Summary
Burada, karaciğer mimarisini bozmadan, ancak karaciğer dışı faktörlerin yokluğunda karaciğer metabolizmasının akut ve doğrudan regülasyonunu incelemek için fare karaciğerinin yerinde perfüzyonu için sağlam bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
Karaciğer, besin metabolizması da dahil olmak üzere çok sayıda fonksiyona sahiptir. Diğer in vitro ve in vivo karaciğer araştırma modellerinin aksine, izole edilmiş perfüze karaciğer, karaciğer biyolojisi ve metabolizmasının, karaciğer dışı faktörlerin etkisinden ayrılmış, bozulmamış bir hepatik mimari ile tüm karaciğerde incelenmesine izin verir. Karaciğer perfüzyonları başlangıçta sıçanlar için geliştirilmiştir, ancak yöntem farelere de uyarlanmıştır. Burada fare karaciğerinin in situ perfüzyonu için bir protokol tarif ediyoruz. Karaciğer, oksijenli Krebs-Henseleit bikarbonat tamponu ile portal venden antegrad olarak perfüze edilir ve çıktı, devreyi kapatmak için infrahepatik inferior vena kavanın klemplenmesi ile suprahepatik inferior vena kavadan toplanır. Bu yöntem kullanılarak, bir test bileşiğinin doğrudan hepatik etkileri, ayrıntılı bir zaman çözünürlüğü ile değerlendirilebilir. Karaciğer fonksiyonu ve canlılığı en az 3 saat boyunca stabildir ve aynı deneye iç kontrollerin dahil edilmesine izin verir. Bu modeli kullanan deneysel olasılıklar çoktur ve karaciğer fizyolojisi ve karaciğer hastalıkları hakkında fikir verebilir.
Introduction
Karaciğer metabolizmada önemli bir organdır. Glikoz, lipid ve amino asit metabolizmasını düzenleyerek tüm vücut enerji dengesinin kontrolünde anahtar rol oynar. Dünya çapında karaciğer hastalıklarındaki artış, önemli bir küresel sağlık yükü olarak ortaya çıkmaktadır ve patofizyoloji ve karaciğer fonksiyonları üzerindeki sonuçları hakkında daha fazla bilgiye ihtiyaç vardır.
İn vivo çalışmaları tamamlamak için karaciğer araştırmaları için çeşitli in vitro modeller geliştirilmiştir. Kemirgenlerden ve insanlardan izole edilmiş ve kültürlenmiş primer hepatositler yaygın olarak kullanılmaktadır. Parankimal olmayan hücreler, diferansiyel ve gradyan santrifüjleme kullanılarak hepatositlerden ayrılabilir ve farklı hücre tiplerinin ko-kültürü, hücreler arası karışma1'i incelemek için yararlıdır. Primer insan hepatositleri, ilaç toksisitesini test etmek için altın standart olarak kabul edilse de, birkaç çalışma, hepatositlerin doku kültüründe hızla farklılaştığını ve bunun sonucunda hepatik fonksiyonların kaybına neden olduğunu göstermiştir 2,3,4. 3D sferoid sistemdeki hepatosit kültürü, farklılaşmayı iyileştirir, daha kararlıdır ve karaciğeri in vivo olarak geleneksel 2D kültür sistemlerinden daha yüksek derecede taklit ediyor gibi görünmektedir5. Hassas kesilmiş karaciğer dilimleri, doku mimarisini sağlam tutan ve karaciğerde bulunan parankimal olmayan hücreleri içeren bir başka köklü in vitro modeldir6. Daha gelişmiş in vitro modeller arasında çip üzerinde karaciğer7 ve karaciğer organoidleri8 bulunur. Bununla birlikte, tüm bu yaklaşımlarla, vektörel portal-hepatik ven akışı da dahil olmak üzere yapısal bütünlük ve akış dinamiklerinde bir kayıp vardır ve bu da genellenebilirliği büyük olasılıkla etkiler.
