Teste de Compressão Uniaxial de Vértebras Lombares de Camundongos com Incorporação da Superfície de Carregamento

Summary

Neste protocolo, duas abordagens são descritas para tornar o teste de compressão uniaxial de vértebras lombares de camundongos mais atingível. Primeiro, descreve-se a conversão de uma máquina de dobra de três pontos em uma máquina de ensaio de compressão. Em segundo lugar, um método de incorporação para preparar a superfície de carregamento que usa cimento ósseo é adaptado para vértebras lombares de camundongos.

Abstract

Há uma crescente consciência de que o osso cortical e esponjoso diferem na regulação e resposta a terapias farmacêuticas, terapias hormonais e outros tratamentos para perda óssea relacionada à idade. A flexão de três pontos é um método comum utilizado para avaliar a influência de um tratamento na região médio-diafisária dos ossos longos, que é rica em osso cortical. O teste de compressão uniaxial de vértebras de camundongos, embora capaz de avaliar ossos ricos em osso esponjoso, é menos comumente realizado devido a desafios técnicos. Ainda menos comumente realizado é o emparelhamento de testes de flexão e compressão de três pontos para determinar como um tratamento pode influenciar a região da diáfise média de um osso longo e um centro vertebral de forma semelhante ou diferente. Aqui, descrevemos dois procedimentos para tornar o teste de compressão de vértebras lombares de camundongos um método menos desafiador de ser realizado em paralelo com a flexão de três pontos: primeiro, um procedimento para converter uma máquina de dobra de três pontos em uma máquina de teste de compressão, e segundo, um método de incorporação para preparar uma superfície de carregamento de vértebras lombares de camundongo.

Introduction

As alterações ósseas relacionadas à idade são amplamente reconhecidas como problemáticas devido ao risco aumentado de fraturas ósseas associadas a essas alterações. As fraturas ósseas em humanos podem levar a dor crônica, mobilidade reduzida, incapacidade a longo prazo, aumento do risco de morte e encargos econômicos¹. Terapias comuns investigadas para tratar os sintomas de alterações ósseas relacionadas à idade incluem suplementos alimentares, tratamentos hormonais e medicamentos 2,3,4,5,6,7,8,9. Investigações iniciais de tais tratamentos em seres humanos são comumente feitas usando modelos animais de pequeno porte (por exemplo, ratos de laboratório e camundongos), que possuem os dois principais tipos de ossos encontrados no esqueleto humano¹⁰. Os ossos longos apendiculares, como úmero, fêmur e tíbia, são ricos em osso cortical (isto é, compacto), enquanto as vértebras são ricas em osso esponjoso (isto é, tecido esponjoso ou trabecular)⁴. Há um conhecimento crescente de que os mecanismos de regulação óssea e vias de sinalização diferem entre osso cortical (por exemplo, osso longo médio-diáfise) e osso esponjoso (por exemplo, centro vertebral)². Devido a isso, terapias podem ter efeitos diferenciais que são osteo-específicos ou mesmo sítio-específicos dentro de um mesmo osso ^2,3,4.

A aplicação de força a um objeto (por exemplo, osso) faz com que o objeto sofra aceleração, deformação ou ambos, dependendo das condições de contorno do objeto. Quando o osso é restringido, uma força oposta de igual magnitude resiste à aceleração do osso, e ocorre deformação. À medida que o osso sofre deformação, gera-se uma resistência interna denominada tensão, da qual existem dois tipos básicos: a força normal, na forma de tensão ou compressão, e a força de cisalhamento¹⁰. Muitas vezes, uma combinação dos tipos básicos de tensão é gerada, dependendo do sistema de força aplicado¹⁰. A resistência de um material é a sua capacidade de suportar tensões sem falhar. À medida que forças cada vez maiores são aplicadas a um material, ele acaba sofrendo deformação permanente, momento em que se diz que ele passou de um estado elástico (isto é, retornará à sua forma original se a força for removida) para um estado plástico (ou seja, não retornará à sua forma original se a força for removida)¹¹. O ponto em que ocorre a transição de um estado elástico para um estado plástico é chamado de ponto de rendimento. À medida que forças ainda maiores são aplicadas ao material além do limite de escoamento, ele sofre cada vez mais microfraturas (ou seja, danos) até que ocorra a fratura total; neste ponto, o material teria falhado^11,12. A fratura de um osso representa uma falha tanto em nível estrutural quanto em nível tecidual¹⁰. Como exemplo, a quebra de um osso vertebral acontece porque não só várias trabéculas falham em um nível estrutural, mas também há uma falha de elementos da matriz extracelular, como colágeno e cristais de hidroxiapatita, em uma trabécula individual no nível do tecido.

Os eventos mecânicos que levam à falha de um material podem ser medidos usando uma variedade de métodos de teste. A flexão de três pontos é um método comum para testar as propriedades mecânicas dos ossos longos do esqueleto apendicular. Esse método é simples e reprodutível, tornando-se o método preferido de ensaios biomecânicos por muitos^{pesquisadores13}. Ao abaixar uma viga transversal sobre a diáfise média de um osso longo apoiado em duas vigas de suporte inferiores, este método testa especificamente as propriedades mecânicas da região da diáfise média, que é o osso cortical densamente organizado. A partir de curvas de carga-deslocamento, podem-se determinar os efeitos da força de tração sobre a elasticidade, tenacidade, força à ruptura, transição do comportamento elástico para plástico dos materiais ósseos, entre outras propriedades.

