Mus ländrygg Enaxlig kompressionstestning med inbäddning av lastytan

Summary

I detta protokoll beskrivs två tillvägagångssätt för att göra enaxlig kompressionstestning av ländkotor hos möss mer uppnåelig. Först beskrivs konverteringen av en trepunktsbockningsmaskin till en kompressionsprovningsmaskin. För det andra är en inbäddningsmetod för preparering av belastningsytan som använder bencement anpassad för ländkotor hos möss.

Abstract

Det finns en ökande medvetenhet om att kortikalt och spongiöst ben skiljer sig åt när det gäller att reglera och svara på läkemedelsbehandlingar, hormonbehandlingar och andra behandlingar för åldersrelaterad benförlust. Trepunktsböjning är en vanlig metod som används för att bedöma effekten av en behandling på middiafysregionen av långa ben, som är rik på kortikalt ben. Enaxlig kompressionstestning av muskotor, även om den kan bedöma ben som är rika på spongiöst ben, utförs mindre ofta på grund av tekniska utmaningar. Ännu mindre vanligt är att kombinera trepunktsböjning och kompressionstestning för att avgöra hur en behandling kan påverka ett långt bens mittdiafysregion och ett kotcentrum på samma eller olika sätt. Här beskriver vi två procedurer för att göra kompressionstestning av ländkotor hos möss till en mindre utmanande metod att utföra parallellt med trepunktsböjning: för det första en procedur för att konvertera en trepunktsbockningsmaskin till en kompressionstestmaskin, och för det andra en inbäddningsmetod för att förbereda en musländkotas belastningsyta.

Introduction

Åldersrelaterade benförändringar är allmänt erkända som problematiska på grund av den ökade risken för benfrakturer i samband med dessa förändringar. Benfrakturer hos människor kan leda till kronisk smärta, minskad rörlighet, långvarig funktionsnedsättning, ökad risk för dödsfall och ekonomiska bördor¹. Vanliga terapier som undersöks för att hantera symtomen på åldersrelaterade benförändringar inkluderar kosttillskott, hormonbehandlingar och läkemedel 2,3,4,5,6,7,8,9. Initiala undersökningar av sådana behandlingar för människor görs vanligtvis med hjälp av modeller av små djur (t.ex. laboratorieråttor och möss), som har de två huvudtyperna av ben som finns i det mänskliga skelettet¹⁰. Appendikulära långa ben, såsom humerus, lårben och skenben, är rika på kortikalt (dvs. kompakt) ben, medan kotor är rika på spongiöst ben (dvs. vävt, svampigt eller trabekulärt ben)⁴. Det finns växande kunskap om att mekanismerna för benreglering och signalvägar skiljer sig åt mellan kortikalt ben (t.ex. långt ben i mitten av diafysen) och spongiöst ben (t.ex. kotcentrum)². På grund av detta kan terapier ha olika effekter som är benspecifika eller till och med platsspecifika inom samma ben ^2,3,4.

Appliceringen av kraft på ett föremål (t.ex. ben) gör att föremålet genomgår acceleration, deformation eller båda, beroende på objektets randvillkor. När benet är begränsat motstår en motsatt kraft av samma storlek benets acceleration och deformation uppstår. När benet utsätts för deformation genereras inre motstånd som kallas spänning, av vilka det finns två grundläggande typer: Normal kraft, i form av spänning eller kompression, och skjuvkraft¹⁰. Ofta genereras en kombination av de grundläggande typerna av spänning, beroende på det applicerade kraftsystemet¹⁰. Styrkan hos ett material är dess förmåga att motstå påfrestningar utan att misslyckas. När allt större krafter appliceras på ett material genomgår det så småningom permanent deformation, vid vilken tidpunkt det sägs ha övergått från ett elastiskt tillstånd (dvs. kommer att återgå till sin ursprungliga form om kraften tas bort) till ett plastiskt tillstånd (dvs. kommer inte att återgå till sin ursprungliga form om kraften tas bort)¹¹. Den punkt där övergången från ett elastiskt tillstånd till ett plastiskt tillstånd sker kallas sträckgränsen. När ännu större krafter appliceras på materialet bortom sträckgränsen, får det i allt högre grad mikrofrakturer (dvs. skador) tills total fraktur inträffar; Vid denna tidpunkt sägs materialet ha misslyckats^11,12. Frakturen på ett ben representerar ett misslyckande på både strukturell nivå och vävnadsnivå¹⁰. Som ett exempel kan nämnas att ett kotben bryts av på grund av att flera trabekler inte bara misslyckas på strukturell nivå, utan att det också finns ett fel på extracellulära matriselement som kollagen och hydroxiapatitkristaller i en enskild trabekel på vävnadsnivå.

De mekaniska händelser som leder fram till att ett material går sönder kan mätas med hjälp av en mängd olika testmetoder. Trepunktsböjning är en vanlig metod för att testa de mekaniska egenskaperna hos långa ben från det appendikulära skelettet. Denna metod är enkel och reproducerbar, vilket gör den till den föredragna metoden för biomekanisk testning för många forskare¹³. Genom att sänka en tvärbalk på mitten av diafysen av ett långt ben som vilar på två nedre stödbalkar, testar denna metod specifikt de mekaniska egenskaperna hos mittdiafysregionen, som är tätt organiserat kortikalt ben. Från belastningsförskjutningskurvor kan dragkraftseffekter på elasticitet, seghet, kraft till brott och övergången från elastiskt till plastiskt beteende hos benmaterial, bland andra egenskaper, bestämmas.