İzole perfüze sıçan karaciğeri ilk olarak 1855'te Claude Bernard tarafındantanımlanmıştır 9 ve hala karaciğer biyolojisi, toksikoloji ve patofizyoloji çalışmaları için çeşitli bilimsel alanlarda kullanılmaktadır. Perfüze karaciğerin yukarıda belirtilen in vitro modellere göre avantajları arasında hepatik mimarinin korunması, vasküler akış, hepatosit polaritesi ve zonlaması ve hepatositler ile parankimal olmayan hücreler arasındaki etkileşimler yer alır. İn vivo çalışmalarla karşılaştırıldığında, perfüze karaciğer, kan tarafından taşınan karaciğer dışı faktörlerden kaçınarak ve deneysel koşullar üzerinde tam kontrol ile karaciğer metabolizmasının izole bir şekilde incelenmesine izin verir. 10,11,12,13 yıllarında sıçan karaciğer perfüzyon modelini geliştirmek için çeşitli değişiklikler yapılmıştır. İzole perfüze karaciğer çalışmaları için fareler kullanılmış olsa da, daha az literatür mevcuttur. Burada, fare karaciğerinden gelen hepatik venöz atık suda gerçek zamanlı olarak ölçülen metabolik substratlara ve hormonlara akut ve doğrudan metabolik yanıtları incelemek için portal ven ve suprahepatik vena kava inferiorunun kanülasyonu ile fare karaciğerinin in situ perfüzyonu için bir yöntem sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri, Danimarka Hayvan Deneyleri Müfettişliği, Danimarka Çevre ve Gıda Bakanlığı (izin 2018-15-0201-01397) ve yerel etik komitesinin izniyle 2010/63/EU sayılı AB direktifi, Ulusal Sağlık Enstitüleri (yayın No. 85-3) ve hayvan deneylerini düzenleyen Danimarka mevzuatının yönergeleri izlenerek gerçekleştirilmiştir (1987). Bu terminal bir prosedürdür ve ölüm nedeni derin anestezi altında diyaframın kansızlaşması ve delinmesidir.
1. Deney hayvanları
- İstenilen suş, yaş ve cinsiyete sahip fareler elde edin. Bu çalışmada 11-16 haftalık erkek C57BL / 6JRj fareleri kullanılmıştır. Kafes başına 5 adede kadar erkek veya 8 dişi fareyi, yem ve suya ad libitum erişimi ile barındırın ve sabah 6'dan akşam 6'ya kadar ışıklar açıkken 12 saat/12 saat aydınlık-karanlık döngüsünü sürdürün.
2. Ameliyat öncesi hazırlıklar
- Karaciğer perfüzyon tamponu yapın.
- Krebs-Henseleit Tamponu. 118 mmol/L NaCl, 4,7 mmol/L KCl, 1,2 mmol/LMgSO4 ve 1,2 mmol/L KH2PO4'ü dH2O içinde karıştırın ve çözün.
- 25 mmol/L NaHCO3'ü çözün ve karıştırırken tampona yavaşça ekleyin. Tamponu 4 derecede saklayın. Tampon en az 1 ay stabildir.
NOT: CaCl2 ve NaHCO3 eklenmeden önce ayrı ayrı çözülmezse çökelme meydana gelebilir.
- Perfüzyon tamponunu 2 μm'lik bir filtreden süzün ve HCl kullanarak pH'ı 7.5'e ayarlayın.
NOT: Kapalı şişelerde saklandığında bile pH zamanla arttığı için bu adım deney gününde gerçekleştirilmelidir. - Test bileşiklerini istenen nihai konsantrasyondan daha yüksek bir konsantrasyonda hazırlayın (örneğin, filtrelenmiş ve pH ayarlı Krebs-Henseleit perfüzyon tamponunda bir yan kol pompası ile 20 mL / dak hızında infüze edildiğinde 0.175x konsantrasyon). Uygunsa, Krebs-Henseleit perfüzyon tamponundaki test bileşiklerini, taşıyıcı olarak %1 BSA eklenmiş (tüm peptitler için gerekli olan boru ve cam eşyalara yapışmayı önlemek için), uygun boyutta bir filtreden süzülerek seyreltin.
3. Operasyon ve perfüzyon
NOT: Bu çalışmada kullanılan perfüzyon kurulumunun bir gösterimi Şekil 1'de verilmiştir.
- Karaciğere yeterli oksijen sağlamak ve işlemin başlangıcından itibaren doğru pH'ı korumak için perfüzyon tamponunu (%95 O 2,% 5 CO2) en az 30 dakika gazlayın (bikarbonat tampon sistemi sürekli gazlama altında 7.4 pH'a ulaşacaktır, bkz. Ek Şekil 1).
- İntraperitoneal enjeksiyon ile ketamin (90 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) uygulayarak bir fareyi uyuşturun.
- Fareyi ısıtılmış bir ameliyat masasına sırtüstü yerleştirin ve ayak parmağının sıkışmasına yanıt olarak refleks eksikliğini onaylayın. Saçın makasa yapışmasını önlemek için %70 etanol püskürtün. Fareyi sıcak yüzeye sabitlemek, aşağıdaki prosedürler için kararlılığı artırmaya yardımcı olur.