No segundo tipo de osso, referido como trabecular, esponjoso, tecido ou esponjoso, os elementos ósseos são formados em uma matriz de hastes e vigas chamadas trabéculas, dando uma aparência "esponjosa". Os principais corpos vertebrais (i.e., centrais) são ricos em osso esponjoso e são frequentemente os locais de fraturas ósseas por compressão relacionadas à idade em humanos¹⁴. As vértebras lombares (ou seja, lombares) são as maiores vértebras, suportam a maior parte do peso do corpo e são o local mais comum de fraturas vertebrais^15,16. As propriedades mecânicas dos corpos vertebrais podem ser melhor avaliadas diretamente usando métodos de ensaio de compressão uniaxial, uma vez que a compressão axial é a carga de força normal imposta às colunas vertebrais in^vivo17. A compressão dos corpos vertebrais in vivo ocorre como resultado das contrações musculares e ligamentares, da força da gravidade e das forças de reação do solo¹⁸.

O teste de compressão ex vivo de vértebras de pequenos animais pode ser difícil devido ao seu pequeno tamanho, forma irregular e fragilidade. A forma dos corpos vertebrais pode ser estimada como um paralelogramo com leve inclinação ventral e discreta concavidade^craniana17. Esta forma apresenta desafios para a realização de ensaios de compressão uniaxial ex vivo, pois, sem o preparo adequado da superfície de carregamento, forças compressivas serão aplicadas em apenas parte da superfície de carregamento, resultando em um "contato local"^17,19. Isso pode causar resultados inconsistentes e falha prematura¹⁹. Este não é o caso in vivo, pois a superfície de carga é circundada por discos intervertebrais nas articulações vertebrais, o que permite que a carga seja distribuída por toda a placa terminal cranial. O complexo disco intervertebral e placa terminal cranial desempenha um papel importante na aplicação de força em todo o corpo vertebral e na biomecânica da fratura no corpo vertebral^14,20. Embora o teste de compressão não seja novo no campo da biologia, existem limitações nos métodos atuais de ensaio mecânico de ossos. Essas limitações incluem a falta de modelos preditores e simulações para a mecânica óssea, arquitetura espacial geométrica única e até mesmo variações biológicas inerentes baseadas em^amostras21. Mais importante, o campo é desafiado pela falta de padronização entre os métodos e pela falta geral de métodos relatados na literatura²².

Existem dois métodos relatados na literatura para o preparo de vértebras lombares de roedores para a realização do ensaio de compressão uniaxial: o método de corte e o método de incorporação17,19,23,24,25,26. O método de corte requer que os processos vertebrais, a placa terminal cranial e a placa terminal caudal sejam cortados do corpo vertebral. Pendleton et ^al.19 relataram anteriormente um método detalhado para o uso desse método em vértebras lombares de camundongos. Este método apresenta os desafios de obter cortes perfeitamente paralelos nas placas terminais caudal e cranial, evitando danos à amostra. Também tem a limitação de que a placa terminal cranial seja removida. A placa terminal cranial contém uma densa concha de osso cortical e desempenha um papel importante na distribuição de cargas dos discos intervertebrais in vivo e está envolvida na falha do osso para fraturas in vivo 17,20,27. Em contraste, o método de incorporação envolve a remoção dos processos vertebrais, mantendo intacta a placa terminal cranial do corpo vertebral. A superfície de carregamento é então feita aproximadamente horizontal, colocando-se uma pequena quantidade de cimento ósseo na extremidade cranial do corpo vertebral. Este método tem a vantagem de superar os desafios técnicos associados ao método de corte e pode mimetizar melhor o mecanismo de aplicação de carga e falha óssea in vivo devido à preservação da placa terminal craniana. Esta abordagem já foi documentada em estudos envolvendo testes de compressão uniaxial em ossos de ratos. No entanto, até onde sabemos, ela não foi documentada anteriormente no contexto de vértebras lombares menores de camundongos17,25,26. O método em questão foi previamente detalhado por Chachra et ^al.25 e originalmente utilizava um espécime ósseo preso entre duas placas, cada uma com uma cavidade cilíndrica, que era então preenchida com polimetilmetacrilato (PMMA). Posteriormente, o mesmo grupo de pesquisa aprimorou o método em que uma extremidade é lixada suavemente (caudal) e a outra extremidade tem uma pequena mancha de cimento ósseo adicionada (cranial)²⁶. Este método é um aprimoramento em relação ao método anterior, pois minimiza o material entre as placas e é o foco deste artigo. Apesar dos desafios associados ao teste de compressão vertebral uniaxial, é um método que pode fornecer informações valiosas sobre os efeitos de uma terapia proposta no osso, especialmente quando pareado com flexão de três pontos.