I den andra typen av ben, som kallas trabekulärt, svampigt, vävt eller spongiöst ben, formas benelement till en rad stavar och balkar som kallas trabekler, vilket ger ett "svampigt" utseende. De viktigaste kotkropparna (dvs. centra) är rika på spongiöst ben och är ofta platser för åldersrelaterade kompressionsbenfrakturer hos människor¹⁴. Ländkotorna (dvs. nedre delen av ryggen) är de största kotorna, bär större delen av kroppens vikt och är den vanligaste platsen för kotfrakturer^15,16. De mekaniska egenskaperna hos kotkroppar kan bäst bedömas direkt med hjälp av enaxliga kompressionstestmetoder eftersom axiell kompression är den normala kraftbelastningen på kotpelare in vivo¹⁷. Kompression av kotkropparna in vivo sker som ett resultat av muskel- och ligamentsammandragningar, tyngdkraften och markreaktionskrafter¹⁸.

Ex vivo kompressionstestning av små djurkotor kan vara svårt på grund av deras lilla storlek, oregelbundna form och bräcklighet. Formen på kotkropparna kan uppskattas som ett parallellogram med mild ventral lutning och lätt kraniell konkavitet¹⁷. Denna form innebär utmaningar för att uppnå enaxlig kompressionsprovning ex vivo eftersom tryckkrafter endast kommer att appliceras på en del av lastytan utan tillräcklig förberedelse på lastytan, vilket resulterar i en "lokal kontakt"^17,19. Detta kan orsaka inkonsekventa resultat och för tidigt misslyckande¹⁹. Detta är inte fallet in vivo eftersom belastningsytan är omgiven av intervertebrala skivor vid kotlederna, vilket gör att belastningen kan fördelas över hela kranialändplattan. Det intervertebrala skivkraniala ändplattekomplexet spelar en viktig roll i appliceringen av kraft i hela ryggradskroppen och biomekaniken för frakturer på kotkroppen^14,20. Även om kompressionstestning inte är nytt inom biologin, finns det begränsningar i de nuvarande metoderna för mekanisk testning av ben. Dessa begränsningar inkluderar bristen på prediktormodeller och simuleringar för benmekanik, unik geometrisk rumslig arkitektur och till och med inneboende provbaserade biologiska variationer²¹. Ännu viktigare är att fältet utmanas av en brist på standardisering mellan metoder och en övergripande brist på rapporterade metoder i litteraturen²².

Det finns två metoder som rapporterats i litteraturen för beredning av ländkotor på gnagare för att uppnå enaxlig kompressionstestning: skärningsmetoden och inbäddningsmetoden 17,19,23,24,25,26. Skärmetoden kräver att kotutskotten, kranialändplattan och stjärtändplattan skärs av från kotkroppen. Pendleton et ^al.19 har tidigare rapporterat en detaljerad metod för användning av denna metod på ländkotor hos möss. Denna metod innebär utmaningar när det gäller att uppnå perfekt parallella snitt vid både de kaudala och kraniala ändplattorna samtidigt som man undviker skador på provet. Den har också begränsningen att kranialändplattan tas bort. Den kraniala ändplattan innehåller ett tätt skal av kortikalt ben och spelar en viktig roll för att fördela belastningar från de intervertebrala skivorna in vivo och är involverad i benets svikt för in vivo-frakturer 17,20,27. Däremot innebär inbäddningsmetoden att man tar bort kotutskotten samtidigt som den kraniala ändplattan på ryggradskroppen hålls intakt. Belastningsytan görs sedan ungefär horisontell genom att placera en liten mängd bencement på den kraniala änden av kotkroppen. Denna metod har fördelen att den övervinner de tekniska utmaningar som är förknippade med skärmetoden och kan bättre efterlikna mekanismen för belastningsapplicering och bensvikt in vivo på grund av bevarandet av kranialändplattan. Detta tillvägagångssätt har tidigare dokumenterats i studier som involverar enaxlig kompressionstestning på råttben. Men så vitt vi vet har det inte tidigare dokumenterats i samband med mindre ländkotor hos möss 17,25,26. Metoden i fråga har tidigare beskrivits av Chachra et ^al.25 och använde ursprungligen ett benprov som hölls mellan två plattor, var och en med ett cylindriskt hålrum, som sedan fylldes med polymetylmetakrylat (PMMA). Samma forskargrupp förbättrade senare metoden där ena änden slipas försiktigt (caudal) och den andra änden har en liten fläck av bencement tillsatt (kranial)²⁶. Denna metod är en förbättring av den tidigare metoden eftersom den minimerar materialet mellan plattorna och är i fokus för den här artikeln. Trots de utmaningar som är förknippade med enaxlig kotkompressionstestning är det en metod som kan ge värdefull information om effekterna av en föreslagen terapi på ben, särskilt i kombination med trepunktsböjning.