- Karın tabanında makasla bir kesi yapın ve karın boşluğunu ortaya çıkarmak için her iki taraftan göğüs kafesine doğru yukarı doğru kesin. Portal damarı açığa çıkaran bir pamuklu çubuk kullanarak bağırsakları sağa doğru hareket ettirin.
- Kavisli forseps kullanarak portal damarın altına iki bağ yerleştirin ve her bağ için gevşek bir düğüm hazırlayın.
- Portal vene 0,7 mm'lik bir kateter yerleştirin. Delindiğinde, iğneyi kateterden çıkarın ve Şekil 2'de gösterildiği gibi kateterin ucu karaciğere yakın olana kadar kateteri damar boyunca yönlendirin. Kan katetere akar.
- Bağları sıkın. Kateter kanla dolu değilse, hava kabarcığı girmesini önlemek için perfüzyon tamponu ile doldurun.
- Perfüzyon tüpünü takın ve silindir pompasını 0.8 mL/dk perfüzyon akış hızında çalıştırarak 37 °C'de Krebs-Henseleit bikarbonat tamponu ile karaciğerin perfüzyonunu başlatın. Karaciğer saniyeler içinde soluklaşır.
- Makas kullanarak göğüs kafesini ve diyaframı kesin. Bu noktada, hayvana ötenazi yapılır. İnce uçlu forseps kullanarak suprahepatik inferior vena kava altına bir bağ yerleştirin. Damarı daha erişilebilir hale getirmek için farenin arkasına bir kalem, rulo gazlı bez veya başka bir tek kullanımlık öğe yerleştirin.
- Kalbin sağ atriyumundan suprahepatik inferior vena kavaya bir kateter yerleştirin. Delindiğinde, iğneyi kateterden çıkarın ve kateterin ucu karaciğere yakın olana kadar kateteri damar boyunca yönlendirin. Kan ve perfüzyon tamponu hemen biter.
- Bağı sıkın ve perfüzyon atıklarının toplanması için bir tüp takın. Tüm tüpleri su geçirmez bantla (şık bant veya benzeri) sabitleyin.
- Karışımı önlemek için sağ renal venin hemen üzerindeki infrahepatik vena kava boyunca bir damar klempi yerleştirmek için bir damar klemp adaptörü kullanın (Şekil 2).
- Perfüzyon akış hızını 3,5 mL/dk'ya yükseltin ve bir zamanlayıcı başlatın. Basınç kaydını başlatın. Başarılı perfüzyon genellikle ~ 10 mm / Hg'lik bir basınçla sonuçlanır.
- Karaciğeri tuzlu suyla nemlendirilmiş steril bir örtü ile örtün ve kurumasını önlemek için deney sırasında salin ekleyin.
- Perfüzyon atık suyunu 1 dakika boyunca toplayın ve hacmi ölçün. Hacim yaklaşık 3.5 mL / dak olmalıdır. Bu aşamada kan karışımı beklenmez ve kalp artık pompalamaz.
- Deneye başlamadan önce 30 dakikalık bir dengeleme süresi bekleyin.
Şekil 1: Perfüzyon kurulumunun bir gösterimi. (A) Ameliyat masası bir tripod standı üzerinde yükseltilir ve 37 °C'ye ısıtılır. Perfüzyon tamponu gazlanır (%95 O 2,% 5 CO2 ' dir), peristaltik silindirli bir pompa ile pompalanır ve yerleşik bir kabarcık tutucu ile ısı eşanjöründe ısıtılır. Sistem ayrıca perfüzyon basıncının ayarlanması için bir manometre ve mil pompasından oluşur. Perfüzyon basıncı, bir PC'deki bir dönüştürücü, bir basınç kayıt programı aracılığıyla sürekli olarak kaydedilir ve görselleştirilir. (B) Kırmızı kutu, üç muslukların bağlantılarını yakalar. İlk üç vana, bir şırınga pompası aracılığıyla bir test bileşiğinin infüzyonu için açıktır ve ikincisi kapalıdır. Üçüncüsü sürekli basınç ölçümleri için açıktır. Dördüncü musluk, örneğin perfüze karaciğer boyunca gaz analizi için girdi numunelerini toplamak için kullanılabilir. Konektörler, daha fazla veya daha az infüzyon hattı gerektiren belirli deneyler için gerektiği gibi değiştirilebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Karaciğer perfüzyonu öncesi ve sırasında fare karın boşluğunun fotoğrafları . (A) Yeşil nokta, portal ven kateterinin ucunun yerini gösterir. Kateterin ucunun, portal venin dallanma noktasının hemen altında, sol ve sağ hepatik portal venlere ancak pankreato-duodenal dalın üzerinde yer alması sızıntıyı önlemek için önemlidir. Sarı nokta, kanın perfüze karaciğere geri akışını önlemek için sağ böbrek veni ile karaciğer arasındaki infrahepatik inferior vena kava üzerindeki damar klempinin doğru yerini gösterir. (B, C) Portal ven (B) ve suprahepatik inferior vena kava (C) ve infrahepatik inferior vena kava (B) üzerindeki damar klempine yerleştirilen iki kateter ile perfüze edilmiş bir fare karaciğeri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
4. Deney
- Dengeleme periyodunun sonunda bir kesir toplayıcı kullanarak ilk temel numuneleri toplayarak deneye başlayın. İstenilen zaman aralığında numuneleri toplayın ve hemen buzun üzerine koyun.