Aqui, o uso de uma máquina conversível de ensaio de flexão/compressão de três pontos para permitir testes fáceis de ossos longos e corpos vertebrais usando uma única máquina é apresentado. Além disso, o uso de um método de incorporação para realizar testes de compressão uniaxial de vértebras lombares de camundongos é apresentado. O presente estudo foi realizado como parte de um estudo maior que teve como objetivo investigar as influências da suplementação dietética de sementes de cânhamo sobre as propriedades do osso esquelético em camundongos C57BL/6 fêmeas jovens^e em ^{crescimento5,6}. O testador de flexão de três pontos foi originalmente construído por professores e alunos do Departamento de Engenharia da Colorado State University-Pueblo e usado por nosso grupo de pesquisa em testes de flexão de três pontos em ossos longos [fêmur e tíbia de rato⁷ e úmero, fêmur e tíbia^{de camundongo 5,6,8,9}]. No entanto, sua modificação e aplicação para uso em testes de compressão do corpo vertebral de camundongos não foi explorada. O projeto e a construção da dobradeira de três pontos foram descritos anteriormente⁷. Este relatório se concentrará nos métodos usados para modificar a máquina para testes de compressão e para corrigir o deslocamento do sistema. Em segundo lugar, o método de incorporação para a preparação da superfície de carregamento do corpo vertebral de camundongos é descrito, juntamente com métodos para testes de compressão uniaxial e análise de dados de deslocamento de carga.

Protocol

Todos os experimentos e protocolos foram conduzidos de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals do National Institutes of Health e receberam aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Colorado State University-Pueblo (Número do Protocolo: 000-000A-021). Procedimentos detalhados para o cuidado com os animais foram descritos anteriormente ^5,6. Os camundongos foram obtidos com três semanas de idade como parte de um estudo mais amplo destinado a investigar os efeitos de uma dieta suplementada com sementes de cânhamo em camundongos fêmeas C57BL/6 jovens e em crescimento (ver Tabela de Materiais). De 5 a 29 semanas de idade, os camundongos foram criados em uma de três dietas: controle (0% de semente de cânhamo), 50 g/kg (5%) de semente de cânhamo ou 150 g/kg (15%) de semente de cânhamo, com oito camundongos por grupo ^5,6. Durante todo o estudo, os camundongos tiveram acesso ad libitum às suas respectivas dietas e água, foram alojados em gaiolas de policarbonato e mantidos em um ciclo claro:12 h escuro de 12 h (com luzes acesas das 06:00 às 18:00 h). O peso e a saúde dos camundongos foram avaliados semanalmente, e todos os camundongos completaram com sucesso o estudo sem desenvolver quaisquer condições adversas de saúde. Com vinte e nove semanas de idade, os camundongos foram profundamente anestesiados com gás isoflurano e eutanasiados via luxação cervical ^5,6. Uma incisão mediana foi feita na superfície ventral do esterno até a cauda, e todos os órgãos intratorácicos, peritoneais e retroperitoneais foram removidos das carcaças. As carcaças evisceradas foram preservadas em solução de cloreto de sódio a 0,9% a -70 °C até o momento da dissecção óssea para o teste da vértebra, que ocorreu aproximadamente um ano depois.

1. Conversão de uma máquina de dobra de três pontos em uma máquina de ensaio de compressão

1. Desparafuse a viga transversal acoplada ao sensor de carga na máquina de dobra de três pontos⁷ (ver Tabela de Materiais) (Figura 1A,B).
2. Rosqueie uma placa superior autoalinhante no sensor de carga (ver Tabela de Materiais) com rosqueamento idêntico ao feixe transversal (Figura 1C).
3. Faça dois furos horizontais em cada um dos suportes inferiores, onde a placa inferior será fixada posteriormente (Figura 1D).
4. Toque roscas nos dois lados de uma placa inferior de aço inoxidável para alinhar com os orifícios perfurados nos suportes inferiores (Figura 1E).
5. Fixe a placa inferior nos dois suportes inferiores usando parafusos sextavados roscados e aperte até ficar seguro (Figura 1F).
   NOTA: Os parafusos hexadecimais devem ter roscas que correspondam aos orifícios rosqueados nos suportes inferiores e placas superiores/inferiores. O uso de uma placa superior auto-alinhante pode ajudar a obter um contato uniforme entre a placa superior e a superfície de carga, mas não é suficiente dada a concavidade da extremidade cranial dos corpos vertebrais. É necessária uma preparação adicional utilizando um método de preparação da superfície de carga. Ao construir uma máquina de ensaio de compressão para ossos de pequenos animais, que são menores e mais fracos do que muitos materiais industriais/de engenharia, é essencial considerar a capacidade de carga do sensor de carga e o tamanho do quadro de carga. Além disso, as máquinas devem ser regularmente limpas e lubrificadas para garantir resultados precisos e operação suave.

