Испытание на одноосное сжатие поясничного позвонка мыши с заделкой нагружающей поверхности

Summary

В этом протоколе описаны два подхода, позволяющие сделать одноосное компрессионное тестирование поясничных позвонков мышей более достижимым. Во-первых, описывается преобразование трехточечного гибочного станка в станок для испытания на сжатие. Во-вторых, для поясничных позвонков мышей адаптирован метод подготовки нагружающей поверхности с использованием костного цемента.

Abstract

Растет осведомленность о том, что кортикальная и губчатая кость различаются в регулировании и ответе на фармацевтическую терапию, гормональную терапию и другие методы лечения возрастной потери костной массы. Трехточечное сгибание является распространенным методом, используемым для оценки влияния лечения на область среднего диафиза длинных костей, которая богата кортикальной костью. Испытание позвонков мышей на одноосную компрессию, хотя и позволяет оценить кости, богатые губчатой костью, реже проводится из-за технических проблем. Еще реже проводится сочетание трехточечных испытаний на изгиб и компрессию, чтобы определить, как лечение может одинаково или по-разному повлиять на область среднего диафиза длинной кости и центр позвонка. Здесь мы опишем две процедуры, позволяющие сделать испытание на сжатие поясничных позвонков мыши менее сложным методом, выполняемым параллельно с трехточечным изгибом: во-первых, процедуру преобразования трехточечного гибочного станка в машину для испытания на сжатие, и, во-вторых, метод встраивания для подготовки нагружающей поверхности поясничного позвонка мыши.

Introduction

Возрастные изменения костей широко признаны проблемными из-за повышенного риска переломов костей, связанных с этими изменениями. Переломы костей у людей могут приводить к хронической боли, ограничению подвижности, длительной инвалидности, повышенному риску смерти и экономическому бремени¹. Распространенные методы лечения, исследованные для устранения симптомов возрастных изменений костей, включают пищевые добавки, гормональное лечение и лекарства 2,3,4,5,6,7,8,9. Первоначальные исследования таких методов лечения на людях обычно проводятся с использованием моделей мелких животных (например, лабораторных крыс и мышей), которые обладают двумя основными типами костей, обнаруженных в человеческом скелете^. Аппендикулярные длинные кости, такие как плечевая, бедренная и большеберцовая кости, богаты кортикальной (т.е. компактной) костью, тогда как позвонки богаты губчатой костью (т.е. т.е. т.е. тканой, губчатой или трабекулярной костью)⁴. Появляется все больше знаний о том, что механизмы костной регуляции и сигнальные пути различаются между кортикальной костью (например, длинная кость в середине диафиза) и губчатой костью (например, центр позвонка)². Из-за этого терапия может иметь дифференцированные эффекты, специфичные для кости или даже для конкретного места в пределах одной и той же кости ^2,3,4.

Приложение силы к объекту (например, кости) приводит к тому, что объект претерпевает ускорение, деформацию или и то, и другое, в зависимости от граничных условий объекта. Когда кость стеснена, противоположная сила равной величины сопротивляется ускорению кости, и происходит деформация. По мере того, как кость подвергается деформации, возникает внутреннее сопротивление, называемое напряжением, которое бывает двух основных типов: нормальная сила в форме растяжения или сжатия и поперечная сила¹⁰. Часто образуется комбинация основных видов напряжений, в зависимости от приложенной системы сил¹⁰. Прочность материала – это его способность выдерживать нагрузки без сбоев. По мере того, как к материалу прикладываются все большие силы, он в конечном итоге подвергается остаточной деформации, и в этот момент говорят, что он перешел из упругого состояния (т.е. вернется к своей первоначальной форме, если сила будет устранена) в пластическое состояние (т.е. не вернется к своей первоначальной форме, если сила будет устранена)¹¹. Точка, в которой происходит переход из упругого состояния в пластическое, называется пределом текучести. По мере того, как к материалу прикладываются еще большие силы, превышающие предел текучести, он все больше подвергается микротрещинам (т.е. повреждениям) до тех пор, пока не произойдет полное разрушение; На данный момент говорят, что материал провалился^11,12. Перелом кости представляет собой разрушение как на структурном, так и на тканевом уровне¹⁰. Например, перелом позвоночной кости происходит не только из-за того, что несколько трабекул выходят из строя на структурном уровне, но и из-за разрушения элементов внеклеточного матрикса, таких как кристаллы коллагена и гидроксиапатита, в отдельной трабекуле на тканевом уровне.

Механические события, приводящие к разрушению материала, могут быть измерены с помощью различных методов испытаний. Трехточечная гибка является распространенным методом проверки механических свойств длинных костей аппендикулярного скелета. Этот метод прост и воспроизводим, что делает его предпочтительным методом биомеханического тестирования для многих исследователей¹³. Опуская траверсу на средний диафиз длинной кости, опирающейся на две нижние опорные балки, этот метод специально проверяет механические свойства области среднего диафиза, которая представляет собой плотно организованную кортикальную кость. По кривым нагрузки-перемещения можно определить, среди прочего, влияние силы растяжения на упругость, ударную вязкость, силу разрушения и переход от упругого к пластическому поведению костных материалов.

