert bevegelighet, langvarig uførhet, økt risiko for død og økonomiske byrder¹. Vanlige terapier undersøkt for å håndtere symptomene på aldersrelaterte beinendringer inkluderer kosttilskudd, hormonbehandlinger og narkotika 2,3,4,5,6,7,8,9. Innledende undersøkelser av slike behandlinger for mennesker gjøres vanligvis ved hjelp av små dyremodeller (f.eks. Laboratorierotter og mus), som har de to hovedtyper av bein som finnes i det menneskelige skjelettet¹⁰. Appendikulære lange bein, som humerus, lårben og tibia, er rike på kortikale (dvs. kompakte) bein, mens ryggvirvler er rike på kansellerende bein (dvs. vevd, svampete eller trabekulært bein)⁴. Det er økende kunnskap om at mekanismene for benregulering og signalveier varierer mellom kortikale bein (f.eks. langt ben midt i diafysen) og avbrutt ben (f.eks. vertebralt centrum)². På grunn av dette kan terapier ha differensielle effekter som er beinspesifikke eller til og med stedsspesifikke i samme bein ^2,3,4.

Anvendelsen av kraft til et objekt (f.eks. bein) fører til at objektet gjennomgår akselerasjon, deformasjon eller begge deler, avhengig av objektets grenseforhold. Når beinet er begrenset, motstår en motsatt kraft av samme størrelse akselerasjonen av beinet, og deformasjon oppstår. Når beinet opprettholder deformasjon, genereres indre motstand kalt stress, hvorav det er to grunnleggende typer: Normal kraft, i form av spenning eller kompresjon, og skjærkraft¹⁰. Ofte genereres en kombinasjon av de grunnleggende typer stress, avhengig av det påførte kraftsystemet¹⁰. Styrken til et materiale er dets evne til å motstå stress uten å svikte. Etter hvert som stadig større krefter påføres et materiale, gjennomgår det til slutt permanent deformasjon, og da sies det å ha gått over fra en elastisk tilstand (dvs. vil gå tilbake til sin opprinnelige form hvis kraften fjernes) til en plastisk tilstand (dvs. vil ikke gå tilbake til sin opprinnelige form hvis kraften fjernes)¹¹. Punktet hvor overgangen fra en elastisk tilstand til en plastisk tilstand oppstår kalles utbyttepunktet. Etter hvert som enda større krefter påføres materialet utenfor flytepunktet, opprettholder det i økende grad mikrofrakturer (dvs. skade) til total fraktur oppstår; På dette punktet skal materialet ha sviktet^11,12. Brudd på et bein representerer en svikt både på strukturelt nivå og vevsnivå¹⁰. Som et eksempel skjer brudd på et vertebralt bein fordi ikke bare flere trabeculae mislykkes på et strukturelt nivå, men det er også en svikt i ekstracellulære matrikselementer som kollagen og hydroksyapatitt krystaller i en individuell trabecula på vevsnivå.

De mekaniske hendelsene som fører til svikt i et materiale kan måles ved hjelp av en rekke testmetoder. Trepunktsbøyning er en vanlig metode for å teste de mekaniske egenskapene til lange bein fra det appendikulære skjelettet. Denne metoden er enkel og reproduserbar, noe som gjør den til den foretrukne metoden for biomekanisk testing for mange forskere¹³. Ved å senke en krysshodebjelke på midtdiafysen av et langt bein som hviler på to nedre støttebjelker, tester denne metoden spesifikt de mekaniske egenskapene til midtdiafyseområdet, som er tett organisert kortikal bein. Fra last-forskyvningskurver kan strekkkrafteffekter på elastisitet, seighet, kraft til svikt og overgangen fra elastisk til plastisk oppførsel av beinmaterialer, blant andre egenskaper, bestemmes.

I den andre typen bein, referert til som trabekulær, svampete, vevd eller avstøtende bein, dannes beinelementer til en rekke stenger og bjelker kalt trabeculae, noe som gir et "svampete" utseende. De viktigste vertebrale legemene (dvs. centra) er rike på avbrytende bein og er ofte stedet for aldersrelaterte kompresjonsbenfrakturer hos mennesker¹⁴. Lumbale (dvs. nedre rygg) ryggvirvler er de største ryggvirvlene, bærer mesteparten av kroppens vekt, og er det vanligste stedet for vertebrale brudd^15,16. De mekaniske egenskapene til virvellegemer kan best vurderes direkte ved hjelp av uniaxiale kompresjonstestmetoder, siden aksial kompresjon er den normale kraftbelastningen som påføres vertebrale kolonner in vivo¹⁷. Kompresjon av vertebrale legemer in vivo oppstår som et resultat av muskel- og ligamentkontraksjoner, tyngdekraften og jordreaksjonskrefter¹⁸.