2. Correção do deslocamento da máquina de ensaio de compressão

1. Sem material de teste entre a placa superior e a placa inferior, abaixe a placa superior na placa inferior até que o leve contato tenha sido feito (~0,3-0,5 N força de pré-carga).
2. Ligue a máquina a uma velocidade de redução constante (~1 mm/min) para iniciar o teste de compressão. Coletar medidas de carga (N) e deslocamento (mm) utilizando software digital de coleta de dados (ver Tabela de Materiais) para coleta de dados de ensaios mecânicos.
   OBS: Como nenhum material está entre a placa superior e inferior, todo deslocamento observado será devido apenas ao deslocamento da máquina (_máquina Δx) (quadro, célula de carga, placas, acoplamentos, etc.).
3. Continue a baixar a placa superior sobre a placa inferior a uma velocidade constante (isto é, monotônica) até que forças maiores do que as que serão obtidas de todas as amostras ósseas sejam alcançadas.
4. Repita as etapas 2.1 a 2.3 para um total de três vezes.
5. Plotar os dados para deslocamento do sistema (_máquina Δx, mm) vs. carga aplicada (Força, N).
6. Ajuste uma linha de regressão de melhor ajuste aos dados (Figura 2A-D).
7. Em uma planilha com os dados de um teste de compressão óssea, use a equação fornecida pela análise de regressão para determinar a quantidade de deslocamento da máquina (Δx_máquina) que influencia o deslocamento registrado (Δx_{total registrado}) para um ponto de dados de um teste de compressão de vértebra lombar de camundongo.
   NOTA: Por exemplo, considere um ponto de dados onde 18 N de força é aplicado e 2.730 mm de deslocamento foi registrado (Δx_{total registrado).} De acordo com o exemplo de equação de regressão polinomial de terceira ordem (Figura 2D) [Δx_máquina = (4 × 10-7 x Carga Aplicada³) - (8 × ^10-5 x Carga Aplicada²) + (0,0044 x Carga Aplicada)], 0,056 mm do deslocamento registrado é devido ao deslocamento da máquina (_máquina Δx).
   Δx_{total registrado=} Δx_máquina + _{Δx espécime}
8. Corrija o deslocamento registrado para o ponto de dados.
   Observação : por exemplo, considere o exemplo acima. Se 2,730 mm de deslocamento são registrados (Δx_{total registrado}) e o deslocamento da máquina ₍Δx_máquina) responde por 0,056 mm do total, então o deslocamento que o espécime (ou seja, osso) de interesse sofreu (_amostra Δx) é de 2,664 mm. Assim, 2,664 mm é o deslocamento real que a vértebra sofreu (_espécime Δx) e é o valor a ser utilizado para análise da curva carga-deslocamento.
   Δx_espécime = Δx_{total registrado - Δx máquina}
9. Repita as etapas 2.7-2.8 para cada ponto de dados coletado para cada amostra (osso).
   NOTA: Esta etapa é importante porque, durante o ensaio de compressão, o deslocamento observado não é apenas devido ao deslocamento do corpo de prova, mas em vez disso, o deslocamento observado é uma combinação de deslocamento da máquina (_máquina Δx) (por exemplo, compressão/deslocamento do quadro, célula de carga, placas, acoplamentos, etc.) e do corpo de prova (_amostra Δx). Assim, para espécimes que sofrem quantidades relativamente pequenas de deslocamento, como as de um pequeno animal (por exemplo, camundongo), o deslocamento do sistema (_máquina Δx) pode causar grandes erros. Os procedimentos aqui descritos para correção do deslocamento do sistema foram relatados anteriormente por Kalidindi e Abusafieh28, que também detalham outros dois métodos além do aqui descrito. Observou-se que alguns pesquisadores utilizam mais de um método para determinar o deslocamento do sistema¹⁷. Cada máquina pode exibir padrões e graus únicos de deslocamento do sistema quando cargas são aplicadas a ela. Por esta razão, o fator de correção de deslocamento do sistema deve ser determinado para cada máquina e não será o mesmo entre duas máquinas. Em contraste com o teste de compressão de um osso vertebral, uma grande redução de força não será observada ao medir o deslocamento do sistema, pois nenhum material está entre a placa superior e inferior.

3. Dissecção da ^5ª vértebra lombar (L5) da carcaça de camundongos

1. Descongelar a carcaça congelada de camundongos à temperatura ambiente, tomando o cuidado de manter os tecidos moles e os ossos hidratados aplicando regularmente uma solução isotônica de NaCl a 0,9%.
2. Faça uma pequena incisão (<0,5 cm) na pele na linha média dorsal perto da base da cauda, depois estenda o corte por cada membro posterior e puxe suavemente para remover a pelagem da base da cauda até a cabeça do animal.
3. Cortar a musculatura da parede abdominal até que a coluna vertebral seja facilmente visível.
4. Sob um microscópio dissecante, visualize as duas articulações sacroilíacas e a extremidade cranial do sacro.
5. Usando uma lâmina de barbear ou bisturi, faça um corte fino para separar a última vértebra lombar (L6) da extremidade cranial do sacro.
6. Novamente, cortando entre o espaço intervertebral, retire-se L6 e L5 da coluna vertebral, reservando-se L5 para análise (Figura 3).
7. Inspecione a vértebra sob um microscópio dissecante e remova todos os tecidos moles do osso, incluindo o disco intervertebral, usando principalmente compressas de gaze e suavemente com pinças quando necessário.
   OBS: No presente estudo, a L5 foi escolhida como vértebra de interesse, mas outras vértebras lombares podem ser escolhidas para o teste de compressão.

4. Preparação da superfície de carregamento da vértebra L5 para ensaio de compressão uniaxial usando o método de incorporação de cimento ósseo de PMMA