Во втором типе кости, называемом трабекулярной, губчатой, тканой или губчатой костью, костные элементы формируются в массив стержней и балок, называемых трабекулами, что придает им «губчатый» вид. Основные тела позвонков (т.е. центры) богаты губчатой костью и часто являются местами возрастных компрессионных переломов костей у людей¹⁴. Поясничные (т.е. поясничные) позвонки являются самыми крупными позвонками, несут большую часть веса тела и являются наиболее распространенным местом переломов позвонков^15,16. Механические свойства тел позвонков лучше всего могут быть непосредственно оценены с помощью методов испытаний на одноосное сжатие, поскольку осевое сжатие представляет собой нормальную силовую нагрузку, оказываемую на позвоночные столбы in vivo¹⁷. Сжатие тел позвонков in vivo происходит в результате мышечных сокращений и связок, силы тяжести и сил реакции грунта¹⁸.

Испытание позвонков мелких животных на компрессию ex vivo может быть затруднено из-за их небольшого размера, неправильной формы и хрупкости. Форму тел позвонков можно оценить как параллелограмм с умеренным вентральным наклоном и небольшой вогнутостью черепа¹⁷. Такая форма создает трудности для проведения испытаний на одноосное сжатие ex vivo, поскольку без надлежащей подготовки к поверхности нагружения сжимающие силы будут приложены только к части поверхности нагружения, что приведет к «локальному контакту»^17,19. Это может привести к противоречивым результатам и преждевременному выходу из строя¹⁹. Это не относится in vivo, потому что нагружающая поверхность окружена межпозвоночными дисками в позвоночных суставах, что позволяет распределять нагрузку по всей краниальной концевой пластине. Комплекс межпозвонково-краниальная концевая пластина играет важную роль в приложении силы по всему телу позвонка и биомеханике перелома тела позвонка^14,20. Несмотря на то, что испытание на сжатие не является чем-то новым в области биологии, существуют ограничения в современных методах механического испытания костей. Эти ограничения включают в себя отсутствие предикторных моделей и симуляций для механики костей, уникальную геометрическую пространственную архитектуру и даже присущие биологические вариации на основе образцов²¹. Что еще более важно, эта область сталкивается с проблемами, связанными с отсутствием стандартизации между методами и общим отсутствием методов, описанных в литературе²².

В литературе описаны два метода подготовки поясничных позвонков грызунов для проведения испытаний на одноосную компрессию: метод разрезания и метод заделки 17,19,23,24,25,26. Метод разрезания требует, чтобы позвоночные отростки, краниальная концевая пластина и хвостовая концевая пластина были вырезаны из тела позвонка. Pendleton et ^al.19 ранее сообщали о подробном методе использования этого метода на поясничных позвонках мышей. Этот метод позволяет добиться идеально параллельных надрезов как на каудальной, так и на краниальной концевой пластине, а также избежать повреждения образца. Он также имеет ограничение, заключающееся в том, что краниальная концевая пластина удаляется. Краниальная концевая пластина содержит плотную оболочку кортикальной кости и играет важную роль в распределении нагрузок от межпозвоночных дисков in vivo и участвует в разрушении кости при переломах in vivo 17,20,27. В отличие от этого, метод встраивания включает в себя удаление позвоночных отростков с сохранением краниальной концевой пластинки тела позвонка нетронутой. Затем нагружающую поверхность делают примерно горизонтальной, помещая небольшое количество костного цемента на краниальный конец тела позвонка. Преимущество этого метода заключается в том, что он преодолевает технические проблемы, связанные с методом резки, и может лучше имитировать механизм приложения нагрузки и разрушения кости in vivo из-за сохранения краниальной концевой пластины. Этот подход ранее был задокументирован в исследованиях, включающих испытания на одноосное сжатие костей крыс. Однако, насколько нам известно, он ранее не был задокументирован в контексте поясничных позвонков мелких мышей 17,25,26. Метод, о котором идет речь, был ранее подробно описан Chachra et ^al.25 и первоначально использовал образец кости, удерживаемый между двумя пластинами, каждая из которых имела цилиндрическую полость, которая затем была заполнена полиметилметакрилатом (ПММА). Позже та же исследовательская группа усовершенствовала метод, при котором один конец аккуратно шлифуется (каудальный), а на другом конце добавляется небольшое пятно костного цемента (краниальный)²⁶. Этот метод является улучшением предыдущего метода, поскольку он минимизирует материал между валиками и находится в центре внимания этой статьи. Несмотря на проблемы, связанные с одноосным тестом на компрессию позвонков, это метод, который может предоставить ценную информацию о влиянии предлагаемой терапии на кость, особенно в сочетании с трехточечным сгибанием.