Ex vivo kompresjonstesting av vertebra for små dyr kan være vanskelig på grunn av deres lille størrelse, uregelmessige form og skjøthet. Formen på virvellegemene kan beregnes som et parallellogram med lett ventral helning og lett kranial konkavitet¹⁷. Denne formen gir utfordringer for å oppnå uniaxial kompresjonstesting ex vivo fordi uten tilstrekkelig forberedelse til lasteoverflaten vil trykkkrefter bli påført bare en del av lasteoverflaten, noe som resulterer i en "lokal kontakt"^17,19. Dette kan føre til inkonsekvente resultater og for tidlig svikt¹⁹. Dette er ikke tilfelle in vivo fordi lasteflaten er omgitt av mellomvirvelskiver i vertebralleddene, noe som gjør at lasten kan fordeles gjennom kranialenden. Det intervertebrale skivekraniale endeplatekomplekset spiller en viktig rolle i anvendelsen av kraft gjennom vertebrallegemet og biomekanikken til brudd på vertebrallegemet^14,20. Selv om kompresjonstesting ikke er nytt innen biologi, er det begrensninger i dagens metoder for mekanisk testing av bein. Disse begrensningene inkluderer mangelen på prediktormodeller og simuleringer for beinmekanikk, unik geometrisk romlig arkitektur og til og med iboende prøvebaserte biologiske variasjoner²¹. Enda viktigere er det at feltet utfordres av manglende standardisering mellom metoder og generell mangel på rapporterte metoder i litteraturen²².

Det er to metoder rapportert i litteraturen for fremstilling av lumbale ryggvirvler hos gnagere for å oppnå uniaxial kompresjonstesting: skjæremetoden og innebyggingsmetoden 17,19,23,24,25,26. Skjæremetoden krever at vertebrale prosesser, kraniale endeplater og kaudale endeplater kuttes fra vertebrallegemet. Pendleton et ^al.19 har tidligere rapportert en detaljert metode for bruk av denne metoden på musens lumbale ryggvirvler. Denne metoden gir utfordringene med å oppnå perfekt parallelle kutt på både kaudale og kraniale endeplater, samtidig som man unngår skade på prøven. Det har også begrensningen at kranialendeplaten fjernes. Den kraniale endeplaten inneholder et tett skall av kortikalt ben og spiller en viktig rolle i fordelingen av belastninger fra mellomvirvelskivene in vivo og er involvert i svikt i benet for in vivo frakturer 17,20,27. I motsetning til dette innebærer innebyggingsmetoden å fjerne vertebrale prosesser mens den kraniale endeplaten til vertebrallegemet holdes intakt. Lasteflaten gjøres deretter omtrent horisontal ved å plassere en liten mengde beinsement på kranialenden av virvellegemet. Denne metoden har fordelen at den overvinner de tekniske utfordringene forbundet med skjæremetoden og kan bedre etterligne mekanismen for belastningsapplikasjon og beinsvikt in vivo på grunn av bevaring av kranialendeplaten. Denne tilnærmingen har tidligere blitt dokumentert i studier som involverer uniaxial kompresjonstesting på rottebein. Men så vidt vi vet, er det ikke tidligere dokumentert i sammenheng med mindre mus lumbale ryggvirvler 17,25,26. Den aktuelle metoden ble tidligere beskrevet av Chachra et ^al.25 og brukte opprinnelig en beinprøve holdt mellom to plater, hver med et sylindrisk hulrom, som deretter ble fylt med polymetylmetakrylat (PMMA). Den samme forskergruppen forbedret senere metoden der den ene enden er forsiktig slipt (caudal), og den andre enden har en liten flekk av beinsement tilsatt (kranial)²⁶. Denne metoden er en forbedring av den forrige metoden fordi den minimerer materialet mellom platenene og er fokus for denne artikkelen. Til tross for utfordringene knyttet til uniaxial vertebral kompresjonstesting, er det en metode som kan gi verdifull informasjon om effekten av en foreslått terapi på bein, spesielt når den er parret med trepunktsbøyning.

Her presenteres bruken av en konvertibel trepunkts bøynings-/kompresjonstestmaskin for enkel testing av både lange bein og vertebrale legemer ved hjelp av en enkelt maskin. Videre presenteres bruk av en innebyggingsmetode for å oppnå uniaxial kompresjonstesting av musens lumbale ryggvirvler. Denne studien ble utført som en del av en større studie som hadde som mål å undersøke påvirkningen av kosttilskudd av hampfrøtilskudd på egenskapene til skjelettben hos unge, voksende kvinnelige C57BL / 6-mus ^5,6. Den trepunkts bøyetesteren ble opprinnelig konstruert av fakultet og studenter i Engineering Dept. ved Colorado State University-Pueblo og brukt av vår forskningsgruppe i trepunkts bøyetester på lange bein [rotte femur og tibia⁷ og mus humerus, lårben og tibia 5,6,8,9 ]. Imidlertid ble dens modifikasjon og anvendelse for bruk i musens vertebrale kroppskompresjonstesting ikke blitt utforsket. Utformingen og konstruksjonen av trepunkts bøyemaskinen er tidligere beskrevet⁷. Denne rapporten vil fokusere på metoder som brukes til å modifisere maskinen for komprimeringstesting og korrigere for systemforskyvning. For det andre beskrives innebyggingsmetoden for overflatebehandling av musens vertebrale kroppsbelastning, sammen med metoder for uniaxial kompresjonstesting og analyse av lastforskyvningsdata.