1. Usando uma roda de corte de diamante (ver Tabela de Materiais) acoplada a uma ferramenta giratória, faça um corte em cada pedículo para remover o processo transversal e espinhoso (Figura 4). Se deixados presos ao centro, os processos vertebrais podem resultar em contatos locais com as placas superiores/inferiores nos próprios processos, em oposição a uma distribuição da carga ao longo do centro.
2. Lixe suavemente a extremidade caudal da vértebra usando uma lixa fina de 120 grãos (ver Tabela de Materiais) para remover todos os discos intervertebrais, tecidos moles e irregularidades.
3. Marque a extremidade caudal lixada com um marcador permanente para fácil identificação posterior.
4. Misture o cimento ósseo de PMMA de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
5. Com o cimento ósseo de PMMA ainda semimacio, coloque uma quantidade mínima na extremidade cranial (não marcada) da vértebra voltada para cima, garantindo que toda a superfície seja coberta enquanto a vértebra fica em um banho de soro fisiológico para manter a amostra óssea hidratada e fria.
6. Com o PMMA ainda semimole, posicione a vértebra na placa inferior com o lado caudal (marcado) voltado para baixo (Figura 5).
7. Ligue a máquina para engatar as engrenagens de acionamento e abaixe lentamente a placa superior sobre o complexo de cimento ósseo + PMMA + vértebra até que o contato seja feito com o cimento ósseo e a força mínima (<0,5 N) seja aplicada para distribuir o PMMA uniformemente na superfície óssea. A placa superior em posição neutra pode ser estimada como horizontal e, ao pressionar o PMMA semimacio, fará com que o PMMA preencha a concavidade na extremidade cranial da vértebra e forme uma superfície horizontal plana abaixo da placa superior.
8. Com a placa superior pressionando suavemente o cimento ósseo de PMMA, deixe a amostra descansar tranquilamente até que o cimento ósseo de PMMA tenha endurecido completamente (~10 min de acordo com as instruções do fabricante para o cimento ósseo de PMMA usado no presente estudo). Manter a amostra em banho de soro fisiológico ou borrifá-la frequentemente com soro fisiológico durante este período para manter a amostra hidratada e fresca.
9. Uma vez que o cimento ósseo de PMMA tenha endurecido completamente, os testes de compressão podem começar. Colete dados de carga (ou seja, força) (N) e deslocamento (i.e., deflexão) (mm) dos sensores em uma planilha em tempo real usando um software digital projetado para coleta de dados de ensaios mecânicos (consulte Tabela de Materiais).
10. Após a coleta de dados basais por 5 s, aplicados a uma força mínima de pré-carga de <0,5 N, comece a abaixar a placa superior sobre a amostra em uma única (isto é, monotônica), velocidade de redução pré-determinada para iniciar o teste de compressão (~1 mm/min).
11. Parar de coletar dados uma vez que uma grande redução na carga (N) tenha sido observada, indicando falha de material.
    NOTA: As instruções do fabricante especificarão o tempo aproximado de endurecimento para o cimento ósseo de PMMA. O tempo de endurecimento do cimento ósseo de PMMA pode diferir dependendo do tipo de cimento ósseo de PMMA utilizado. Siga as instruções do fabricante para determinar o tempo de espera para o endurecimento do PMMA. No entanto, como um indicador de que o cimento ósseo de PMMA endureceu completamente, uma amostra adicional do cimento ósseo de PMMA pode ser misturada ao mesmo tempo que a amostra que será colocada na vértebra, mas mantida de lado e verificada para ver se ainda está mole ou completamente endurecida. Se completamente endurecido, isso pode indicar que o PMMA no osso também está completamente endurecido sem perturbar o osso + complexo PMMA. A amostra óssea deve permanecer bem hidratada e resfriada durante os períodos de endurecimento e teste de PMMA. Apenas alguns minutos de exposição ao ar seco podem resultar em alterações nas propriedades biomecânicas. Alguns pesquisadores utilizam máquinas de ensaio de compressão equipadas com banho salino¹⁹. A máquina de ensaio de compressão não dispunha de banho de soro fisiológico no presente estudo. Em vez disso, uma névoa fina de soro fisiológico foi regularmente aplicada durante todo o período de endurecimento do PMMA e período de teste.

5. Análise das curvas carga-deslocamento para ensaios de compressão uniaxial da vértebra L5

1. Copie e cole dados de carga (N) e deslocamento corrigido (mm) da planilha em um software técnico de gráficos e análise de dados (consulte Tabela de Materiais).
2. Gere um gráfico com a carga (N) no eixo y e o deslocamento corrigido do corpo de prova (_amostra Δx, mm) no eixo x (Figura 6). Faça isso no software clicando primeiro em Windows, Nova Tabela, depois em Fazê-lo para fazer uma tabela. Copie os dados de deslocamento corrigido (mm) e carga (N) da planilha de dados brutos para a nova tabela.
3. Em seguida, gere uma forma de onda para representar dados brutos clicando em Dados, clique em Emparelhar XY para Forma de Onda e selecione dados de deslocamento corrigidos para o X-Wave e carregar dados para o Y-Wave. Certifique-se de que o número correto de pontos de dados esteja na caixa "Número de pontos", nomeie a forma de onda e clique em Criar forma de onda. Uma vez que uma forma de onda tenha sido feita, gere um gráfico clicando em Windows, depois em Novo Gráfico e coloque a forma de onda no eixo Y e "calculada" no eixo X.
4. Use a ferramenta de cursor para marcar pontos/regiões de interesse no gráfico para análise. Alguns dos pontos/regiões de interesse para calcular as propriedades mecânicas comuns do osso total são mencionados nas etapas 5.4-5.8 (Figura 6) e incluem trabalho até a falha (N x mm), carga máxima (N), rigidez (N/mm), carga de escoamento (N) e deslocamento pós-escoamento (mm).
5. Para o cálculo do work-to-failure (N x mm), colocar um cursor (A) no início do ensaio e um cursor (B) no ponto imediatamente anterior à falha do material (ou seja, na carga máxima atingida durante o ensaio antes de se observar uma grande diminuição da carga).
   NOTA: Assim, os cursores A-B irão colocar entre parênteses a totalidade do ensaio a partir do momento em que o material começa a suportar forças e sofre deslocamento até o ponto em que o material falha. O trabalho até a falha (N x mm) pode ser medido como a área total abaixo da curva (ou seja, a área abaixo da curva entre os cursores A e B).
6. Calcule a carga máxima (N) como o valor mais alto para a carga observada durante o teste (ou seja, carga no cursor B).
7. Calcular a rigidez (N/mm) do material como a inclinação da região elástica linear (ou seja, a inclinação entre os cursores C e D).
8. A carga de escoamento (N) é a carga na qual a curva carga-deslocamento se desvia da linearidade e entra na região plástica, sustentando assim a deformidade permanente (ou seja, a carga no ponto D). Calcule isso medindo a carga no cursor D.
9. O deslocamento pós-escoamento (mm) é um indicador da ductilidade de um material. Meça isso como o deslocamento entre o ponto de escoamento e o ponto de falha do material (ou seja, o deslocamento entre os cursores D e B).
   NOTA: Os parâmetros listados acima são apenas algumas das propriedades mecânicas comuns do osso inteiro relatadas. Não é uma lista completa de todas as propriedades mecânicas do osso inteiro que podem ser obtidas a partir de uma curva de carga-deslocamento. Outros parâmetros de propriedade mecânica do osso inteiro incluem deslocamento total (mm), energia elástica absorvida (N x mm), deslocamento elástico (mm), energia plástica absorvida (N x mm) e deslocamento plástico (mm), para citar alguns. Além disso, as propriedades mecânicas ósseas em nível tecidual não são listadas; Estes requerem transformações de dados usando medidas anatômicas específicas, como o diâmetro ósseo. O código de exemplo para fazer as medições a partir da curva de carga-deslocamento no software foi listado no Arquivo Suplementar 1.