Här presenteras användningen av en konvertibel trepunktsböjnings-/kompressionstestmaskin för att möjliggöra enkel testning av både långa ben och kotkroppar med en enda maskin. Vidare presenteras användningen av en inbäddningsmetod för att uppnå enaxlig kompressionstestning av ländkotor hos möss. Den aktuella studien utfördes som en del av en större studie som syftade till att undersöka effekterna av hampfrötillskott i kosten på egenskaperna hos skelettben hos unga, växande kvinnliga C57BL/6-möss ^5,6. Trepunktsböjningstestaren konstruerades ursprungligen av fakulteten och studenter vid Engineering Dept. vid Colorado State University-Pueblo och användes av vår forskargrupp i trepunktsböjningstester på långa ben [råttlårben och skenben⁷ och mus humerus, lårben och skenben ^5,6,8,9]. Dess modifiering och tillämpning för användning i kompressionstestning av ryggradskroppar hos möss undersöktes dock inte. Trepunktsbockningsmaskinens konstruktion och konstruktion har tidigare beskrivits⁷. Denna rapport kommer att fokusera på metoder som används för att modifiera maskinen för kompressionstestning och för att korrigera för systemförskjutning. För det andra beskrivs inbäddningsmetoden för ytbehandling av muskotors belastningsytor, tillsammans med metoder för enaxlig kompressionstestning och analys av belastningsförskjutningsdata.

Protocol

Alla experiment och protokoll utfördes i enlighet med Guide for the Care and Use of Laboratory Animals från National Institutes of Health och fick godkännande från Colorado State University-Pueblo Institutional Animal Care and Use Committee (protokollnummer: 000-000A-021). Detaljerade rutiner för djurskötsel har tidigare beskrivits ^5,6. Mössen erhölls vid tre veckors ålder som en del av en bredare studie som syftade till att undersöka effekterna av en hampfrökompletterad diet på unga, växande C57BL/6-honmöss (se Materialförteckning). Från 5 till 29 veckors ålder föddes mössen upp på en av tre dieter: kontroll (0 % hampfrö), 50 g/kg (5 %) hampfrö eller 150 g/kg (15 %) hampfrö, med åtta möss per grupp ^5,6. Under hela studien hade mössen fri tillgång till sina respektive dieter och vatten, parinhystes i polykarbonatburar och hölls på en 12 timmars ljus:12 timmars mörk cykel (med lamporna tända från 06:00 till 18:00). Mössens vikt och hälsa bedömdes varje vecka, och alla möss slutförde studien utan att utveckla några negativa hälsotillstånd. Vid tjugonio veckors ålder sövdes mössen djupt med isoflurangas och avlivades via cervikal luxation ^5,6. Ett snitt i mittlinjen gjordes på den ventrala ytan från bröstbenet till svansen, och alla intrathorax-, peritoneala och retroperitoneala organ avlägsnades från slaktkropparna. De urtagna slaktkropparna konserverades i 0,9 % natriumkloridlösning vid -70 °C fram till tidpunkten för bendissektion för kottest, vilket inträffade cirka ett år senare.

1. Konvertering av en trepunktsbockningsmaskin till en kompressionsprovningsmaskin

1. Skruva loss tvärbalken som är fäst vid lastsensorn på trepunktsbockningsmaskinen⁷ (se materialtabell) (Figur 1A,B).
2. Skruva fast en självjusterande toppplatta på belastningssensorn (se materialtabell) med gängning identisk med tvärbalken (Figur 1C).
3. Borra två horisontella hål i vart och ett av de nedre stöden, där bottenplattan kommer att fästas senare (Figur 1D).
4. Knacka in gängorna i de två sidorna av en bottenplatta av rostfritt stål för att passa in med de borrade hålen i de nedre stöden (Figur 1E).
5. Fäst bottenplattan på de två nedre stöden med gängade sexkantsskruvar och dra åt tills den sitter fast (Figur 1F).
   OBS: Sexkantsskruvar måste ha gängor som matchar de gängade hålen på de nedre stöden och topp-/bottenplattorna. Användningen av en självjusterande toppplatta kan bidra till att uppnå jämn kontakt mellan toppplattan och belastningsytan, men det är inte tillräckligt med tanke på konkaviteten hos den kraniala änden av kotkropparna. Ytterligare förberedelse med hjälp av en metod för förberedelse av laddningsytan krävs. När man konstruerar en kompressionstestmaskin för små djurben, som är mindre och svagare än många industriella/tekniska material, är det viktigt att ta hänsyn till lastsensorns lastkapacitet och lastramens storlek. Dessutom bör maskiner rengöras och smörjas regelbundet för att säkerställa korrekta resultat och smidig drift.