Protocol

Alle eksperimenter og protokoller ble utført i samsvar med veiledningen for omsorg og bruk av forsøksdyr fra National Institutes of Health og mottatt godkjenning fra Colorado State University-Pueblo Institutional Animal Care and Use Committee (protokollnummer: 000-000A-021). Detaljerte prosedyrer for dyrestell er tidligere beskrevet ^5,6. Musene ble oppnådd ved tre ukers alder som en del av en bredere studie som tar sikte på å undersøke effekten av et hampfrøsupplert diett på unge, voksende kvinnelige C57BL / 6-mus (se materialtabell). Fra 5 til 29 ukers alder ble musene oppdratt på en av tre dietter: kontroll (0% hampfrø), 50 g / kg (5%) hampfrø eller 150 g / kg (15%) hampfrø, med åtte mus per gruppe ^5,6. Gjennom studien hadde mus ad libitum tilgang til deres respektive dietter og vann, ble parplassert i polykarbonatbur og opprettholdt på en 12 timers lys: 12 timers mørk syklus (med lys på fra 06:00 til 18:00 h). Musens vekt og helse ble vurdert ukentlig, og alle mus fullførte studien uten å utvikle noen negative helsemessige forhold. Ved tjueni ukers alder ble musene dypt bedøvet ved hjelp av isofluran gass og avlivet via cervikal dislokasjon ^5,6. Det ble gjort et midtlinjesnitt på ventraloverflaten fra sternum til hale, og alle intratorakale, peritoneale og retroperitoneale organer ble fjernet fra kadaverene. De utviskerte skrottene ble konservert i 0,9 % natriumkloridoppløsning ved -70 °C frem til tidspunktet for bendisseksjon for vertebratesting, som skjedde omtrent ett år senere.

1. Konvertering av en trepunkts bøyemaskin til en kompresjonstestmaskin

1. Skru av krysshodebjelken som er festet til lastsensoren på trepunkts bøyemaskin⁷ (se materialfortegnelse) (figur 1A,B).
2. Skru en selvjusterende toppplate på lastsensoren (se Materialfortegnelse) med gjenger identisk med tverrhodebjelken (figur 1C).
3. Bor to horisontale hull i hver av de nedre støttene, hvor bunnplaten vil bli festet senere (figur 1D).
4. Tap tråder inn i de to sidene av en bunnplate i rustfritt stål for å justere seg med de borede hullene i de nedre støttene (figur 1E).
5. Fest bunnplaten til de to nedre støttene ved hjelp av gjengede sekskantskruer og stram til den sitter godt fast (figur 1F).
   MERK: Sekskantskruer må ha gjenger som matcher de tappede hullene på de nedre støttene og topp/bunnplatene. Bruken av en selvjusterende toppplate kan bidra til å oppnå jevn kontakt mellom toppplaten og lasteflaten, men det er ikke tilstrekkelig gitt konkavitet i kranialenden av virvellegemer. Ytterligere forberedelse ved bruk av en lastoverflatepreparasjonsmetode er nødvendig. Når du konstruerer en kompresjonstestmaskin for små dyrben, som er mindre og svakere enn mange industrielle / tekniske materialer, er det viktig å vurdere lastsensorens lastekapasitet og størrelsen på lastrammen. I tillegg bør maskiner rengjøres og smøres regelmessig for å sikre nøyaktige resultater og jevn drift.