Representative Results

Com este protocolo passo-a-passo que utiliza a incorporação da superfície de carregamento L5 e uma máquina de dobra/ensaio de compressão conversível de três pontos, é possível realizar testes de compressão na vértebra lombar do mouse para comparações entre grupos. Um total de vinte e quatro vértebras L5 de camundongos foi preparado usando o método de incorporação. Três das amostras, no entanto, foram danificadas durante a remoção dos processos vertebrais com roda de corte de diamante em ferramenta rotativa e, portanto, não foram testadas. Diante disso, as propriedades mecânicas listadas foram obtidas com sucesso de vinte e uma das vinte e quatro amostras usando o método de incorporação. Os corpos de prova foram inspecionados visualmente após cada teste, e a tampa de PMMA não sofreu danos em nenhum dos ensaios. Como observado, os camundongos utilizados no presente estudo fizeram parte de um estudo maior com o objetivo de determinar os efeitos da semente de cânhamo dietético sobre os ossos de camundongos fêmeas C57BL/6 jovens e em crescimento. A estatística descritiva de cinco propriedades mecânicas do osso total comumente relatadas é oferecida na Tabela 1. As curvas de carga-deslocamento para todas as vinte e uma amostras são apresentadas na Figura 7.

Figura 1: Conversão de uma máquina de dobra de três pontos em uma máquina de ensaio de compressão. (A) A máquina totalmente equipada para operar como uma máquina de dobra de três pontos com o sensor de deslocamento e sensor de carga indicados (setas brancas). (B) A máquina após a remoção da viga transversal. (C) A máquina, após a colocação de uma placa superior autocompensadora, onde a viga transversal foi previamente colocada. (D) As vigas de apoio inferiores com furos perfurados nelas. (E) A placa inferior de aço inoxidável com quatro furos roscados e um parafuso parcialmente parafusado em um dos furos. Os outros dois buracos não vistos na foto estão do lado oposto. (F) As vigas de apoio inferiores com a placa inferior presa a elas por quatro parafusos sextavados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Um exemplo de deslocamento do sistema (_máquina Δx) vs. gráfico de carga ajustado com uma regressão linear (A), logarítmica (B), polinomial de segunda ordem (C) e polinomial de terceira ordem (D). Neste exemplo, o polinômio de terceira ordem fornece o melhor ajuste por valor de R² e sua regressão é usada como o fator de correção de deslocamento do sistema. As imagens representam dados de exemplo para demonstrar o ajuste de regressão e precisarão ser obtidas por pesquisadores para máquinas individuais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Coluna vertebral lombar de camundongos. Coluna vertebral lombar de camundongo sob microscópio dissecante antes da remoção de L6 (A) e da remoção de L6, deixando L5 aderida (B). L5 será posteriormente removido e preparado para ensaio de compressão. As faixas de cor branca são os discos intervertebrais que foram dissecados e removidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Anatomia da vértebra L5. Vértebra L5 representativa de camundongos nas incidências cranial, caudal, dorsal e ventral sob microscópio dissecante. Dimensões importantes para o corpo vertebral incluem altura, largura dorsoventral e largura lateral, como mostrado pelas linhas coloridas. As linhas tracejadas pretas mostram aproximadamente onde os cortes devem ser feitos para remover os processos vertebrais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Período de endurecimento do cimento ósseo de PMMA. Um exemplo de vértebra L5 com cimento ósseo de PMMA (verde) colocada na placa terminal cranial e a placa superior abaixada sobre o complexo cimento ósseo + osso de PMMA. Uma vez que o cimento ósseo de PMMA tenha endurecido completamente, o teste de compressão será iniciado. A placa superior será abaixada até que se observe falha do material. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Curva carga-deslocamento do teste de compressão óssea vertebral de camundongos e análise dos dados. O cursor A marca o início do teste de compressão. O cursor B marca o ponto de falha material. O cursor C marca o início da região elástica linear, enquanto o cursor D marca o fim (ou seja, o limite de rendimento). A área sombreada em cinza claro é a região elástica linear, onde o material retornará à sua forma original se a carga for removida. A área sombreada de cinza escuro é a região plástica, onde o material sofreu deformidade permanente e não retornará à sua forma original se a carga for removida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Curvas de carga-deslocamento para todas as vinte e uma amostras ósseas. Os padrões variaram entre os ossos. Em geral, a maior variabilidade foi no deslocamento pós-escoamento, com alguns (n = 5) dos ossos tendo um deslocamento pós-escoamento relativamente pequeno e outros (n = 16) tendo um deslocamento pós-escoamento relativamente grande. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Grupo	Trabalho até a falha (N*mm)	Carga Máxima (N)	Rigidez (N/mm)	Carga de Escoamento (N)	Deslocamento Pós-Escoamento (mm)
CON (n = 7)	13,43 ± 2,44 A,B	37,93 ± 3,28	109,14 ± 11,86	22,68 ± 2,04	0,34 ± 0,06
5SH (n = 8)	12.12 ± 1.23 A	33,62 ± 2,43	99,70 ± 16,62	20,88 ± 2,69	0,38 ± 0,08
15SH (n = 6)	19,55 ± 2,13 B	41,82 ± 1,85	134,58 ± 19,73	28.07 ± 3.20	0,51 ± 0,07
Grupos Combinados (n = 21)	14,68 ± 1,27	37,40 ± 1,63	121,82 ± 9,43	23,54 ± 1,60	0,40 ± 0,04