- Kabarcık kapanını düzenli olarak kontrol edin ve boşalmaya yakın olduğunda perfüzyon tamponu ile yeniden doldurun.
- Tamponun bir örneğini, organa girmeden hemen önce üç bir musluktan ve inferior vena kavaya yerleştirilen toplama kateterinden (karaciğerden perfüze edildikten sonra) toplayın.
- Organın metabolik olarak aktif olduğunu doğrulamak için numuneleri bir kan gazı analizörü ile ölçün (CO2'nin kısmi basıncında bir artış ve pH'da bir azalma ile gösterilir).
- Deney boyunca uygulanabilirliği değerlendirmek için deneyin sonunda 4.3-4.4 adımlarını tekrarlayın (Ek Şekil 2).
NOT: Oksijen kısmi basıncındaki azalma, tüp, organ vb. oksijen kayıpları nedeniyle güvenilir bir solunum ölçüsü sağlamaz. - 15 dakikalık başlangıç perfüzyonundan sonra, bir şırınga pompası kullanarak istenen akış hızında üç bir musluktan bir test maddesini infüze ederek ilk stimülasyonu başlatın (örneğin, bir yan kol pompası aracılığıyla 20 mL/dak hızında infüze edildiğinde test maddesinin 0.175x konsantrasyonu). Alternatif olarak, temel tamponu, son konsantrasyonda test bileşiğini içeren yeni (oksijenli ve ısıtılmış) bir tampona geçirin.
- Stimülasyonu durdurun ve ikinci stimülasyona başlamadan önce 20-30 dakika boyunca temel numuneler toplayın.
- Deneyin sonunda, 5-10 dakika boyunca uygun bir pozitif kontrol uygulayın.
- Deneyden sonra, perfüze karaciğeri eksize edin ve çıktıyı karaciğer ağırlığına normalleştirmek için tartın. Çıktıyı protein içeriğine normalleştirmek için protein içeriğinin potansiyel ölçümü için karaciğeri sıvı nitrojen içinde dondurun.
5. Biyokimyasal ölçümler
- Perfüzyon tamponundaki ölçümler için uygun tahlilleri (kurum içi veya ticari olarak temin edilebilen kolorimetrik veya ELISA tahlilleri) kullanarak ilgilenilen molekülün konsantrasyonunu ölçün. Tampon, metabolomik ve proteomik gibi çoğu omik tabanlı teknikle uyumludur.
NOT: Bu çalışmada üre, daha önce tarif edilen bir kolorimetrik teste dayalı olarak ölçülmüştür14. Glikoz ve esterleştirilmemiş yağ asitleri, ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak ölçüldü.
6. Veri analizi
- Verileri, zaman içindeki salgı çıktısını gösteren XY grafiklerinde sunun.
NOT: İn vitro perfüzyon sisteminin erdemlerinden biri, in vivo çalışmalarda olduğu gibi çıktıda ölçülen konsantrasyon (mmol/L) yerine verileri gerçek çıktı (konsantrasyon × akış hızı, örneğin μmol/dk) olarak ifade etmenin mümkün olmasıdır. Farklı fare modellerini karşılaştırırken çıktıyı karaciğer ağırlığına veya kontrol farelerini, karaciğer ağırlığındaki bir artışın artan yağ içeriğine bağlı olabileceği obezite veya karaciğer hastalıkları olan fare modelleriyle karşılaştırırken toplam protein içeriğine (BCA ile ölçülür) normalleştirmeyi düşünün. - Özet verileri, başlangıç sırasında ve bir stimülasyon periyodu boyunca (tipik olarak 15-30 dakika) ortalama veya toplam çıktıyı temsil eden hayvan başına ayrı noktalar veya çalışma tasarımına bağlı olarak her stimülasyon periyodu için önceki taban çizgisini kullanarak artımlı çıktı olarak sunun.