2. Korrigere for forskyvning av kompresjonstestmaskinen

1. Uten testmateriale mellom toppplaten og bunnplaten, senk toppplaten ned på bunnplaten til det er oppnådd lett kontakt (~0,3-0,5 N forspenningskraft).
2. Slå på maskinen med konstant senkehastighet (~1 mm/min) for å starte kompresjonstestingen. Samle inn belastnings- (N) og forskyvningsmålinger (mm) ved hjelp av digital datainnsamlingsprogramvare (se Materialliste) for datainnsamling av mekanisk testing.
   MERK: Siden det ikke er noe materiale mellom topp- og bunnplaten, vil all observert forskyvning skyldes forskyvning av maskinen alene (_Δx-maskin) (ramme, lastcelle, platen, koblinger, etc.).
3. Fortsett å senke toppplaten på bunnplaten med konstant (dvs. monoton) hastighet til krefter høyere enn det som vil bli oppnådd fra alle beinprøver er nådd.
4. Gjenta trinn 2,1 til 2,3 totalt tre ganger.
5. Plott dataene for systemforskyvning (Δx-maskin, mm) vs. påført belastning (Force, N).
6. Tilpass en regresjonslinje som passer best til dataene (figur 2A-D).
7. I et regneark med dataene fra en beinkompresjonstest, bruk ligningen gitt av regresjonsanalysen for å bestemme mengden maskinforskyvning (Δx-maskin) som påvirker den registrerte forskyvningen (Δx_{totalt registrert}) for et datapunkt i en mus lumbal vertebra kompresjonstest.
   MERK: Tenk deg for eksempel et datapunkt der 18 N kraft påføres, og 2.730 mm forskyvning er registrert (Δx_{totalt registrert}). I henhold til eksemplet tredjeordens polynomregresjonsligning (figur 2D) [Δx-maskin = (4 × 10-7 x anvendt belastning³) - (8 × 10-5 x anvendt belastning²) + (0,0044 x anvendt belastning)], skyldes 0,056 mm av den registrerte forskyvningen maskinforskyvning (_Δx-maskin).
   Δx_{totalt registrert = Δx-maskin} + _Δx-prøve
8. Rett opp den registrerte forskyvningen for datapunktet.
   MERK: Tenk for eksempel på eksemplet ovenfor. Hvis 2.730 mm forskyvning registreres (Δx_{totalt registrert}) og maskinforskyvning ₍Δx-maskin) står for 0.056 mm av totalen, er forskyvningen som prøven (dvs. bein) av interesse gjennomgikk (Δx-prøve) 2.664 mm. Dermed er 2.664 mm den faktiske forskyvningen som vertebraen gjennomgikk (Δx-prøve) og er verdien som skal brukes til belastning-forskyvningskurveanalyse.
   _Δx-prøve = Δx_{totalt registrert - Δx-maskin}
9. Gjenta trinn 2,7–2,8 for hvert datapunkt som samles inn for hvert enkelt eksemplar (bein).
   MERK: Dette trinnet er viktig fordi under kompresjonstesting er den observerte forskyvningen ikke bare på grunn av forskyvning av prøven, men i stedet er den observerte forskyvningen en kombinasjon av maskinforskyvning (_Δx-maskin) (f.eks. kompresjon/forskyvning av rammen, lastcellen, platenene, koblingene osv.) og prøven (Δx-prøven). For prøver som gjennomgår relativt små mengder forskyvning, for eksempel fra et lite dyr (f.eks. Mus), kan systemforskyvning (_Δx-maskin) forårsake store feil. Prosedyrene beskrevet her for å korrigere for systemforskyvning ble tidligere rapportert av Kalidindi og Abusafieh²⁸, som også beskriver to andre metoder i tillegg til den som er beskrevet her. Noen forskere har blitt notert å bruke mer enn én metode for å bestemme systemforskyvning¹⁷. Hver maskin kan vise unike mønstre og grader av systemforskyvning når belastninger påføres den. Av denne grunn må korreksjonsfaktoren for systemforskyvning bestemmes for hver maskin og vil ikke være den samme mellom to maskiner. I motsetning til kompresjonstesting av et virvelbein, vil det ikke bli observert en stor kraftreduksjon ved måling for systemforskyvning fordi det ikke er noe materiale mellom topp- og bunnplaten.

3. Disseksjon av 5 ^lumbale vertebra (L5) fra musekroppen

1. Tine frossen musekroppe ved romtemperatur, pass på å holde bløtvev og bein hydrert ved regelmessig å påføre en isotonisk løsning på 0,9% NaCl.
2. Lag et lite (<0,5 cm) snitt i huden på dorsalens midtlinje nær bunnen av halen, forleng deretter kuttet over hvert bakben og trekk forsiktig for å fjerne pelsen fra bunnen av halen til dyrets hode.
3. Klipp bort bukveggsmuskulaturen til ryggsøylen er lett synlig.
4. Under et dissekerende mikroskop, visualiser de to sacroiliac leddene og kranialenden av sakrummet.
5. Bruk et barberblad eller skalpell, gjør et fint kutt for å skille den siste lumbale vertebraen (L6) fra kranialenden av korsbenet.
6. Igjen, skjær mellom det intervertebrale rommet, fjern L6 og L5 fra virvelsøylen, sett til side L5 for analyse (figur 3).
7. Inspiser vertebraen under et dissekerende mikroskop og fjern alt bløtvev fra beinet, inkludert mellomvirvelskiven, ved hjelp av det meste gasbind pads og forsiktig med tang der det er nødvendig.
   MERK: I denne studien ble L5 valgt som vertebra av interesse, men andre lumbale ryggvirvler kan velges for kompresjonstesting.

4. Klargjøring av L5 vertebra lasteoverflate for uniaxial kompresjonstesting ved bruk av PMMA bensementinnebyggingsmetode