Здесь демонстрируется использование трансформируемой трехточечной машины для испытаний на изгиб/сжатие, позволяющей легко испытывать как длинные кости, так и тела позвонков с помощью одной машины. Кроме того, представлено использование метода встраивания для одноосного испытания на компрессию поясничных позвонков мыши. Настоящее исследование было выполнено в рамках более крупного исследования, целью которого было изучение влияния пищевых добавок из семян конопли на свойства скелетной кости у молодых, растущих самок мышей C57BL/6 ^5,6. Тестер на трехточечный изгиб был первоначально сконструирован преподавателями и студентами инженерного факультета Университета штата Колорадо в Пуэбло и использовался нашей исследовательской группой для испытаний на трехточечный изгиб длинных костей [бедренная и большеберцовая кость крысы⁷ и плечевая, бедренная и большеберцовая кость мыши 5,6,8,9 ]. Тем не менее, его модификация и применение для использования в испытаниях на компрессию тела позвонков мышей не было изучено. Конструкция и конструкция трехточечного гибочного станка были описаны ранее⁷. В этом отчете основное внимание будет уделено методам, используемым для модификации машины для испытаний на сжатие и коррекции смещения системы. Во-вторых, описан метод встраивания для подготовки поверхности нагружения тела мыши, а также методы испытаний на одноосное сжатие и анализа данных о нагрузке-перемещении.

Protocol

Все эксперименты и протоколы были проведены в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения и получили одобрение Комитета по уходу и использованию животных Университета штата Колорадо в Пуэбло (номер протокола: 000-000A-021). Подробные процедуры по уходу за животными были описаны ранее ^5,6. Мыши были получены в трехнедельном возрасте в рамках более широкого исследования, направленного на изучение влияния диеты с добавлением семян конопли на молодых, растущих самок мышей C57BL/6 (см. таблицу материалов). В возрасте от 5 до 29 недель мышей выращивали на одной из трех диет: контрольной (0% конопляного семени), 50 г/кг (5%) конопляного семени, или 150 г/кг (15%) конопляного семени, с восемью мышами в группе ^5,6. На протяжении всего исследования мыши имели свободный доступ к своему рациону и воде, содержались в парах в клетках из поликарбоната и содержались в цикле 12 часов свет:12 часов темноты (с включенным светом с 06:00 до 18:00 часов). Вес и состояние здоровья мышей оценивались еженедельно, и все мыши успешно завершили исследование без каких-либо неблагоприятных условий для здоровья. В возрасте 29 недель мышей глубоко обезболивали изофлураном и усыпляли через вывих шейки матки ^5,6. На брюшной поверхности от грудины до хвоста был сделан разрез по средней линии, и из туш были удалены все внутригрудные, перитонеальные и забрюшинные органы. Выпотрошенные туши консервировали в 0,9% растворе натрия хлорида при -70 °C до момента вскрытия костей для исследования позвонков, которое произошло примерно через год.

1. Переоборудование станка для трехточечной гибки в машину для испытания на сжатие

1. Отвернуть траверсу, прикрепленную к датчику нагрузки на трехточечном гибочном станке⁷ (см. таблицу материалов) (рисунок 1А, Б).
2. Прикрутите самоустанавливающуюся верхнюю плиту к датчику нагрузки (см. Таблицу материалов) с резьбой, идентичной траверсе (Рисунок 1C).
3. Просверлите по два горизонтальных отверстия в каждой из нижних опор, куда позже будет прикреплен нижний валик (Рисунок 1D).
4. Постучите резьбой с двух сторон нижней плиты из нержавеющей стали, чтобы совместить их с просверленными отверстиями в нижних опорах (Рисунок 1E).
5. Прикрепите нижнюю плиту к двум нижним опорам с помощью винтов с шестигранной головкой с резьбой и затяните до упора (Рисунок 1F).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Винты с шестигранной головкой должны иметь резьбу, совпадающую с резьбовыми отверстиями на нижних опорах и верхней/нижней плитах. Использование самоустанавливающейся верхней плиты может помочь достичь равномерного контакта между верхней плитой и нагружающей поверхностью, но этого недостаточно, учитывая вогнутость черепного конца тел позвонков. Требуется дальнейшая подготовка с использованием метода подготовки поверхности нагружения. При конструировании машины для испытания на сжатие костей мелких животных, которые меньше и слабее, чем многие промышленные/инженерные материалы, важно учитывать грузоподъемность датчика нагрузки и размер грузовой рамы. Кроме того, машины следует регулярно чистить и смазывать, чтобы обеспечить точные результаты и бесперебойную работу.