2. Korrigering för förskjutningen av kompressionstestmaskinen

1. Om det inte finns något testmaterial mellan den övre plattan och den nedre plattan, sänk ner den övre plattan på den nedre plattan tills lätt kontakt har uppnåtts (~0,3–0,5 N förspänningskraft).
2. Slå på maskinen med en konstant sänkningshastighet (~1 mm/min) för att påbörja kompressionstestningen. Samla in belastnings- (N) och förskjutningsmätningar (mm) med hjälp av digital datainsamlingsprogramvara (se materialförteckning) för datainsamling av mekanisk provning.
   OBS: Eftersom det inte finns något material mellan den övre och nedre plattan, kommer all observerad förskjutning att bero på förskjutning av maskinen ensam (_Δx-maskin) (ram, lastcell, plattor, kopplingar, etc.).
3. Fortsätt att sänka den övre plattan på den nedre plattan med konstant (dvs. monoton) hastighet tills krafter som är högre än vad som kommer att erhållas från alla benprover uppnås.
4. Upprepa steg 2.1 till 2.3 totalt tre gånger.
5. Plotta data för systemförskjutning (_Δx-maskin, mm) vs. applicerad belastning (kraft, N).
6. Anpassa regressionslinjen bäst anpassad till data (figur 2A–D).
7. I ett kalkylblad med data från ett benkompressionstest, använd ekvationen från regressionsanalysen för att bestämma mängden maskinförskjutning (_Δx-maskin) som påverkar den registrerade förskjutningen (Δx_{totalt registrerat}) för en datapunkt i ett kompressionstest för musländkotor.
   ANM.: Tänk dig till exempel en datapunkt där 18 N kraft appliceras och 2,730 mm förskjutning har registrerats (Δx_{totalt registrerat}). Enligt exemplet med tredje ordningens polynomregressionsekvation (figur 2D) [_Δx-maskin = (4 × ^10-7 x applicerad belastning³) - (8 × ^10-5 x applicerad belastning²) + (0,0044 x applicerad belastning)], beror 0,056 mm av den registrerade förskjutningen på maskinförskjutning (_Δx-maskin).
   Totalt_{antal δx-värden = Δx-maskin} + _Δx-prov
8. Korrigera den registrerade förskjutningen för datapunkten.
   OBS: Tänk till exempel på exemplet ovan. Om 2,730 mm förskjutning registreras (Δx_{totalt registrerat}) och maskinförskjutning ₍Δx-maskin) står för 0,056 mm av totalen, är förskjutningen som provet (dvs. ben) av intresse genomgick (Δx-prov) 2,664 mm. Således är 2,664 mm den faktiska förskjutningen som kotan genomgick (Δx-prov) och är det värde som ska användas för analys av belastningsförskjutningskurvan.
   _Δx-prov = Totalt_{antal registrerade} δx-prov _{- Δx-maskin}
9. Upprepa steg 2.7-2.8 för varje datapunkt som samlas in för varje enskilt prov (ben).
   OBS: Detta steg är viktigt eftersom den observerade förskjutningen under kompressionstestning inte bara beror på förskjutning av provet, utan istället är den observerade förskjutningen en kombination av maskinförskjutning (_Δx-maskin) (t.ex. kompression/förskjutning av ramen, lastcellen, plattor, kopplingar, etc.) och provet (Δx-provet). Således, för prover som genomgår relativt små mängder förskjutning, såsom de från ett litet djur (t.ex. mus), kan systemförskjutning (_Δx-maskin) orsaka stora fel. Procedurerna som beskrivs här för att korrigera för systemförskjutning har tidigare rapporterats av Kalidindi och Abusafieh²⁸, som också beskriver två andra metoder utöver den som beskrivs här. Vissa forskare har noterats för att använda mer än en metod för att bestämma systemförskjutning¹⁷. Varje maskin kan uppvisa unika mönster och grader av systemförskjutning när belastningar appliceras på den. Av denna anledning måste korrigeringsfaktorn för systemförskjutning bestämmas för varje maskin och kommer inte att vara densamma mellan två maskiner. Till skillnad från kompressionstestning av ett kotben kommer en stor kraftreduktion inte att observeras vid mätning av systemförskjutning eftersom inget material finns mellan den övre och nedre plattan.

3. Dissektion av den 5^:e ländkotan (L5) från muskroppen

1. Tina frysta muskroppar i rumstemperatur, var noga med att hålla mjuka vävnader och ben återfuktade genom att regelbundet applicera en isoton lösning av 0,9 % NaCl.
2. Gör ett litet (<0,5 cm) snitt i huden på den dorsala mittlinjen nära svansroten, förläng sedan snittet över varje bakben och dra försiktigt för att ta bort skinnet från svansroten till djurets huvud.
3. Klipp bort bukväggsmuskulaturen tills kotpelaren är lätt synlig.
4. Under ett dissekerande mikroskop visualiserar du de två sakroiliakalederna och kranialänden av korsbenet.
5. Använd ett rakblad eller skalpell och gör ett fint snitt för att separera den sista ländkotan (L6) från den kraniala änden av korsbenet.
6. Återigen, skär mellan det intervertebrala utrymmet, ta bort L6 och L5 från ryggraden och avsätt L5 för analys (figur 3).
7. Inspektera kotan under ett dissektionsmikroskop och ta bort alla mjuka vävnader från benet, inklusive den intervertebrala skivan, med mestadels gasbindor och försiktigt med pincett vid behov.
   OBS: I den aktuella studien valdes L5 som den kota som är av intresse, men andra ländkotor kan väljas för kompressionstestning.