1. Bruk et diamantavskjæringshjul (se materialfortegnelse) festet til et roterende verktøy, og lag et kutt på hver pedicle for å fjerne den tverrgående og spinøse prosessen (figur 4). Hvis de blir festet til sentrum, kan vertebrale prosesser resultere i lokal kontakt med øvre/nedre platen ved selve prosessene, i motsetning til en fordeling av lasten gjennom sentrum.
2. Slip forsiktig den kaudale enden av ryggvirvelen med fint 120-korns sandpapir (se materialfortegnelse) for å fjerne alle mellomvirvelskiver, bløtvev og uregelmessigheter.
3. Merk den slipte kaudale enden med en permanent markør for enkel identifisering senere.
4. Bland PMMA bensement i henhold til produsentens instruksjoner (se materialfortegnelse).
5. Med PMMA-beinsementen fortsatt halvmyk, plasser en minimal mengde på den kraniale (umerkede) enden av vertebraen vendt opp, slik at hele overflaten er dekket mens vertebraen sitter i et saltbad for å holde beinprøven hydrert og kjølig.
6. Mens PMMA fortsatt er halvmyk, plasserer du ryggvirvelen på bunnplaten med den kaudale (markerte) siden vendt ned (figur 5).
7. Slå på maskinen for å koble inn drivgirene og senk toppplaten sakte ned på vertebraen + PMMA beinsementkomplekset til det kommer kontakt med beinsementen og minimal kraft (<0,5 N) påføres for å fordele PMMA jevnt på beinoverflaten. Den øverste platen i nøytral posisjon kan estimeres som horisontal, og når den presses på halvmyk PMMA, vil PMMA fylle konkavitet på kranialenden av vertebraen og danne en flat horisontal overflate under toppplaten.
8. Med toppplaten forsiktig presset ned på PMMA-beinsementen, la prøven sitte uforstyrret til PMMA-beinsementen har herdet fullstendig (~10 min i henhold til produsentens instruksjoner for PMMA-beinsementen som ble brukt i denne studien). Hold prøven i et saltvannsbad eller mist det ofte med saltvann i denne perioden for å holde prøven hydrert og kjølig.
9. Når PMMA-beinsementen er fullstendig herdet, kan kompresjonstestingen begynne. Samle inn data for belastning (dvs. kraft) (N) og forskyvning (dvs. avbøyning) (mm) fra sensorene til et regneark i sanntid ved hjelp av digital programvare designet for datainnsamling av mekanisk testing (se Materialtabell).
10. Etter baseline datainnsamling i 5 s, påført ved en minimal forspenningskraft på <0,5 N, begynner du å senke toppplaten på prøven ved en enkelt (dvs. monoton), forhåndsbestemt senkningshastighet for å starte kompresjonstesten (~ 1 mm / min).
11. Stopp innsamlingen av data når en stor reduksjon i belastning (N) er observert, noe som indikerer materialfeil.
    MERK: Produsentens instruksjoner vil spesifisere omtrentlig herdetid for PMMA bensement. Herdetid for PMMA bensement kan variere avhengig av hvilken type PMMA bensement som brukes. Følg produsentens instruksjoner for å bestemme ventetiden for PMMA-herding. Men som en indikator på at PMMA-beinsementen har herdet fullstendig, kan en ekstra prøve av PMMA-beinsementen blandes samtidig med prøven som skal plasseres på ryggvirvelen, men holdes til side og kontrolleres for å se om den fortsatt er myk eller helt herdet. Hvis det er helt herdet, kan dette indikere at PMMA på beinet også er fullstendig herdet uten å forstyrre beinet + PMMA-komplekset. Benprøven må forbli godt hydrert og kjølig gjennom PMMA-herding og testperioder. Så lite som noen få minutters eksponering for tørr luft kan føre til endringer i de biomekaniske egenskapene. Noen forskere bruker kompresjonstestmaskiner utstyrt med saltvannsbad¹⁹. Kompresjonstestmaskinen hadde ikke saltvannsbad i denne studien. I stedet ble en fin tåke av saltvann regelmessig påført gjennom PMMA-herdingsperioden og testperioden.

5. Analyse av last-forskyvningskurver for L5 vertebra uniaxial kompresjonstester

1. Kopier og lim inn innlastede (N) og korrigerte forskyvningsdata (mm) fra regnearket til et teknisk grafisk og dataanalyseprogram (se Materialfortegnelse).
2. Generer en graf med belastning (N) på y-aksen og korrigert prøveforskyvning (Δx-prøve, mm) på x-aksen (figur 6). Gjør dette i programvaren ved først å klikke på Windows, Ny tabell, og gjør det for å lage et bord. Kopier korrigerte forskyvningsdata (mm) og last inn (N) data fra regnearket med rådata til den nye tabellen.
3. Deretter genererer du en bølgeform for å representere rådata ved å klikke på Data, deretter klikke på XY Pair to Waveform og velge korrigerte forskyvningsdata for X-Wave og lastdata for Y-Wave. Forsikre deg om at riktig antall datapunkter er i "Antall poeng" -boksen, navngi bølgeformen, og klikk deretter på Lag bølgeform. Når en bølgeform er laget, generer en graf ved å klikke på Windows, deretter New Graph, og plasser bølgeformen på Y-aksen og "beregnet" på X-aksen.
4. Bruk markørverktøyet til å markere punkter/regioner av interesse i grafen for analyse. Noen av punktene/områdene av interesse for å beregne vanlige helbensmekaniske egenskaper er nevnt i trinn 5.4-5.8 (figur 6), og inkluderer arbeids-til-svikt (N x mm), maksimal belastning (N), stivhet (N/mm), flytegrensebelastning (N) og forskyvning etter utbytte (mm).
5. For beregning av arbeids-til-svikt (N x mm), plasser en markør (A) ved starten av testen og en markør (B) på punktet umiddelbart før materialet svikter (dvs. ved maksimal belastning nådd under testen før en stor reduksjon i belastning observeres).
   MERK: Dermed vil markører A-B brakette hele testen fra når materialet begynner å motstå krefter og gjennomgå forskyvning til det punktet der materialet svikter. Arbeid-til-svikt (N x mm) kan måles som det totale arealet under kurven (dvs. området under kurven mellom markørene A og B).
6. Beregn maksimal belastning (N) som den høyeste verdien for belastningen som observeres under testen (dvs. belastning ved markør B).
7. Beregn materialets stivhet (N/mm) som helningen til det lineære elastiske området (dvs. hellingen mellom markørene C og D).
8. Flytelasten (N) er belastningen der last-forskyvningskurven avviker fra lineariteten og går inn i plastområdet, og dermed opprettholder permanent deformitet (dvs. belastning ved punkt D). Beregn dette ved å måle belastningen ved markør D.
9. Forskyvningen etter utbytte (mm) er en indikator på materialets duktilitet. Mål dette som forskyvningen mellom flytepunktet og punktet for materialsvikt (dvs. forskyvningen mellom markørene D og B).
   MERK: Parametrene som er oppført ovenfor er bare noen av de vanlige helbensmekaniske egenskapene som er rapportert. Det er ikke en komplett liste over alle helbens mekaniske egenskaper som kan fås fra en lastforskyvningskurve. Andre helbens mekaniske egenskapsparametere inkluderer total forskyvning (mm), elastisk energi absorbert (N x mm), elastisk forskyvning (mm), plastisk energi absorbert (N x mm) og plastforskyvning (mm), for å nevne noen. Videre er vevsnivå beinmekaniske egenskaper ikke oppført; Disse krever datatransformasjoner ved hjelp av spesifikke anatomiske målinger, for eksempel beindiameter. Eksempelkode for å gjøre målingene fra last-forskyvningskurven i programvaren er oppført i tilleggsfil 1.