- Verileri, çoklu test için uygun bir post-hoc test ile eşleştirilmiş t-testi (iki grup) veya tekrarlanan stimülasyonlarla (ikiden fazla grup) tek yönlü ANOVA kullanarak analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir uyaranın veya substratın ilgilenilen molekülün salınmasına yol açıp açmadığını belirlemek için sabit bir taban çizgisi gereklidir. Şekil 3A'da başarılı bir deney örneği gösterilmektedir. Perfüze karaciğerde üre üretimi 2 dakikalık aralıklarla ölçülür ve ortalama ± SEM olarak gösterilir. İki stimülasyon periyodunun her birinden önceki başlangıç periyotları sabittir. İki stimülasyon periyodu boyunca ortalama üre üretimi ve ilgili önceki taban çizgileri Şekil 3B'de gösterilmektedir. Dönemler arasındaki istatistiksel anlamlılık, tekrarlı ölçümlerle tek yönlü ANOVA kullanılarak test edildi. Bu sonuçlara dayanarak, farklı dozlar veya test bileşikleri ile tekrarlanan stimülasyonların değerlendirilmesinde önemli bir kontrol deneyi olan, karışık amino asitlerle iki ardışık stimülasyona üre yanıtının benzer olduğu sonucuna varılabilir.
Ürejeneze ek olarak, yukarıdaki protokolü kullanarak hepatik glikojenoliz ve lipolizi incelemek mümkündür. Şekil 3C-F, glukagon ile infüzyon sırasında ayrı bir deneyden elde edilen verileri göstermektedir. Glikoz (Şekil 3C) ve esterleşmemiş yağ asitlerinin (NEFA) (Şekil 3E) salınımı 4 dakikalık periyotlarla ölçüldü. Glukagon infüzyonu sırasında sırasıyla glikoz ve NEFA'da güçlü bir artıştan önce sabit bir bazal glikoz salınımı (Şekil 3C) ve NEFA (Şekil 3E) gözlenir. Bazal durumdaki ve glukagon infüzyonu sırasındaki ortalama değerlere dayanarak, glukagonun hepatik glikojenolizi (Şekil 3D) ve lipolizi (Şekil 3F) hızla uyardığı sonucuna varılabilir.
Şekil 4, görünüşte başarısız deneylerin bir örneğini göstermektedir. Ürenin bazal salınımı kararsızdır ve stimülasyon periyotları, bir sonraki stimülasyon başlamadan önce üre üretiminin bazal seviyelere dönmesi için birbirine çok yakındır. Sabit bazal dönemler olmadan, bir üre tepkisini diğerinden ayırt etmek mümkün değildir. Bu verilerden, farklı glikoz konsantrasyonlarının perfüze fare karaciğerinde amino asit kaynaklı ürejenezi etkileyip etkilemediği sonucuna varmak imkansızdır. Deneysel protokoller bunun yerine, her stimülasyon periyodundan önce sabit bir taban çizgisine ulaşmak için iki ardışık stimülasyon arasında 20-30 dakikalık başlangıç periyotları ile tasarlanmalıdır.