4. Förberedelse av L5-kotbelastningsyta för enaxlig kompressionstestning med hjälp av PMMA-bencementinbäddningsmetod

1. Använd en diamantkapskiva (se materialtabell) fäst vid ett roterande verktyg och gör ett snitt vid varje pedikel för att ta bort den tvärgående och spinösa processen (Figur 4). Om de lämnas fästa vid centrum kan kotutskott resultera i lokal kontakt med de övre/nedre plattorna vid själva processerna i motsats till en fördelning av belastningen över centrum.
2. Slipa försiktigt den kaudala änden av kotan med fint 120-kornigt sandpapper (se materialtabell) för att ta bort alla intervertebrala skivor, mjukvävnad och ojämnheter.
3. Märk den slipade stjärtänden med en permanent markör för enkel identifiering senare.
4. Blanda PMMA-bencementet enligt tillverkarens anvisningar (se materialförteckning).
5. Med PMMA-bencementet fortfarande halvmjukt, placera en minimal mängd på den kraniala (omärkta) änden av kotan uppåt, se till att hela ytan är täckt medan kotan sitter i ett saltlösningsbad för att hålla benprovet hydratiserat och svalt.
6. Med PMMA fortfarande halvmjuk, placera kotan på den nedre plattan med den kaudala (markerade) sidan nedåt (Figur 5).
7. Slå på maskinen för att koppla in drivhjulen och sänk långsamt den övre plattan på kotan + PMMA bencementkomplex tills kontakt uppstår med bencementet och minimal kraft (<0.5 N) appliceras för att fördela PMMA jämnt på benytan. Den övre plattan i ett neutralt läge kan uppskattas som horisontell och när den pressas mot halvmjuk PMMA kommer PMMA att fylla konkaviteten på kotans kraniala ände och bilda en plan horisontell yta under den övre plattan.
8. Med den övre plattan försiktigt nedtryckt på PMMA-bencementet, låt provet sitta ostört tills PMMA-bencementet har härdat helt (~10 min enligt tillverkarens instruktioner för PMMA-bencementet som används i denna studie). Förvara provet i ett saltlösningsbad eller spraya det ofta med saltlösning under denna period för att hålla provet hydratiserat och svalt.
9. När PMMA-bencementet har härdat helt kan kompressionstestningen börja. Samla in data för belastning (dvs. kraft) (N) och förskjutning (dvs. nedböjning) (mm) från sensorerna till ett kalkylblad i realtid med hjälp av digital programvara utformad för datainsamling av mekanisk testning (se materialförteckning).
10. Efter baslinjedatainsamling i 5 s, applicerad med en minimal förspänningskraft på <0,5 N, börja sänka toppplattan på provet med en enda (dvs. monoton), förutbestämd sänkningshastighet för att starta kompressionstestet (~1 mm/min).
11. Sluta samla in data när en stor minskning av belastningen (N) har observerats, vilket indikerar materialfel.
    OBS: Tillverkarens instruktioner anger den ungefärliga härdningstiden för PMMA-bencement. Härdningstiden för PMMA-bencementet kan variera beroende på vilken typ av PMMA-bencement som används. Följ tillverkarens instruktioner för att bestämma väntetiden för PMMA-härdning. Som en indikator på att PMMA-bencementet har härdat helt kan dock ytterligare ett prov av PMMA-bencementet blandas samtidigt som provet som kommer att placeras på kotan men hållas åt sidan och kontrolleras för att se om det fortfarande är mjukt eller helt härdat. Om den är helt härdad kan detta tyda på att PMMA på benet också är helt härdat utan att störa benet + PMMA-komplexet. Benprovet måste förbli väl hydrerat och svalt under hela PMMA-härdnings- och testperioderna. Så lite som några minuters exponering för torr luft kan resultera i förändringar i de biomekaniska egenskaperna. Vissa forskare använder kompressionstestmaskiner utrustade med ett saltlösningsbad¹⁹. Kompressionstestmaskinen hade inget saltlösningsbad i den aktuella studien. Istället applicerades en fin dimma av saltlösning regelbundet under hela PMMA-härdningsperioden och testperioden.

5. Analys av belastnings-förskjutningskurvor för L5-kotans enaxliga kompressionstester

1. Kopiera och klistra in belastningsdata (N) och korrigerade förskjutningsdata (mm) från kalkylbladet i ett tekniskt graf- och dataanalysprogram (se Materialförteckning).
2. Generera en graf med belastning (N) på y-axeln och korrigerad provförskjutning (Δx-prov, mm) på x-axeln (figur 6). Gör detta i programvaran genom att först klicka på Windows, Ny tabell och sedan Gör det för att skapa en tabell. Kopiera korrigerade förskjutningsdata (mm) och inläsningsdata (N) från kalkylbladet med rådata till den nya tabellen.
3. Generera sedan en vågform för att representera rådata genom att klicka på Data, klicka sedan på XY Pair to Waveform och välj korrigerade förskjutningsdata för X-Wave och ladda data för Y-Wave. Se till att rätt antal datapunkter finns i rutan "Antal punkter", namnge vågformen och klicka sedan på Gör vågform. När en vågform har skapats, generera en graf genom att klicka på Windows, sedan Ny graf och placera vågformen på Y-axeln och "beräknas" på X-axeln.
4. Använd markörverktyget för att markera punkter/områden av intresse i grafen för analys. Några av de punkter/regioner som är av intresse för att beräkna vanliga mekaniska egenskaper för hela benet nämns i steg 5.4-5.8 (figur 6) och inkluderar arbete till fel (N x mm), maximal belastning (N), styvhet (N/mm), sträckgräns (N) och förskjutning efter efterkastning (mm).
5. För beräkning av felstatus (N x mm), placera en markör (A) i början av testet och en markör (B) vid punkten omedelbart innan materialet går sönder (dvs. vid den maximala belastning som uppnås under testet innan en stor minskning av belastningen observeras).
   OBS: Således kommer markörerna AB, att gaffla hela testet från det att materialet börjar motstå krafter och genomgå förskjutning till den punkt där materialet misslyckas. Arbete till fel (N x mm) kan mätas som den totala arean under kurvan (dvs. arean under kurvan mellan markörerna A och B).
6. Beräkna maximal belastning (N) som det högsta värdet för den belastning som observeras under provningen (dvs. belastning vid markör B).
7. Beräkna materialets styvhet (N/mm) som lutningen för det linjära elastiska området (dvs. lutningen mellan markörerna C och D).
8. Sträckgränsen (N) är den belastning vid vilken lastförskjutningskurvan avviker från linjäriteten och går in i plastområdet och därmed upprätthåller permanent deformitet (dvs. belastning vid punkt D). Beräkna detta genom att mäta belastningen vid markör D.
9. Förskjutningen efter sträckgränsen (mm) är en indikator på ett materials duktilitet. Mät detta som förskjutningen mellan sträckgränsen och materialfelpunkten (dvs. förskjutningen mellan markörerna D och B).
   OBS: Parametrarna som anges ovan är bara några av de vanliga mekaniska egenskaperna för hela benet som rapporteras. Det är inte en fullständig lista över alla mekaniska egenskaper för hela benet som kan erhållas från en belastningsförskjutningskurva. Andra parametrar för mekaniska egenskaper hos hela benet inkluderar total förskjutning (mm), elastisk energi som absorberas (N x mm), elastisk förskjutning (mm), plastisk energi som absorberas (N x mm) och plastisk förskjutning (mm), för att nämna några. Dessutom listas inte benmekaniska egenskaper på vävnadsnivå; Dessa kräver datatransformationer med hjälp av specifika anatomiska mått, till exempel bendiameter. Exempelkod för att göra mätningarna från last-förskjutningskurvan i programvaran har listats i tilläggsfil 1.