Representative Results

Med denne trinnvise protokollen som bruker innebygging av L5-lasteoverflaten og en konvertibel trepunkts bøyemaskin / kompresjonstestmaskin, er det mulig å utføre kompresjonstesting på musens lumbale vertebra for sammenligninger mellom grupper. Totalt tjuefire mus L5 ryggvirvler ble fremstilt ved hjelp av innebyggingsmetoden. Tre av prøvene ble imidlertid skadet under fjerning av vertebrale prosesser ved hjelp av et diamantavskjæringshjul på et roterende verktøy og ble dermed ikke testet. Gitt dette ble de oppførte mekaniske egenskapene vellykket oppnådd fra tjueen av tjuefire prøver ved bruk av innebyggingsmetoden. Prøver ble visuelt inspisert etter hver test, og PMMA-hetten fikk ingen skade i noen av testene. Som nevnt var musene som ble brukt i denne studien en del av en større studie som tok sikte på å bestemme effekten av dietthampfrø på beinene til unge og voksende C57BL / 6 kvinnelige mus. Deskriptiv statistikk over fem vanlig rapporterte helbensmekaniske egenskaper tilbys i tabell 1. Last-forskyvningskurvene for alle tjueen prøver er gitt i figur 7.

Figur 1: Konvertering av en trepunkts bøyemaskin til en kompresjonstestmaskin. (A) Maskinen fullt utstyrt for å fungere som en trepunkts bøyemaskin med fortrengningssensoren og lastsensoren angitt (hvite piler). (B) Maskinen etter at krysshodebjelken er fjernet. (C) Maskinen etter en selvjusterende toppplate er plassert der tverrbjelken tidligere var plassert. (D) De nedre støttebjelkene med hull boret inn i dem. (E) Bunnplaten i rustfritt stål med fire gjengede hull tappet inn i den, og en skrue delvis skrudd inn i et av hullene. De to andre hullene som ikke er sett på bildet er på motsatt side. (F) De nedre støttebjelkene med bunnplaten festet til dem med fire sekskantskruer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Et eksempel på systemforskyvning (Δx-maskin) vs. lastplott utstyrt med lineær (A), logaritmisk (B), andreordens polynom (C) og tredjeordens polynom (D) regresjon. I dette eksemplet gir tredjeordenspolynomet den beste tilpasningen per R^2-verdi, og regresjonen brukes som korreksjonsfaktor for systemforskyvning. Bilder representerer eksempeldata for å demonstrere regresjonstilpasning og må innhentes av forskere for individuelle maskiner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Lumbalcolumna med mus. Lumbalcolumna mus under dissekerende mikroskop før L6 ble fjernet (A), og etter at L6 var fjernet, slik at L5 var festet (B). L5 vil deretter bli fjernet og klargjort for kompresjonstesting. De hvite fargede båndene er mellomvirvelskivene som ble dissekert og fjernet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Anatomi av L5 vertebra. En representativ mus L5 vertebra i kraniale, caudal, dorsale og ventrale visninger under et dissekerende mikroskop. Viktige dimensjoner for vertebral kroppen inkluderer høyde, dorsoventral bredde og lateral bredde, som vist ved de fargede linjene. De svartstiplede linjene viser omtrent hvor det skal kuttes for å fjerne virvelprosessene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Herdeperiode for PMMA beinsement. Et eksempel L5 vertebra med PMMA bensement (grønn) plassert på kraniale endeplaten og toppplaten senket ned på PMMA beinsement + benkompleks. Når PMMA bensement er fullstendig herdet, vil kompresjonstesten begynne. Den øverste platen vil bli ytterligere senket til svikt i materialet er observert. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: Mus vertebral bein kompresjonstest belastning-forskyvning kurve og dataanalyse. Markør A markerer starten på kompresjonstesten. Markør B markerer poenget med materialsvikt. Markør C markerer starten på det lineære elastiske området, mens markøren D markerer slutten (dvs. flytepunktet). Området skyggelagt i lysegrått er det lineære elastiske området, hvor materialet vil gå tilbake til sin opprinnelige form hvis lasten fjernes. Området skyggelagt mørkegrå er plastområdet, hvor materialet har gjennomgått permanent deformitet og vil ikke gå tilbake til sin opprinnelige form hvis lasten fjernes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 7: Last-forskyvningskurver for alle tjueen beinprøver. Mønstrene varierte mellom beinene. Generelt var den største variabiliteten i forskyvning etter utbytte, med noen få (n = 5) av beinene som hadde en relativt liten forskyvning etter avkastning og andre (n = 16) som hadde en relativt stor forskyvning etter avkastning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Gruppe	Arbeid til feil (n * mm)	Maksimal belastning (N)	Stivhet (N/mm)	Flytegrense (N)	Forskyvning etter avkastning (mm)
KON (n = 7)	13.43 ± 2.44 A, B	37,93 ± 3,28	109.14 ± 11.86	22,68 ± 2,04	0,34 ± 0,06
5HS (n = 8)	12.12 ± 1,23 A	33,62 ± 2,43	99,70 ± 16,62	20,88 ± 2,69	0,38 ± 0,08
15HS (n = 6)	19.55 ± 2.13 B	41,82 ± 1,85	134,58 ± 19,73	28.07 ± 3.20	0,51 ± 0,07
Kombinerte grupper (n = 21)	14,68 ± 1,27	37.40 ± 1,63	121,82 ± 9,43	23.54 ± 1,60	0,40 ± 0,04