Şekil 3: Perfüze fare karaciğerinden alınan kaliteli veriler. (A,B) Üre toplamı, bazal koşullar sırasında ve karışık amino asitlerin (10 mM) ve glikozun (6 mM) uygulama dönemlerine yanıt olarak gösterilir. Veriler, her stimülasyon ve önceki bazal dönemde (A) ortalama ± SEM ve (B) ortalama değerler olarak sunulur (her nokta bir fareyi temsil eder), n = 6. (C, D) Glikoz ve (E,F) esterleşmemiş serbest yağ asitleri (NEFA) toplam çıktıları bazal koşullarda ve glukagon (10 nM) uygulamasına yanıtta gösterilmiştir. Veriler, bazal ve stimülasyon periyodu boyunca (C,E) ortalama ± SEM ve (D,F) ortalama değerleri olarak sunulur (her nokta bir fareyi temsil eder), n = 6. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Perfüze fare karaciğerinden alınan düşük kaliteli veriler. Üre toplam çıktısı, karışık amino asitlere (10 mM) ve azalan glikoz konsantrasyonlarına (18 mM, 12 mM, 6 mM, 3 mM ve 0 mM) yanıt olarak bazal koşullarda gösterilir. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur, n = 3. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: %95 O2 + %5 CO2 ile gazlama sırasında Krebs-Henseleit bikarbonat tamponunda oksijen ve karbondioksit ve pH'ın zamana bağlı kısmi basıncı. (A) %95 O2 +% 5 CO2 ile gazlamanın başlamasından sonra belirtilen zaman noktalarında perfüzyon sisteminden geçirildikten sonra toplanan Krebs-Henseleit perfüzyon tamponu (deneyden önce ayarlanmamış pH) numunelerinde kısmi oksijen basıncı, (B) karbondioksit ve (C) pH. Perfüzyon tampon örnekleri kan gazı analizörü ile ölçüldü. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: Perfüze karaciğer boyunca oksijen ve karbondioksit ve pH'ın kısmi basıncındaki değişiklikler. (A) Karaciğere ulaşmadan hemen önce ve perfüze karaciğerden 1 dakika ve 180 dakika sonra bir deneye geçirildikten sonra toplanan Krebs-Henseleit perfüzyon tamponu örneklerinde kısmi oksijen basıncı, (B) karbondioksit ve (C) pH. Perfüzyon örnekleri kan gazı analizörü ile ölçüldü. Veriler ortalama ± SD olarak gösterilmiştir. **P < 0.01, ****P < 0.0001, Holm-Sidak yöntemi kullanılarak çoklu test için düzeltilmiş çoklu eşleştirilmiş t-testleri ile. n =14 olur. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İzole perfüze fare karaciğeri, hepatik metabolizmanın dinamikleri ve moleküler mekanizmaları üzerine yapılan çalışmalar için güçlü bir araştırma aracıdır. Dakikadan dakikaya numune toplama imkanı, bir test bileşiğinin karaciğer üzerindeki doğrudan etkisinin ayrıntılı bir değerlendirmesini sağlar. İn vivo çalışmalarla karşılaştırıldığında, perfüze karaciğer, kan tarafından taşınan karaciğer dışı faktörlerden kaçınarak ve deneysel koşullar üzerinde tam kontrol ile karaciğer metabolizmasını izole bir şekilde incelememize izin verir. İzole hepatositlerin kullanıldığı in vitro çalışmalara kıyasla karaciğer perfüzyonunun avantajları, hepatik mimarinin, polaritenin, bölgesel bölünmenin ve vasküler bütünlüğün korunmasıdır. Karaciğer perfüzyonunun bir diğer avantajı, aynı örnekte birkaç sonucun ölçülmesine izin veren büyük örnek boyutu hacmidir (3.5 mL / dak). Bununla birlikte, perfüze karaciğer, transkripsiyonel düzenlemeye bağlı etkileri incelerken ideal değildir, çünkü bu tür mekanizmaların ortaya çıkması birkaç saat sürebilir. Metabolik araştırmalara ek olarak, protokol karaciğerin endokrin fonksiyonlarını (hormonların ve hepatokinlerin salgılanması) ve ilaçların ve ksenobiyotiklerin karaciğer metabolizmasını incelemek için diğer araştırma alanlarında uygulanabilir.
Bu yöntem için en kritik basamak kateterin portal ven içine yerleştirilmesidir. Kateter ucunun portal venin dal noktasından hemen önce sol ve sağ hepatik portal venlere yerleştirilmesi önemlidir (Şekil 2). Kateterin ucu çok fazla itilirse, karaciğerin sadece bir kısmı uygun şekilde perfüze edilecektir. Portal venin çok aşağısına yerleştirilirse, pankreato-duodenal daldan sızıntı meydana gelebilir. Toplama için ikinci kateterin yerleştirilmesi daha az acildir, çünkü bu aşamada karaciğer zaten oksijenli tampon ile perfüze edilmiştir. Operasyon başarılı bir şekilde gerçekleştirildiğinde, karaciğer sabit bir basınç ve perfüzyon çıkışı ile en az 3 saat boyunca solunum yapacak ve yanıt verecektir (Ek Şekil 2). Bu aşamada, perfüzyon sisteminde hava kabarcıklarının önlenmesi, başarılı bir deney için en önemli faktördür. Tampon sürekli olarak oksijenle gazlandığı için hava kabarcıklarından tamamen kaçınmak zordur, ancak kabarcıklar perfüzyon sisteminin kabarcık tuzağında tutulmalıdır. Bu nedenle, kabarcık tuzağına dikkat etmek ve boşalmaya yakın olduğunda perfüzyon tamponu ile yeniden doldurmak önemlidir.