Tabela 1: Valores representativos das propriedades mecânicas do osso total comumente relatadas obtidas usando o método de incorporação da preparação da superfície de carregamento. Os valores foram obtidos utilizando-se todos os protocolos detalhados no presente estudo. Assim, os valores representam aqueles que podem ser obtidos utilizando os métodos aqui descritos. Os grupos ±representam camundongos fêmeas C57BL/6 alimentados com dieta enriquecida com cânhamo integral nas concentrações de 0% (CON), 50 g/kg (5%) (5HS) ou 150 g/kg (15%) (15HS) das idades de 5-29 semanas. Para um dos parâmetros (work-to-failure), parece que a dieta influenciou os valores por uma ANOVA one-way (p < 0,05). Os valores que compartilham a mesma letra sobrescrita não são significativamente diferentes (p > 0,05), enquanto os valores com letras sobrescritas diferentes são significativamente diferentes (p < 0,05), de acordo com a análise post hoc de Tukey-Kramer.

Arquivo suplementar 1: código de exemplo para obter propriedades mecânicas de osso inteiro. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

O objetivo do presente estudo foi descrever a construção de uma dobradeira/máquina de ensaio de compressão conversível de três pontos, bem como o uso de um método de incorporação de cimento ósseo de PMMA para a preparação de amostras de vértebras lombares de camundongos antes do ensaio de compressão uniaxial. Estatísticas descritivas foram obtidas e relatadas para as amostras ósseas, o que será útil para comparação em estudos futuros. Algumas das propriedades mecânicas do osso total mais comumente relatadas foram analisadas no presente estudo. No entanto, vale a pena notar que existem várias propriedades mecânicas adicionais em nível de osso inteiro e tecido que não foram investigadas aqui.

Ainda não está claro como as propriedades mecânicas obtidas de amostras preparadas usando o método de incorporação se comparam àquelas preparadas usando o método de corte para vértebras lombares de camundongos. Schumancher¹⁷ avaliou previamente as propriedades mecânicas de vértebras de ratos preparadas usando os dois diferentes métodos e verificou que as vértebras preparadas usando o método de incorporação tinham rigidez significativamente menor, maior deslocamento de rendimento e maior deformação de rendimento do que amostras preparadas usando o método de corte. Uma caracterização mais aprofundada é necessária para entender como as propriedades mecânicas vertebrais de camundongos ou outros modelos animais se comparam quando medidas usando os dois diferentes métodos de preparação da superfície de carregamento. Espera-se que alguns parâmetros difiram entre vértebras preparadas por diferentes métodos, uma vez que o método de incorporação adiciona material à amostra, mas preserva a placa terminal, que é uma estrutura importante nas fraturas vertebrais in^vivo17,27. A adição de cimento ósseo à extremidade cranial adiciona altura à amostra, enquanto o corte das placas terminais remove a altura, alterando a relação de aspecto e, assim, alterando propriedades mecânicas como rigidez. Além disso, embora o PMMA seja mais rígido que o osso esponjoso vertebral, é possível que o PMMA sofra deslocamento, e a extensão desse deslocamento precisa de maior caracterização. Além disso, não está claro como os resultados obtidos pelo método de incorporação ou método de corte se comparam às previsões de parâmetros ósseos usando análise de elementos finitos para vértebras de camundongos ou como os resultados variam sob diferentes condições (por exemplo, velocidade de redução, diferentes níveis vertebrais, composições de PMMA). No entanto, como todos os espécimes são preparados de maneira semelhante, este método é apropriado e permite um meio fácil e custo-efetivo de fazer comparações entre grupos de tratamento em um único estudo, onde as amostras são preparadas e testadas em condições semelhantes.