2. Поправка на смещение машины для испытания на сжатие

1. Если между верхней и нижней плитами нет испытуемого материала, опустите верхнюю плиту на нижнюю плиту до тех пор, пока не будет достигнут легкий контакт (усилие предварительного натяга ~0,3-0,5 Н).
2. Включите машину на постоянной скорости снижения (~1 мм/мин), чтобы начать испытание на сжатие. Сбор данных измерений нагрузки (Н) и смещения (мм) с помощью цифрового программного обеспечения для сбора данных (см. Таблицу материалов) для сбора данных механических испытаний.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку между верхней и нижней плитами нет материала, все наблюдаемые смещения будут обусловлены смещением только машины (_машины Δx) (рамы, тензодатчика, плит, муфт и т. д.).
3. Продолжайте опускать верхнюю плиту на нижнюю с постоянной (т.е. монотонной) скоростью до тех пор, пока не будут достигнуты силы, превышающие те, которые будут получены из всех образцов кости.
4. Повторите шаги 2.1–2.3 в общей сложности три раза.
5. Построение графика данных о смещении системы (_{Δx машина}, мм) в зависимости от приложенная нагрузка (Сила, Н).
6. Подгонка линии регрессии наилучшего соответствия данным (рис. 2A-D).
7. В электронной таблице с данными теста на компрессию костей используйте уравнение, полученное в результате регрессионного анализа, чтобы определить величину смещения машины (_машины Δx), влияющую на зарегистрированное смещение (_{общее записанное} значение Δx) для точки данных теста на компрессию поясничного позвонка мыши.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Например, рассмотрим точку данных, в которой приложено усилие 18 Н и зафиксировано смещение 2.730 мм (_{всего записано} Δx). Согласно приведенному уравнению полиномиальной регрессии третьего порядка (рис. 2D) [_{Δx machine} = (4 × 10-7 x Приложенная нагрузка³) - (8 × ^10-5 x Приложенная нагрузка²) + (0,0044 x Приложенная нагрузка)], 0,056 мм зарегистрированного смещения обусловлено смещением машины (_машина Δx).
   Δx_{всего зарегистрированных =} Δx_машина + Δx_{образец}
8. Исправьте записанное смещение для точки данных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для примера рассмотрим приведенный выше пример. Если зафиксировано смещение 2,730 мм (_{общее количество зарегистрированных} Δx), а машинное смещение _{(станок} Δx) составляет 0,056 мм от общего смещения, то смещение, которому подвергся интересующий образец (т. е. кость) (образец Δx), составляет 2,664 мм. Таким образом, 2,664 мм — это фактическое смещение, которому подвергся позвонок (_{образец} Δx), и значение, которое будет использоваться для анализа кривой зависимости нагрузки от смещения.
   Δx_{образца} = Δx_{всего зарегистрированных - Δx машина}
9. Повторите шаги 2.7-2.8 для каждой точки данных, собранной для каждого образца (кости).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг важен, потому что во время испытания на сжатие наблюдаемое смещение происходит не только из-за смещения образца, но и из-за комбинации смещения машины (_машины Δx) (например, сжатия/смещения рамы, тензодатчика, плит, муфт и т. д.) и образца (_{образец} Δx). Таким образом, для образцов, которые подвергаются относительно небольшому смещению, например, у небольшого животного (например, мыши), смещение системы (_машина Δx) может привести к большим ошибкам. О процедурах, описанных здесь для коррекции смещения системы, ранее сообщали Kalidindi и Abusafieh²⁸, которые также подробно описали два других метода в дополнение к описанному здесь. Было отмечено, что некоторые исследователи используют более одного метода для определения смещения системы¹⁷. Каждая машина может демонстрировать уникальные шаблоны и степени смещения системы при приложении к ней нагрузок. По этой причине поправочный коэффициент смещения системы должен быть определен для каждой машины и не будет одинаковым для любых двух машин. В отличие от испытания позвоночной кости на сжатие, при измерении смещения системы не будет наблюдаться значительного снижения силы, поскольку между верхней и нижней плитами нет материала.

3. Рассечение ^5-го поясничного позвонка (L5) из тушки мыши

1. Разморозьте замороженную тушку мыши при комнатной температуре, заботясь о том, чтобы мягкие ткани и кости были увлажнены, регулярно применяя изотонический раствор 0,9% NaCl.
2. Сделайте небольшой (<0,5 см) надрез на коже на средней линии спины у основания хвоста, затем протяните разрез через каждую заднюю конечность и осторожно потяните, чтобы удалить шкуру от основания хвоста к голове животного.
3. Отрежьте мускулатуру брюшной стенки до тех пор, пока позвоночный столб не станет хорошо виден.
4. Под препарирующим микроскопом визуализируйте два крестцово-подвздошных сочленения и краниальный конец крестца.
5. Используя лезвие бритвы или скальпель, сделайте тонкий надрез, чтобы отделить последний поясничный позвонок (L6) от черепного конца крестца.
6. Опять-таки, разрезая межпозвонковое пространство, удаляют L6 и L5 из позвоночного столба, оставляя L5 для анализа (рисунок 3).
7. Осмотрите позвонок под препарирующим микроскопом и удалите все мягкие ткани из кости, включая межпозвоночный диск, используя в основном марлевые салфетки и осторожно щипцами, где это необходимо.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании в качестве интересующего позвонка был выбран L5, но для компрессионного теста могут быть выбраны и другие поясничные позвонки.

4. Подготовка поверхности нагружения позвонка L5 к испытанию на одноосное сжатие методом заделки костного цемента из ПММА