Representative Results

Med detta steg-för-steg-protokoll som använder inbäddning av L5-belastningsytan och en konvertibel trepunktsbockningsmaskin/kompressionstestmaskin är det möjligt att utföra kompressionstestning på musens ländkota för jämförelser mellan grupper. Totalt tjugofyra L5-kotor från möss preparerades med hjälp av inbäddningsmetoden. Tre av proverna skadades dock under avlägsnandet av kotprocesserna med hjälp av en diamantkapskiva på ett roterande verktyg och testades därför inte. Med tanke på detta erhölls de listade mekaniska egenskaperna framgångsrikt från tjugoen av tjugofyra prover med hjälp av inbäddningsmetoden. Proverna inspekterades visuellt efter varje test, och PMMA-locket fick inga skador i något av testerna. Som nämnts var mössen som användes i den aktuella studien en del av en större studie som syftade till att fastställa effekterna av hampfrö i kosten på benen hos unga och växande C57BL/6-honmöss. Beskrivande statistik för fem vanligt förekommande mekaniska egenskaper hos hela benet ges i tabell 1. Lastförskjutningskurvorna för alla tjugoen provexemplar visas i figur 7.

Figur 1: Omvandling av en trepunktsbockningsmaskin till en kompressionsprovningsmaskin. (A) Maskinen är fullt utrustad för att fungera som en trepunktsbockningsmaskin med deplacementsensorn och belastningssensorn indikerade (vita pilar). (B) Maskinen efter att tvärbalken har tagits bort. (C) Maskinen efter att en självjusterande toppplatta har placerats där tvärbalken tidigare placerades. (D) De nedre stödbalkarna med hål borrade i dem. (E) Bottenplattan i rostfritt stål med fyra gängade hål gängade i den och en skruv delvis skruvad i ett av hålen. De andra två hålen som inte syns på bilden är på motsatt sida. (F) De nedre stödbalkarna med bottenplattan fäst vid dem med fyra sexkantsskruvar. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Ett exempel på systemförskjutning (_Δx-maskin) kontra belastningsdiagram försett med en linjär (A), logaritmisk (B), andra ordningens polynom (C) och tredje ordningens polynom (D) regression. I det här exemplet ger tredje ordningens polynom den bästa anpassningen per R^2-värde, och dess regression används som korrigeringsfaktor för systemförskjutning. Bilderna representerar exempeldata för att demonstrera regressionsanpassning och måste erhållas av forskare för enskilda maskiner. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3: Ländkotpelare hos möss. En ländkotpelare hos möss under dissektionsmikroskop avlägsnades före L6 (A) och efter att L6 avlägsnats, varvid L5 satt kvar (B). L5 kommer därefter att tas bort och förberedas för kompressionstestning. De vitfärgade banden är de intervertebrala skivorna som dissekerades och avlägsnades. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4: L5-kotans anatomi. En representativ L5-kota hos möss i kranial-, kaudala, dorsala och ventrala vyer under ett dissekerande mikroskop. Viktiga dimensioner för ryggradskroppen inkluderar höjd, dorsoventral bredd och lateral bredd, som visas av de färgade linjerna. De svarta streckade linjerna visar ungefär var snitten ska göras för att ta bort kotutskotten. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 5: Härdningsperiod för PMMA-bencement. Ett exempel på en L5-kota med PMMA-bencement (grönt) placerat på kranialändplattan och den övre plattan sänkt ner på PMMA-bencement + benkomplex. När PMMA-bencement har härdat helt börjar kompressionstestet. Den övre plattan kommer att sänkas ytterligare tills fel på materialet observeras. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 6: Kompressionstest av kotben hos möss belastningsförskjutningskurva och dataanalys. Markör A markerar starten på kompressionstestet. Markör B markerar punkten för materialfel. Markör C markerar början på det linjära elastiska området, medan markör D markerar slutet (dvs. sträckgränsen). Området som är skuggat i ljusgrått är det linjära elastiska området, där materialet återgår till sin ursprungliga form om belastningen tas bort. Området skuggat mörkgrått är plastområdet, där materialet har genomgått permanent deformitet och inte kommer att återgå till sin ursprungliga form om lasten tas bort. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 7: Lastförskjutningskurvor för alla tjugoen benprover. Mönstren varierade mellan benen. I allmänhet var den största variabiliteten i förskjutning efter avkastning, där ett fåtal (n = 5) av benen hade en relativt liten förskjutning efter avkastning och andra (n = 16) hade en relativt stor förskjutning efter avkastning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Grupp	Arbete till fel (N*mm)	Maximal belastning (N)	Styvhet (N/mm)	Sträckgräns (N)	Förskjutning efter sträckgräns (mm)
CON (n = 7)	13,43 ± 2,44 A,B	37,93 ± 3,28	kl 109,14 ± 11,86	kl 22,68 ± 2,04	0,34 ± 0,06
5HS (n = 8)	12,12 ± 1,23 A	33,62 ± 2,43	99,70 ± 16,62	kl 20,88 ± 2,69	0,38 ± 0,08
15HS (n = 6)	19,55 ± 2,13 B	41,82 ± 1,85	kl 134,58 ± 19,73	28,07 ± 3,20	0,51 ± 0,07
Kombinerade grupper (n = 21)	Kl. 14.68 ± 1.27	37,40 ± 1,63	121,82 ± 9,43	23,54 ± 1,60	0,40 ± 0,04