Krebs-Henseleit tamponu (KHB), karaciğer perfüzyonları için en yaygın kullanılan çözeltidir13. Klasik formülasyon 2.5 mmol/L CaCl2 içerir, ancak kalsiyumun mitokondriyal hasara katkıda bulunduğunu gösteren önceki bir çalışmaya dayanarak, sadece 1.25 mmol/L CaCl212 içeren bir tampon kullanıyoruz. Tampona eritrosit, albümin veya glikoz eklenmesine gerek yoktur11. Önerilen tampon ayrıca kütle spektrometrisi tabanlı metabolomikler gibi gelişmiş biyokimyasal teknikler kullanılarak moleküler profillemeye izin verir. Optimal dozu belirlemek ve fizyolojik ve farmakolojik etkileri değerlendirmek için bir test bileşiğinin farklı konsantrasyonları test edilebilir. Bu çalışmada yapılan deneylerde, 10 mM AA, postprandiyal seviyelere karşılık gelen yüksek fizyolojik aralıkta, 10 nM glukagon ise farmakolojik bir doza karşılık gelir. Şekil 4'te gösterildiği gibi, ilgili yanıtların dinamiklerini ve moleküler mekanizmalarını karşılaştırabilmek için iki ardışık stimülasyon arasına 20-30 dakikalık başlangıç periyodunun dahil edilmesi önemlidir.
Üre ve glikoz konsantrasyonlarının kolorimetrik olarak belirlenmesi gibi sonraki analizlere müdahale edebileceğinden, perfüzat numunelerinde kandan kaçınmak önemlidir. Toplanan örneklerde dengeleme periyoduna ~ 15 dakika sonra kan görünüyorsa, infüzyonlar için 3 bir vana açıldığında veya kabarcık kapanı doldurulduğunda, infrahepatik vena kava üzerindeki damar kelepçesi muhtemelen doğru yerleştirilmemiştir.
Deneyimlerimize göre, başarılı bir operasyon, toplama kateteri yerleştirildikten sonra birkaç dakika içinde ~10 mmHg'lik stabil bir portal basıncı ve 3,5 mL/dk'lık bir çıkış akış hızı ile sonuçlanır. Basınç önemli ölçüde daha yüksekse veya sürekli artıyorsa veya toplanan çıkış akış hızı 3,5 mL/dak değilse veya sürekli düşüyorsa, birkaç olay dikkate alınmalıdır: 1) Tüm karaciğer lobları eşit derecede perfüze edilmiş ve tek tip soluk bir renk gösteriyor mu? Değilse, bir tıkanıklık meydana gelmiş olabilir (genellikle bir hava kabarcığı; karaciğer lobuna bir pamuklu çubukla dikkatlice "masaj yapın"; bu bazen hava kabarcığının serbest kalmasına yardımcı olur, böylece basınç hemen düşer) veya portal ven kateteri çok fazla yukarı itilmiştir, bu nedenle hepatik portal venin iki dalından sadece birini besler (dikkatli bir şekilde kateteri birkaç milimetre geri çekmeye çalışın). 2) Suprahepatik inferior vena kava bükülmüş mü? Bu, toplama tüpünün erkek kısmını damara yerleştirilen kateterin dişi kısmına bağlarken meydana gelebilir; Toplama borusunu dikkatlice çıkarın ve basıncın düşüp düşmediğini gözlemleyin. 3) Toplayıcı kateter suprahepatik inferior vena kavadan çok aşağı itilmiş, böylece kateterin ucu karaciğere sıkışmış mı? Gerekirse birkaç milimetreyi dikkatlice geri çekin.