Em relação ao preparo do corpo de prova antes do ensaio de compressão, é essencial preparar as amostras de forma reprodutível. Uma possível limitação do método descrito neste estudo é o uso de uma ferramenta rotatória para remoção dos processos vertebrais. Outro método para remover os processos vertebrais de vértebras lombares de camundongos foi descrito por Pendleton et ^al.19, o que pode permitir um preparo mais consistente da amostra. Além disso, inconsistências podem surgir com a aplicação do cimento ósseo de PMMA. Portanto, é importante aplicar o cimento ósseo de forma consistente em termos de volume, colocação e tempo de endurecimento. No entanto, o método de incorporação pode fornecer um meio mais simples de obter uma preparação consistente da amostra em comparação com o método de corte, pois pode ser um desafio alcançar cortes perfeitamente uniformes e paralelos consistentemente entre todas as amostras devido ao seu pequeno tamanho e fragilidade. Estudos futuros serão necessários para avaliar a precisão dos resultados obtidos a partir de amostras preparadas utilizando o embedding vs. método de corte.

Como mencionado, são necessárias mais caracterizações e investigações do método de incorporação para a preparação de espécimes de vértebras lombares de camundongos antes do ensaio de compressão uniaxial. No entanto, este estudo demonstra que tal método pode ser empregado, fornece uma descrição detalhada do método proposto e oferece estatísticas descritivas dos parâmetros medidos a partir de amostras preparadas usando o método. Este protocolo é valioso para a área devido à atual falta de metodologia disponível. Além disso, esse método pode mimetizar melhor o mecanismo pelo qual as fraturas vertebrais in vivo ocorrem em comparação com outros^{métodos17,27}. O método também tem a vantagem de superar as dificuldades técnicas associadas a outros métodos atualmente relatados, tornando o ensaio de compressão uniaxial mais viável na pesquisa óssea. Isso é particularmente significativo porque drogas, dietas ou outras intervenções podem influenciar ossos ricos em cortical (por exemplo, ossos longos médio-diafisários) e ossos ricos em trabeculares (por exemplo, corpos vertebrais) de forma diferente, mas a flexão de três pontos é o método predominante para avaliar as propriedades mecânicas dos ossos¹³. A combinação de flexão de três pontos e teste de compressão uniaxial pode se tornar ainda mais facilmente alcançável através do uso de uma máquina conversível de ensaio de flexão/compressão de três pontos. Assim, o presente estudo propõe duas formas possíveis de tornar mais disponível aos pesquisadores a avaliação tanto do osso rico em cortical quanto do osso rico em trabecular em um mesmo estudo, potencialmente levando a um melhor entendimento de como um determinado tratamento afeta os diferentes tipos ósseos entre os grupos experimentais.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
120-Grit Sand Paper	N/A	N/A	For removal of caudal end plate soft tissues and irregularities
24-bit Load Cell Interface	LoadStar Sensors, Freemont, California, USA	DQ-1000	To connect load and displacement sensors to personal coputer
Base Mouse Diet	Dyets, Inc, Bethlehem, PA, USA	AIN-93G	Diet the mice were fed, without added hempseed
Diamond Cutoff Wheel w/ Rotary Tool	Dremel US, Mt. Prospect, Illinois, USA	F0130200AK	To remove vertebral proccesses
Displacement Sensor	Mitutoyo, Aurora, Illinois, USA	ID-S112EX	Displacement sensor with 0.001 mm resolution and 0.00305 mm accuracy
External Variable Voltage Power Source	Extech Instruments, Nashua, New Hampshire, USA	382213	To provide power to compression testing machine
Female C57BL/6 Mice	Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts, USA	027 (Strain Code)	Mouse model used in present study
Hempseed	Natera, Pitt Meadows, Canada	670834012199	Hempseed added to Base Mouse Diet
Igor Pro Software (Version 8.04)	Wave Metrics, Portland, Oregon, USA	N/A	Sofware used for load-displacement curve analysis
iLoad Mini Force Sensor	LoadStar Sensors, Freemont, California, USA	MFM-010-050-S	Load (force) sensor with 1.0% accuracy
Isotonic (0.9%) Saline Solution	N/A	N/A	To keep bone sampels hydrated
Leica EZ4 W Miscoscope	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	NC1601884	For bone dissections and vertebral process removal
Microsoft Excel Software	Microsoft Corporation, Redmond, Washington, USA	N/A	For data transfer from SensorVue software
PALACOS R Bone Cement	Hareus Medical, Wehreim, Germany	00-1112-140-01	PMMA bone cement for embedding of the loading surface
Personal Computer	N/A	N/A	For data recording (see 24-bit Load Cell Interface, SensorVue Software, Microsoft Excel Software) and analysis (see Igor Pro Software)
SensorVue Software	LoadStar Sensors, Freemont, California, USA	N/A	Software used for real-time data collection during compression testing
Small Animal Dissecting Kit	N/A	N/A	Dissecting scissors, forceps, scalpel, blades, pins, gauze pads
Stainless Steel Top Platen (Self-Alligning) and Bottom Platen Pair	N/A	N/A	Constructed by Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering
Three-Point Bending Machine	N/A	N/A	Constructed by Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering. Refer to Sarper et al. (2014) for further details regarding construction