Tabell 1: Representativa värden för vanligt rapporterade mekaniska egenskaper för hela benet som erhållits med hjälp av inbäddningsmetoden för preparering av belastningsytan. Värdena erhölls med hjälp av alla protokoll som beskrivs i denna studie. Värdena representerar alltså de som kan erhållas med hjälp av de metoder som beskrivs här. Värdena är medelvärden ± SEM. Grupperna representerar C57BL/6 honmöss som utfodras med en diet berikad med hela hampfrön i koncentrationer av 0 % (CON), 50 g/kg (5 %) (5HS) eller 150 g/kg (15 %) (15HS) i åldrarna 5-29 veckor. För en av parametrarna (work-to-failure) verkar det som att kosten påverkade värdena per envägs ANOVA (p < 0,05). Värden som delar samma bokstavsupphöjda tecken skiljer sig inte signifikant (p > 0,05), medan värden med olika bokstavsupphöjda tecken skiljer sig signifikant (p < 0,05), enligt Tukey-Kramers post hoc-analys.

Tilläggsfil 1: Exempelkod för att erhålla mekaniska egenskaper för hela benet. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Målet med denna studie var att beskriva konstruktionen av en konvertibel trepunktsbockningsmaskin/kompressionstestmaskin, samt användningen av en PMMA-bencementinbäddningsmetod för beredning av ländkotprover från möss före enaxlig kompressionstestning. Deskriptiv statistik erhölls och rapporterades för benproverna, vilket kommer att vara användbart för jämförelse i framtida studier. Några av de vanligaste rapporterade mekaniska egenskaperna hos hela benet analyserades i den aktuella studien. Det är dock värt att notera att det finns flera ytterligare mekaniska egenskaper på helbens- och vävnadsnivå som inte undersöktes här.

Det är fortfarande oklart hur de mekaniska egenskaperna som erhålls från prover som framställts med hjälp av inbäddningsmetoden jämförs med de som framställts med skärmetoden för ländkotor hos möss. Schumancher¹⁷ har tidigare utvärderat de mekaniska egenskaperna hos råttkotor preparerade med de två olika metoderna och funnit att kotor preparerade med inbäddningsmetoden hade signifikant lägre styvhet, högre utbytesförskjutning och högre sträcktöjning än prover preparerade med skärmetoden. Ytterligare karakterisering behövs för att förstå hur de kotmekaniska egenskaperna hos möss eller andra djurmodeller jämförs när de mäts med de två olika metoderna för att belasta ytpreparering. Det förväntas att vissa parametrar skiljer sig åt mellan kotor som preparerats med olika metoder, med tanke på att inbäddningsmetoden tillför material till provet men bevarar ändplattan, som är en viktig struktur vid kotfrakturer in vivo ^17,27. Tillsatsen av bencement till kranialänden ger höjd till provet, medan skärning av ändplattorna tar bort höjden, ändrar bildförhållandet och därmed ändrar mekaniska egenskaper som styvhet. Dessutom, även om PMMA är styvare än vertebral spongiös ben, är det möjligt att PMMA genomgår förskjutning, och omfattningen av denna förskjutning behöver ytterligare karakterisering. Dessutom är det oklart hur resultaten som erhålls från antingen inbäddningsmetoden eller skärmetoden kan jämföras med förutsägelser av benparametrar med hjälp av finita elementanalys för muskotor eller hur resultaten varierar under olika förhållanden (t.ex. lägre hastighet, olika kotnivåer, PMMA-sammansättningar). Eftersom alla prover bereds på ett likartat sätt är denna metod dock lämplig och möjliggör ett enkelt och kostnadseffektivt sätt att göra jämförelser mellan behandlingsgrupper i en enda studie där proverna bereds och testas under liknande förhållanden.