1. С помощью алмазного отрезного круга (см. Таблицу материалов), прикрепленного к ротационному инструменту, сделайте надрез на каждой ножке, чтобы удалить поперечный и остистый отросток (рис. 4). Если оставить позвоночные отростки прикрепленными к центру, они могут привести к локальному контакту с верхней/нижней валиками на самих отростках, а не к распределению нагрузки по всему центру.
2. Аккуратно отшлифуйте каудальный конец позвонка мелкой наждачной бумагой с зернистостью 120 (см. Таблицу материалов), чтобы удалить все межпозвоночные диски, мягкие ткани и неровности.
3. Отметьте отшлифованный хвостовой конец перманентным маркером для легкой идентификации в дальнейшем.
4. Смешайте костный цемент из ПММА в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
5. Когда костный цемент из ПММА еще полумягкий, нанесите минимальное количество на краниальный (немаркированный) конец позвонка вверх, чтобы убедиться, что вся поверхность покрыта, пока позвонок находится в солевой ванне, чтобы образец кости оставался увлажненным и прохладным.
6. Когда ПММА еще полумягкий, расположите позвонок на нижней плите каудальной (отмеченной) стороной вниз (Рисунок 5).
7. Включите машину, чтобы включить ведущие шестерни, и медленно опустите верхнюю плиту на позвонок + комплекс костного цемента ПММА до тех пор, пока не произойдет контакт с костным цементом и не будет приложено минимальное усилие (<0,5 Н) для равномерного распределения ПММА по поверхности кости. Верхняя плита в нейтральном положении может быть оценена как горизонтальная, и при надавливании на полумягкий ПММА приведет к тому, что ПММА заполнит вогнутость на краниальном конце позвонка и образует плоскую горизонтальную поверхность под верхней плитой.
8. Осторожно надавливая верхней плитой на костный цемент из ПММА, оставьте образец нетронутым до тех пор, пока костный цемент из ПММА полностью не затвердеет (~10 мин в соответствии с инструкциями производителя для костного цемента из ПММА, используемого в настоящем исследовании). Храните образец в солевой ванне или часто опрыскивайте его физиологическим раствором в течение этого периода, чтобы сохранить образец гидратированным и прохладным.
9. После того, как костный цемент из ПММА полностью затвердеет, можно начинать испытания на сжатие. Собирайте данные о нагрузке (т. е. силе) (Н) и смещении (т. е. прогибе) (мм) с датчиков в электронную таблицу в режиме реального времени с помощью цифрового программного обеспечения, предназначенного для сбора данных механических испытаний (см. Таблицу материалов).
10. После сбора исходных данных в течение 5 с, приложенных при минимальном усилии предварительного натяга <0,5 Н, начинают опускать верхнюю плиту на образец с однократной (т.е. монотонной), заранее определенной скоростью опускания, чтобы начать испытание на сжатие (~1 мм/мин).
11. Прекратите сбор данных, как только будет замечено значительное снижение нагрузки (N), указывающее на отказ материала.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В инструкциях производителя указано приблизительное время затвердевания костного цемента из ПММА. Время затвердевания костного цемента из ПММА может отличаться в зависимости от типа используемого костного цемента из ПММА. Следуйте инструкциям производителя, чтобы определить время ожидания отверждения ПММА. Тем не менее, в качестве индикатора того, что костный цемент из ПММА полностью затвердел, дополнительный образец костного цемента из ПММА можно смешать одновременно с образцом, который будет помещен на позвонок, но отложить в сторону и проверить, является ли он еще мягким или полностью затвердевшим. Если он полностью затвердел, это может указывать на то, что ПММА на кости также полностью затвердел, не нарушая комплекс кость + ПММА. Образец кости должен оставаться хорошо увлажненным и прохладным в течение всего периода затвердевания и испытания ПММА. Всего несколько минут воздействия сухого воздуха могут привести к изменению биомеханических свойств. Некоторые исследователи используют компрессионные испытательные машины, оснащенные солевой ванной¹⁹. В настоящем исследовании машина для испытаний на сжатие не имела солевой ванны. Вместо этого в течение всего периода затвердевания и испытаний ПММА регулярно наносился мелкодисперсный физиологический раствор.

5. Анализ кривых нагрузки-смещения для испытаний на одноосное сжатие позвонков L5

1. Скопируйте и вставьте данные о нагрузке (Н) и скорректированном смещении (мм) из электронной таблицы в техническое программное обеспечение для построения графиков и анализа данных (см. Таблицу материалов).
2. Постройте график с нагрузкой (N) по оси Y и скорректированным смещением образца (_{образец} Δx, мм) по оси X (рис. 6). Сделайте это в программном обеспечении, сначала нажав на Windows, New Table, затем Do it, чтобы создать таблицу. Скопируйте скорректированные данные смещения (мм) и нагрузки (N) из исходной таблицы данных в новую таблицу.
3. Затем сгенерируйте осциллограмму для представления необработанных данных, щелкнув Data, затем нажмите XY Pair to Waveform и выберите скорректированные данные смещения для X-Wave и данные нагрузки для Y-Wave. Убедитесь, что в поле «Количество точек» указано правильное количество точек данных, назовите осциллограмму и нажмите « Создать осциллограмму». После того, как осциллограмма создана, сгенерируйте график, щелкнув Windows, затем «Новый график», и поместите осциллограмму на ось Y и «вычислите» по оси X.
4. Используйте инструмент курсора, чтобы отметить точки или области интереса на графике для анализа. Некоторые из точек/областей, представляющих интерес для расчета общих механических свойств цельной кости, упоминаются в шагах 5.4-5.8 (Рисунок 6) и включают работу до разрушения (N x мм), максимальную нагрузку (N), жесткость (N/мм), нагрузку текучести (N) и смещение после текучести (мм).
5. Для расчета работы до разрушения (N x мм) поместите курсор (A) в начале испытания и курсор (B) в точку, непосредственно предшествующую разрушению материала (т. е. на максимальную нагрузку, достигнутую во время испытания, до того, как будет наблюдаться значительное снижение нагрузки).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Таким образом, курсоры A-B будут заключать в скобки все испытание с момента, когда материал начинает выдерживать силы и подвергаться смещению, до точки, когда материал выходит из строя. Отношение работы к отказу (N x мм) можно измерить как общую площадь под кривой (т. е. площадь под кривой между курсорами A и B).
6. Рассчитайте максимальную нагрузку (N) как наибольшее значение нагрузки, наблюдаемой во время испытания (т. е. нагрузку на курсоре B).
7. Рассчитайте жесткость (Н/мм) материала как наклон линейной упругой области (т. е. наклон между курсорами C и D).
8. Предел текучести (N) — это нагрузка, при которой кривая нагрузки-смещения отклоняется от линейности и входит в пластическую область, тем самым сохраняя постоянную деформацию (т. е. нагрузку в точке D). Рассчитайте это, измерив нагрузку в точке D.
9. Вытеснение после текучести (мм) является показателем пластичности материала. Измерьте это как смещение между пределом текучести и точкой разрушения материала (т. е. смещение между курсорами D и B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры, перечисленные выше, являются лишь некоторыми из распространенных механических свойств цельной кости. Это далеко не полный список всех механических свойств цельной кости, которые можно получить из кривой нагрузки-смещения. Другие параметры механических свойств цельной кости включают общее смещение (мм), поглощение упругой энергии (N x мм), упругое смещение (мм), поглощение пластической энергии (N x мм) и пластическое смещение (мм), и это лишь некоторые из них. Кроме того, механические свойства костей на тканевом уровне не указаны; Для этого требуется преобразование данных с использованием определенных анатомических измерений, таких как диаметр кости. Пример кода для выполнения измерений по кривой нагрузки-перемещения в программном обеспечении приведен в Дополнительном файле 1.