Özetle, perfüze fare karaciğeri, belirli bir bileşiğin karaciğer üzerindeki dinamik etkilerini incelemek için kullanılabilen, fizyolojik olarak ilgili bir in vitro deneysel modeldir. Operasyonun kalitesi, elde edilen verilerin kalitesi için kritik öneme sahiptir ve deneyimlerimize göre, tatmin edici kalitede verilerin beklenebilmesi için ~2 aylık bir eğitim gerekir. Teknik öğrenildikten sonra, ilgilenilen genlerle ilgili transgenik veya nakavt donör hayvanların yanı sıra karaciğer hastalıklarının fare modelleri de dahil olmak üzere bu yöntemle ilgili olasılıklar çoktur. Bununla birlikte, deneyler, potansiyel toksik yan etkiler (in vivo olarak çok daha şiddetli olması muhtemeldir) veya test bileşiklerinin zayıf çözünürlüğü ile sınırlandırılabilir. Bu tür bileşikler, perfüzyondan önce uygun bir zaman diliminde donör hayvanlara oral olarak verilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bu makaleyle ilgili herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Çalışmalar ve Nicolai J. Wewer Albrechtsen, Novo Nordisk Vakfı Mükemmeliyet Gelişmekte Olan Araştırmacı Hibe - Endokrinoloji ve Metabolizma (Başvuru No. NNF19OC0055001), Avrupa Diyabet Araştırmaları Vakfı Geleceğin Lideri Ödülü (NNF21SA0072746) ve Danimarka Bağımsız Araştırma Fonu, Sapere Aude (1052-00003B). Novo Nordisk Vakfı Protein Araştırmaları Merkezi, Novo Nordisk Vakfı tarafından finansal olarak desteklenmektedir (Hibe sözleşmesi NNF14CC0001). Şekil 1B, biorender.com ile oluşturulmuştur. Dr. Rune E. Kuhre'ye (Novo Nordisk A/S) perfüze fare karaciğeri ile ilgili verimli görüşmeler için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-way stopcock | BD | 394601 | |
| Altromin breeding diet | Altromin Spezialfutter | 1319 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma | C8106 | |
| Catheters (0.7 mm) | BD | 381812 | |
| Filter paper (pore size 2.0 µm) | Millipore | AP2029325 | |
| Glucose kit | QuantiChromTM | DIGL-100 | Low concentration protocol |
| Ketamine | MSD Animal Health | 511485 | 90 mg/kg |
| Ligature (black sterile silk) | Agnthos | 14739 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | 230391 | |
| Non-esterified fatty acids kit | Fujifilm Wako Chemicals | NEFA-HR(2) | |
| Operating table, heated on tripod stand, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate(KH2PO4) | Merck | 1.04877 | |
| Roller Pump, with four channels | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Sleek tape | Mediq danmark | 4001910 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S1679 | |
| Thermostatic Circulator | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | Bath Volume 3 L, 230 V/50 Hz |
| Tubing | Tygon | E3603 | Inner diameter 1.59 mm, outer diameter 3.18 mm |
| Universal perfusion system | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | Basic unit uniper UP-100, type 834 |
| Vamin | Fresenius Kabi | B05ABA01 | Mixed amino acids |
| Vessel clamp adaptor | Deutsche Biomedical | DBC1002 | |
| Vessel clamps | Deutsche Biomedical | DBC1005 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| Xylazine | Rompun Vet | 530701 | 10 mg/kg |
References
- Bale, S. S., Geerts, S., Jindal, R., Yarmush, M. L. Isolation and co-culture of rat parenchymal and non-parenchymal liver cells to evaluate cellular interactions and response. Scientific Reports. 6, 25329 (2016).
- Lauschke, V. M., et al. Massive rearrangements of cellular MicroRNA signatures are key drivers of hepatocyte dedifferentiation. Hepatology. 64 (5), 1743-1756 (2016).
- Seirup, M., et al. Rapid changes in chromatin structure during dedifferentiation of primary hepatocytes in vitro. Genomics. 114 (3), 110330 (2022).
- Gupta, R., et al. Comparing in vitro human liver models to in vivo human liver using RNA-Seq. Archive of Toxicology. 95 (2), 573-589 (2021).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function, and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Dewyse, L., Reynaert, H., van Grunsven, L. A. Best practices and progress in precision-cut liver slice cultures. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 7137 (2021).
- Li, X., George, S. M., Vernetti, L., Gough, A. H., Taylor, D. L. A glass-based, continuously zonated and vascularized human liver acinus microphysiological system (vLAMPS) designed for experimental modeling of diseases and ADME/TOX. Lab on a Chip. 18 (17), 2614-2631 (2018).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).
- Bartošek, I., Guaitani, A., Miller, L. L. Isolated Liver Perfusion and its Applications. , Raven Press. New York. (1973).
- Gores, G. J., Kost, L. J., LaRusso, N. F. The isolated perfused rat liver: conceptual and practical considerations. Hepatology. 6 (3), 511-517 (1986).
- Mischinger, H. J., et al. An improved technique for isolated perfusion of rat livers and an evaluation of perfusates. Journal of Surgical Research. 53 (2), 158-165 (1992).
- Vairetti, M., et al. Correlation between the liver temperature employed during machine perfusion and reperfusion damage: role of Ca2. Liver Transplantation. 14 (4), 494-503 (2008).
- Ferrigno, A., Richelmi, P., Vairetti, M. Troubleshooting and improving the mouse and rat isolated perfused liver preparation. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 107-114 (2013).
- Zawada, R. J. X., Kwan, P., Olszewski, K. L., Llinas, M., Huang, S. -G. Quantitative determination of urea concentrations in cell culture medium. Biochemistry and Cell Biology. 87 (3), 541-544 (2009).