Tabell 1: Representative verdier for ofte rapporterte helbensmekaniske egenskaper oppnådd ved hjelp av innebyggingsmetoden for lastoverflatepreparering. Verdier ble oppnådd ved hjelp av alle protokollene som er beskrevet i denne studien. Dermed representerer verdiene de som kan oppnås ved hjelp av metodene beskrevet her. Verdier er midler ± SEM. Grupper representerer C57BL / 6 kvinnelige mus matet en diett beriket med hel hampfrø i konsentrasjoner på 0% (CON), 50 g / kg (5%) (5HS) eller 150 g / kg (15%) (15HS) fra alderen 5-29 uker. For en av parameterne (arbeid-til-svikt) ser det ut til at kostholdet påvirket verdiene per enveis ANOVA (p < 0,05). Verdier som deler samme bokstav hevet skrift er ikke signifikant forskjellige (p > 0,05), mens verdier med hevet skrift på forskjellige bokstaver er signifikant forskjellige (p < 0,05), per Tukey-Kramer post hoc-analyse.

Tilleggsfil 1: Eksempelkode for å oppnå mekaniske egenskaper i hele beinet. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Målet med denne studien var å beskrive konstruksjonen av en konvertibel trepunkts bøyemaskin / kompresjonstestmaskin, samt bruk av en PMMA beinsementinnebyggingsmetode for fremstilling av musens lumbale ryggvirvlprøver før uniaxial kompresjonstesting. Deskriptiv statistikk ble innhentet og rapportert for beinprøvene, noe som vil være nyttig for sammenligning i fremtidige studier. Noen av de mest rapporterte helbensmekaniske egenskapene ble analysert i denne studien. Det er imidlertid verdt å merke seg at det er flere ekstra mekaniske egenskaper på hele bein og vevsnivå som ikke ble undersøkt her.

Det er fortsatt uklart hvordan de mekaniske egenskapene oppnådd fra prøver fremstilt ved hjelp av innebyggingsmetoden sammenligner med de som er fremstilt ved bruk av skjæremetoden for mus lumbale ryggvirvler. Schumancher¹⁷ har tidligere vurdert de mekaniske egenskapene til rottevirvler fremstilt ved hjelp av de to forskjellige metodene og fant at ryggvirvler fremstilt ved hjelp av innebyggingsmetoden hadde signifikant lavere stivhet, høyere utbytteforskyvning og høyere utbyttebelastning enn prøver fremstilt ved hjelp av skjæremetoden. Ytterligere karakterisering er nødvendig for å forstå hvordan de vertebrale mekaniske egenskapene til mus eller andre dyremodeller sammenligner når de måles ved hjelp av de to forskjellige metodene for lasting av overflatebehandling. Det forventes at noen parametere varierer mellom ryggvirvler fremstilt ved hjelp av forskjellige metoder, gitt at innebyggingsmetoden legger materiale til prøven, men bevarer endeplaten, som er en viktig struktur i vertebrale brudd in vivo^17,27. Tilsetningen av beinsement til kranieenden gir høyde til prøven, mens kutting av endeplatene fjerner høyde, endrer størrelsesforholdet og endrer dermed mekaniske egenskaper som stivhet. Videre, selv om PMMA er stivere enn vertebral avbrytende bein, er det mulig at PMMA gjennomgår forskyvning, og omfanget av denne forskyvningen trenger ytterligere karakterisering. I tillegg er det uklart hvordan resultatene oppnådd fra enten innebyggingsmetoden eller skjæremetoden sammenligner med spådommer om beinparametere ved bruk av endelig elementanalyse for musevirvler eller hvordan resultatene varierer under forskjellige forhold (f.eks. Senkingshastighet, forskjellige vertebrale nivåer, PMMA-sammensetninger). Likevel, fordi alle prøver er fremstilt på samme måte, er denne metoden hensiktsmessig og muliggjør en enkel og kostnadseffektiv måte å sammenligne mellom behandlingsgrupper i en enkelt studie der prøver fremstilles og testes under lignende forhold.