Representative Results

С помощью этого пошагового протокола, в котором используется встраивание нагружающей поверхности L5 и трансформируемый трехточечный гибочный станок/машина для испытания на сжатие, можно проводить испытания на сжатие поясничных позвонков мыши для межгрупповых сравнений. В общей сложности двадцать четыре позвонка L5 мыши были подготовлены методом встраивания. Три образца, однако, были повреждены во время удаления позвоночных отростков с помощью алмазного отрезного круга на вращающемся инструменте и, таким образом, не были протестированы. Учитывая это, перечисленные механические свойства были успешно получены из двадцати одного из двадцати четырех образцов методом заделки. Образцы подвергались визуальному осмотру после каждого испытания, и ни в одном из тестов колпачок из ПММА не был поврежден. Как уже отмечалось, мыши, использованные в настоящем исследовании, были частью более крупного исследования, направленного на определение влияния диетического конопляного семени на кости молодых и растущих самок мышей C57BL/6. В таблице 1 представлены описательные статистические данные по пяти наиболее часто сообщаемым механическим свойствам цельной кости. Кривые нагрузки-перемещения для всех двадцати одного образца представлены на рисунке 7.

Иллюстрация 1: Преобразование трехточечного гибочного станка в станок для испытания на сжатие. (A) Станок, полностью оборудованный для работы в качестве трехточечного гибочного станка с указанными датчиками перемещения и нагрузки (белые стрелки). (B) Машина после снятия траверсы. (C) Машина после установки самоустанавливающейся верхней плиты на место, где ранее была установлена траверса. (D) Нижние опорные балки с просверленными в них отверстиями. (E) Нижняя плита из нержавеющей стали с четырьмя резьбовыми отверстиями и винтом, частично ввинченным в одно из отверстий. Два других отверстия, которых не видно на фото, находятся на противоположной стороне. (F) Нижние опорные балки с нижней плитой, прикрепленной к ним четырьмя шестигранными винтами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Пример графика зависимости смещения системы (_машина Δx) от нагрузки, оснащенный линейной (A), логарифмической (B), полиномом второго порядка (C) и полиномиальной регрессией третьего порядка (D). В этом примере полином третьего порядка обеспечивает наилучшее соответствие значению^R2, а его регрессия используется в качестве поправочного коэффициента смещения системы. Изображения представляют собой примеры данных, демонстрирующих регрессионную подгонку, и должны быть получены исследователями для отдельных машин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Поясничный позвоночный столб мыши. Поясничный позвоночный столб мыши под препарирующим микроскопом до того, как L6 был удален (A), и после того, как L6 был удален, оставив L5 прикрепленным (B). После этого L5 будет удален и подготовлен к испытанию на сжатие. Полосы белого цвета – это межпозвоночные диски, которые были рассечены и удалены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Анатомия позвонка L5. Репрезентативный позвонок L5 мыши в краниальной, каудальной, дорсальной и вентральной проекциях под препарирующим микроскопом. Важными размерами тела позвонка являются высота, дорсовентральная ширина и латеральная ширина, как показано цветными линиями. Черными пунктирными линиями показано, где примерно должны быть сделаны надрезы для удаления позвоночных отростков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Период затвердевания костного цемента ПММА. Пример позвонка L5 с костным цементом из ПММА (зеленый), размещенным на краниальной концевой пластине, и верхней валиком, опущенным на костный цемент ПММА + костный комплекс. Как только костный цемент из ПММА полностью затвердеет, начнется испытание на сжатие. Верхняя плита будет опускаться дальше до тех пор, пока не будет наблюдаться разрушение материала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Тест на компрессию позвонков мыши, кривая нагрузки-смещения и анализ данных. Курсор A обозначает начало испытания на сжатие. Курсор B отмечает точку разрушения материала. Курсор C обозначает начало линейной упругой области, в то время как курсор D отмечает конец (т.е. предел текучести). Область, заштрихованная светло-серым цветом, является линейной упругой областью, где материал вернется к своей первоначальной форме при снятии нагрузки. Область, заштрихованная темно-серым цветом, является пластиковой областью, где материал подвергся постоянной деформации и не вернется к своей первоначальной форме при снятии нагрузки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Кривые нагрузки-смещения для всех двадцати одного образца кости. Узоры различались в зависимости от кости. В целом, наибольшая вариабельность наблюдалась в постурожайном смещении, при этом некоторые (n = 5) костей имели относительно небольшое послеурожайное смещение , а другие (n = 16) имели относительно большое постдебитное смещение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Группа	Работа до отказа (Н*мм)	Максимальная нагрузка (Н)	Жесткость (Н/мм)	Предел текучести (Н)	Вытеснение после выхода из текучести (мм)
CON (n = 7)	13.43 ± 2.44 А,Б	37,93 ± 3,28	109.14 ± 11.86	22.68 ± 2.04	0,34 ± 0,06
5HS (n = 8)	12,12 ± 1,23 А	33,62 ± 2,43	99,70 ± 16,62	20,88 ± 2,69	0,38 ± 0,08
15HS (n = 6)	19.55 ± 2.13 млрд	41,82 ± 1,85	134,58 ± 19,73	28.07 ± 3.20	0,51 ± 0,07
Комбинированные группы (n = 21)	14.68 ± 1.27	37,40 ± 1,63	121,82 ± 9,43	23.54 ± 1.60	0,40 ± 0,04