När det gäller provberedning före kompressionstestning är det viktigt att förbereda prover på ett reproducerbart sätt. En möjlig begränsning av den metod som beskrivs i denna studie är användningen av ett roterande verktyg för att ta bort kotutskotten. En annan metod för att ta bort kotutskotten i ländkotor hos möss har beskrivits av Pendleton et ^al.19, vilket kan möjliggöra en mer konsekvent provberedning. Dessutom kan inkonsekvenser uppstå vid applicering av PMMA-bencement. Därför är det viktigt att applicera bencementet konsekvent när det gäller volym, placering och härdningstid. Inbäddningsmetoden kan dock ge ett enklare sätt att uppnå konsekvent provberedning jämfört med skärmetoden, eftersom det kan vara utmanande att uppnå perfekt jämna, parallella snitt konsekvent mellan alla prover på grund av deras lilla storlek och bräcklighet. Framtida studier kommer att behövas för att bedöma precisionen hos resultat som erhålls från prover som beretts med hjälp av inbäddning vs. skärmetod.

Som nämnts behövs ytterligare karakterisering och undersökning av inbäddningsmetoden för provberedning av ländkotor hos möss före enaxlig kompressionstestning. Icke desto mindre visar denna studie att en sådan metod kan användas, ger en detaljerad beskrivning av den föreslagna metoden och erbjuder beskrivande statistik över de parametrar som mäts från prover som preparerats med metoden. Detta protokoll är värdefullt för fältet på grund av den nuvarande bristen på tillgänglig metodik. Dessutom kan denna metod bättre efterlikna den mekanism genom vilken in vivo kotfrakturer uppstår jämfört med andra metoder^17,27. Metoden har också fördelen att den övervinner de tekniska svårigheter som är förknippade med andra för närvarande rapporterade metoder, vilket gör enaxlig kompressionstestning mer genomförbar inom benforskning. Detta är särskilt viktigt eftersom läkemedel, dieter eller andra ingrepp kan påverka kortikalt rika ben (t.ex. långa ben i mitten av diafysen) och trabekulära rika ben (t.ex. kotkroppar) på olika sätt, men trepunktsböjning är den dominerande metoden för att bedöma de mekaniska egenskaperna hos ben¹³. Kombinationen av trepunktsböjning och enaxlig kompressionsprovning kan bli ännu lättare att uppnå genom användning av en konvertibel trepunktsbocknings-/kompressionsprovningsmaskin. Således föreslår den aktuella studien två möjliga sätt att göra bedömningen av både kortikalt och trabekulärt rikt ben i samma studie mer tillgänglig för forskare, vilket potentiellt kan leda till en bättre förståelse för hur en given behandling påverkar olika bentyper mellan experimentella grupper.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
120-Grit Sand Paper	N/A	N/A	For removal of caudal end plate soft tissues and irregularities
24-bit Load Cell Interface	LoadStar Sensors, Freemont, California, USA	DQ-1000	To connect load and displacement sensors to personal coputer
Base Mouse Diet	Dyets, Inc, Bethlehem, PA, USA	AIN-93G	Diet the mice were fed, without added hempseed
Diamond Cutoff Wheel w/ Rotary Tool	Dremel US, Mt. Prospect, Illinois, USA	F0130200AK	To remove vertebral proccesses
Displacement Sensor	Mitutoyo, Aurora, Illinois, USA	ID-S112EX	Displacement sensor with 0.001 mm resolution and 0.00305 mm accuracy
External Variable Voltage Power Source	Extech Instruments, Nashua, New Hampshire, USA	382213	To provide power to compression testing machine
Female C57BL/6 Mice	Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts, USA	027 (Strain Code)	Mouse model used in present study
Hempseed	Natera, Pitt Meadows, Canada	670834012199	Hempseed added to Base Mouse Diet
Igor Pro Software (Version 8.04)	Wave Metrics, Portland, Oregon, USA	N/A	Sofware used for load-displacement curve analysis
iLoad Mini Force Sensor	LoadStar Sensors, Freemont, California, USA	MFM-010-050-S	Load (force) sensor with 1.0% accuracy
Isotonic (0.9%) Saline Solution	N/A	N/A	To keep bone sampels hydrated
Leica EZ4 W Miscoscope	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	NC1601884	For bone dissections and vertebral process removal
Microsoft Excel Software	Microsoft Corporation, Redmond, Washington, USA	N/A	For data transfer from SensorVue software
PALACOS R Bone Cement	Hareus Medical, Wehreim, Germany	00-1112-140-01	PMMA bone cement for embedding of the loading surface
Personal Computer	N/A	N/A	For data recording (see 24-bit Load Cell Interface, SensorVue Software, Microsoft Excel Software) and analysis (see Igor Pro Software)
SensorVue Software	LoadStar Sensors, Freemont, California, USA	N/A	Software used for real-time data collection during compression testing
Small Animal Dissecting Kit	N/A	N/A	Dissecting scissors, forceps, scalpel, blades, pins, gauze pads
Stainless Steel Top Platen (Self-Alligning) and Bottom Platen Pair	N/A	N/A	Constructed by Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering
Three-Point Bending Machine	N/A	N/A	Constructed by Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering. Refer to Sarper et al. (2014) for further details regarding construction