Når det gjelder prøvepreparering før kompresjonstesting, er det viktig å forberede prøver på en reproduserbar måte. En mulig begrensning av metoden beskrevet i denne studien er bruken av et roterende verktøy for å fjerne vertebrale prosesser. En annen metode for å fjerne vertebrale prosesser av mus lumbale vertebrae har blitt beskrevet av Pendleton et ^al.19, noe som kan muliggjøre mer konsistent prøvepreparering. Videre kan det oppstå uoverensstemmelser ved påføring av PMMA beinsement. Derfor er det viktig å påføre beinsementen konsekvent når det gjelder volum, plassering og herdetid. Innebyggingsmetoden kan imidlertid gi en enklere måte å oppnå konsistent prøvepreparering på sammenlignet med skjæremetoden, da det kan være utfordrende å oppnå helt jevne, parallelle kutt konsekvent mellom alle prøvene på grunn av deres lille størrelse og skjørhet. Fremtidige studier vil være nødvendig for å vurdere presisjonen av resultater oppnådd fra prøver utarbeidet ved hjelp av innebygging vs. skjæremetode.

Som nevnt er det behov for ytterligere karakterisering og undersøkelse av innebyggingsmetoden for prøvepreparering av musens lumbale ryggvirvler før uniaxial kompresjonstesting. Likevel viser denne studien at en slik metode kan benyttes, gir en detaljert beskrivelse av den foreslåtte metoden, og gir beskrivende statistikk over parametrene målt fra prøver utarbeidet ved hjelp av metoden. Denne protokollen er verdifull for feltet på grunn av den nåværende mangelen på tilgjengelig metodikk. Videre kan denne metoden bedre etterligne mekanismen der in vivo vertebrale frakturer oppstår sammenlignet med andre metoder^17,27. Metoden har også fordelen av å overvinne de tekniske vanskelighetene forbundet med andre for tiden rapporterte metoder, noe som gjør uniaxial kompresjonstesting mer gjennomførbar i beinforskning. Dette er spesielt viktig fordi narkotika, dietter eller andre inngrep kan påvirke kortikale rike bein (f.eks. Lang bein midt i diafysen) og trabekulære bein (f.eks. Vertebrale legemer) annerledes, men trepunktsbøyning er den dominerende metoden for å vurdere de mekaniske egenskapene til bein¹³. Kombinasjonen av trepunkts bøying og uniaxial kompresjonstesting kan bli enda lettere oppnåelig ved bruk av en konvertibel trepunkts bøying / kompresjonstestmaskin. Dermed foreslår denne studien to mulige måter å gjøre vurderingen av både kortikal rik og trabekulært bein i samme studie mer tilgjengelig for forskere, noe som potensielt fører til en bedre forståelse av hvordan en gitt behandling påvirker forskjellige beintyper mellom eksperimentelle grupper.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
120-Grit Sand Paper	N/A	N/A	For removal of caudal end plate soft tissues and irregularities
24-bit Load Cell Interface	LoadStar Sensors, Freemont, California, USA	DQ-1000	To connect load and displacement sensors to personal coputer
Base Mouse Diet	Dyets, Inc, Bethlehem, PA, USA	AIN-93G	Diet the mice were fed, without added hempseed
Diamond Cutoff Wheel w/ Rotary Tool	Dremel US, Mt. Prospect, Illinois, USA	F0130200AK	To remove vertebral proccesses
Displacement Sensor	Mitutoyo, Aurora, Illinois, USA	ID-S112EX	Displacement sensor with 0.001 mm resolution and 0.00305 mm accuracy
External Variable Voltage Power Source	Extech Instruments, Nashua, New Hampshire, USA	382213	To provide power to compression testing machine
Female C57BL/6 Mice	Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts, USA	027 (Strain Code)	Mouse model used in present study
Hempseed	Natera, Pitt Meadows, Canada	670834012199	Hempseed added to Base Mouse Diet
Igor Pro Software (Version 8.04)	Wave Metrics, Portland, Oregon, USA	N/A	Sofware used for load-displacement curve analysis
iLoad Mini Force Sensor	LoadStar Sensors, Freemont, California, USA	MFM-010-050-S	Load (force) sensor with 1.0% accuracy
Isotonic (0.9%) Saline Solution	N/A	N/A	To keep bone sampels hydrated
Leica EZ4 W Miscoscope	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	NC1601884	For bone dissections and vertebral process removal
Microsoft Excel Software	Microsoft Corporation, Redmond, Washington, USA	N/A	For data transfer from SensorVue software
PALACOS R Bone Cement	Hareus Medical, Wehreim, Germany	00-1112-140-01	PMMA bone cement for embedding of the loading surface
Personal Computer	N/A	N/A	For data recording (see 24-bit Load Cell Interface, SensorVue Software, Microsoft Excel Software) and analysis (see Igor Pro Software)
SensorVue Software	LoadStar Sensors, Freemont, California, USA	N/A	Software used for real-time data collection during compression testing
Small Animal Dissecting Kit	N/A	N/A	Dissecting scissors, forceps, scalpel, blades, pins, gauze pads
Stainless Steel Top Platen (Self-Alligning) and Bottom Platen Pair	N/A	N/A	Constructed by Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering
Three-Point Bending Machine	N/A	N/A	Constructed by Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering. Refer to Sarper et al. (2014) for further details regarding construction