Таблица 1: Репрезентативные значения для часто сообщаемых механических свойств цельной кости, полученные с использованием метода заделки при подготовке поверхности нагружения. Значения были получены с использованием всех протоколов, подробно описанных в настоящем исследовании. Таким образом, значения представляют собой те, которые могут быть получены с помощью методов, описанных здесь. Значения являются средними значениями ± SEM. Группы представляют самок мышей C57BL/6, которых кормили диетой, обогащенной цельным семенем конопли в концентрациях 0% (CON), 50 г/кг (5%) (5HS) или 150 г/кг (15%) (15HS) в возрасте от 5 до 29 недель. По одному из параметров (работа до отказа) оказалось, что диета влияла на значения по одностороннему ANOVA (p < 0,05). Согласно анализу post hoc, значения с одним и тем же буквенным верхним индексом существенно не отличаются (p > 0,05), в то время как значения с разными буквенными надстрочными индексами существенно различаются (p < 0,05).

Дополнительный файл 1: Пример кода для получения механических свойств цельной кости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Discussion

Целью настоящего исследования было описание конструкции трансформируемого трехточечного гибочного станка/машины для испытания на сжатие, а также использования метода заделки костного цемента из ПММА для подготовки образцов поясничных позвонков мышей перед испытанием на одноосное сжатие. Для образцов костей были получены и представлены описательные статистические данные, которые будут полезны для сравнения в будущих исследованиях. В настоящем исследовании были проанализированы некоторые из наиболее часто сообщаемых механических свойств цельной кости. Тем не менее, стоит отметить, что есть несколько дополнительных механических свойств на уровне целых костей и тканей, которые не были исследованы здесь.

Остается неясным, как механические свойства, полученные из образцов, приготовленных методом заделки, соотносятся с образцами, полученными методом вырезания поясничных позвонков мыши. Schumancher¹⁷ ранее оценивал механические свойства позвонков крыс, подготовленных с использованием двух различных методов, и обнаружил, что позвонки, подготовленные с использованием метода заделки, имели значительно меньшую жесткость, более высокое смещение текучести и более высокую деформацию текучести, чем образцы, приготовленные методом резания. Необходимы дальнейшие характеристики, чтобы понять, как сравниваются механические свойства позвонков мышей или других животных моделей при измерении с использованием двух различных методов подготовки поверхности нагрузки. Ожидается, что некоторые параметры различаются между позвонками, подготовленными разными методами, учитывая, что метод встраивания добавляет материал к образцу, но сохраняет концевую пластину, которая является важной структурой при переломах позвонков in vivo ^17,27. Добавление костного цемента к краниальному концу увеличивает высоту образца, в то время как разрезание торцевых пластин удаляет высоту, изменяя соотношение сторон и, таким образом, изменяя механические свойства, такие как жесткость. Кроме того, несмотря на то, что ПММА более жесткий, чем губчатая кость позвонка, возможно, что ПММА претерпевает смещение, и степень этого смещения нуждается в дальнейшей характеристике. Кроме того, неясно, как результаты, полученные с помощью метода встраивания или метода вырезания, соотносятся с предсказаниями параметров костей с помощью конечно-элементного анализа для позвонков мыши, или как результаты изменяются при различных условиях (например, снижение скорости, различные уровни позвонков, состав ПММА). Тем не менее, поскольку все образцы готовятся одинаковым образом, этот метод является подходящим и позволяет легко и экономично проводить сравнения между группами лечения в одном исследовании, где образцы готовятся и тестируются в одинаковых условиях.

Что касается подготовки образцов перед испытанием на сжатие, очень важно подготовить образцы воспроизводимым образом. Одним из возможных ограничений метода, описанного в настоящем исследовании, является использование вращающегося инструмента для удаления позвоночных отростков. Другой метод удаления позвоночных отростков поясничных позвонков мышей был описан Pendleton et ^al.19, что может позволить провести более последовательную пробоподготовку. Кроме того, при применении костного цемента из ПММА могут возникнуть несоответствия. Поэтому важно применять костный цемент последовательно с точки зрения объема, размещения и времени затвердевания. Тем не менее, метод заделки может обеспечить более простой способ достижения последовательной пробоподготовки по сравнению с методом резки, поскольку может быть сложно добиться идеально ровных, параллельных разрезов между всеми образцами из-за их небольшого размера и хрупкости. В будущем потребуются исследования для оценки точности результатов, полученных из образцов, подготовленных с использованием метода встраивания по сравнению с другими методами. Способ резки.

Как уже упоминалось, необходимы дальнейшие характеристики и исследование метода встраивания для подготовки образцов поясничных позвонков мышей перед испытанием на одноосную компрессию. Тем не менее, данное исследование демонстрирует, что такой метод может быть использован, дает подробное описание предлагаемого метода и предлагает описательную статистику параметров, измеренных в образцах, подготовленных с использованием этого метода. Этот протокол представляет ценность для этой области из-за отсутствия в настоящее время доступной методологии. Более того, этот метод может лучше имитировать механизм возникновения переломов позвонков in vivo по сравнению с другими методами^17,27. Преимущество метода также заключается в том, что он преодолевает технические трудности, связанные с другими методами, о которых сообщается в настоящее время, что делает испытание на одноосную компрессию более осуществимым при исследовании костей. Это особенно важно, потому что лекарственные препараты, диеты или другие вмешательства могут по-разному влиять на богатые корой кости (например, длинный средний диафиз) и богатые трабекуляром кости (например, тела позвонков), однако трехточечное сгибание является преобладающим методом оценки механических свойств костей¹³. Комбинация испытаний на трехточечный изгиб и одноосное сжатие может стать еще более достижимой благодаря использованию трансформируемой машины для испытания на трехточечный изгиб/сжатие. Таким образом, настоящее исследование предлагает два возможных способа сделать оценку как богатой корой, так и богатой трабекулярной костей в одном и том же исследовании более доступной для исследователей, что потенциально может привести к лучшему пониманию того, как данное лечение влияет на различные типы костей в экспериментальных группах.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
120-Grit Sand Paper	N/A	N/A	For removal of caudal end plate soft tissues and irregularities
24-bit Load Cell Interface	LoadStar Sensors, Freemont, California, USA	DQ-1000	To connect load and displacement sensors to personal coputer
Base Mouse Diet	Dyets, Inc, Bethlehem, PA, USA	AIN-93G	Diet the mice were fed, without added hempseed
Diamond Cutoff Wheel w/ Rotary Tool	Dremel US, Mt. Prospect, Illinois, USA	F0130200AK	To remove vertebral proccesses
Displacement Sensor	Mitutoyo, Aurora, Illinois, USA	ID-S112EX	Displacement sensor with 0.001 mm resolution and 0.00305 mm accuracy
External Variable Voltage Power Source	Extech Instruments, Nashua, New Hampshire, USA	382213	To provide power to compression testing machine
Female C57BL/6 Mice	Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts, USA	027 (Strain Code)	Mouse model used in present study
Hempseed	Natera, Pitt Meadows, Canada	670834012199	Hempseed added to Base Mouse Diet
Igor Pro Software (Version 8.04)	Wave Metrics, Portland, Oregon, USA	N/A	Sofware used for load-displacement curve analysis
iLoad Mini Force Sensor	LoadStar Sensors, Freemont, California, USA	MFM-010-050-S	Load (force) sensor with 1.0% accuracy
Isotonic (0.9%) Saline Solution	N/A	N/A	To keep bone sampels hydrated
Leica EZ4 W Miscoscope	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	NC1601884	For bone dissections and vertebral process removal
Microsoft Excel Software	Microsoft Corporation, Redmond, Washington, USA	N/A	For data transfer from SensorVue software
PALACOS R Bone Cement	Hareus Medical, Wehreim, Germany	00-1112-140-01	PMMA bone cement for embedding of the loading surface
Personal Computer	N/A	N/A	For data recording (see 24-bit Load Cell Interface, SensorVue Software, Microsoft Excel Software) and analysis (see Igor Pro Software)
SensorVue Software	LoadStar Sensors, Freemont, California, USA	N/A	Software used for real-time data collection during compression testing
Small Animal Dissecting Kit	N/A	N/A	Dissecting scissors, forceps, scalpel, blades, pins, gauze pads
Stainless Steel Top Platen (Self-Alligning) and Bottom Platen Pair	N/A	N/A	Constructed by Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering
Three-Point Bending Machine	N/A	N/A	Constructed by Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering. Refer to Sarper et al. (2014) for further details regarding construction