Summary
Mevcut protokol, MCF-7 hücre proliferasyonunu ve göçünü inhibe etmede salidrosidin farmakolojik etkisini ve mekanizmasını değerlendirmek için kapsamlı bir stratejiyi tanımlamaktadır.
Abstract
Salidrosid (Sal), anti-kanserojen, anti-hipoksik ve anti-inflamatuar farmakolojik aktiviteler içerir. Bununla birlikte, altta yatan anti-meme kanseri mekanizmaları tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu nedenle, bu protokol, insan meme kanseri MCF-7 hücrelerinin malign proliferasyonunda PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 yolunu düzenlemede Sal'ın potansiyelini çözmeyi amaçladı. İlk olarak, Sal'ın MCF-7'ye karşı farmakolojik aktivitesi CCK-8 ve hücre çizik testleri ile değerlendirildi. Ayrıca, MCF-7 hücrelerinin direnci migrasyon ve Matrigel invazyon testleri ile ölçüldü. Hücre apoptozu ve siklus tahlilleri için, MCF-7 hücreleri, akış sitometrisi analizleri için sırasıyla annexin V-FITC/PI ve hücre döngüsü boyama tespit kitleri ile adım adım işlendi. Reaktif oksijen türleri (ROS) ve Ca2+ düzeyleri DCFH-DA ve Fluo-4 immünofloresan boyama ile incelendi. Na+-K+-ATPaz veCa2+-ATPaz aktiviteleri, ilgili ticari kitler kullanılarak belirlendi. Apoptozdaki protein ve gen ekspresyon seviyeleri ve PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 yolağı sırasıyla western blot ve qRT-PCR analizleri kullanılarak belirlendi. Sal tedavisinin, doza bağlı etkilerle MCF-7 hücrelerinin çoğalmasını, göçünü ve invazyonunu önemli ölçüde kısıtladığını bulduk. Bu arada, Sal uygulaması ayrıca MCF-7 hücrelerini apoptoz ve hücre döngüsü durmasına maruz kalmaya zorladı. İmmünofloresan testleri, Sal'ın MCF-7 hücrelerinde ROS ve Ca2+ üretimini gözle görülür şekilde uyardığını gösterdi. Diğer veriler, Sal'ın pro-apoptotik proteinlerin, Bax, Bim, bölünmüş kaspaz-9/7/3 ve bunlara karşılık gelen genlerin ekspresyon seviyelerini desteklediğini doğruladı. Tutarlı bir şekilde, Sal müdahalesi Bcl-2, p-PI3K / PI3K, p-AKT / AKT, mTOR, HIF-1α ve FoxO1 proteinlerinin ve bunlara karşılık gelen genlerin ekspresyonunu belirgin şekilde azalttı. Sonuç olarak, Sal, PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 yolunu inhibe ederek MCF-7 hücrelerinin malign proliferasyonunu, göçünü ve istilasını azaltabileceğinden, meme kanserini tedavi etmek için potansiyel bir bitki türevi bileşik olarak kullanılabilir.
Introduction
En sık teşhis edilen kanserlerden ve en yaygın malignitelerden biri olan son istatistikler, 2020 yılına kadar dünya çapında 2,3 milyon meme kanseri vakasının ortaya çıktığını ve tüm kanser vakalarının %11,7'sini oluşturduğunu göstermektedir1. Meme kanserinin yaygın semptomları arasında memede hassasiyet ve karıncalanma, memede yumrular ve ağrı, meme başı akıntısı, erozyon veya çökük cilt ve genişlemiş koltuk altı lenf düğümleribulunur 1,2. Daha da endişe verici olanı, yeni vakaların sayısı ve genel meme kanseri insidansı her yıl ezici bir oranda artmaya devam ediyor ve kansere bağlı ölümlerin %6,9'unu oluşturuyor1. Şu anda, meme kanseri müdahalesi hala esas olarak kemoterapi, cerrahi, radyoterapi ve kapsamlı tedaviyi içermektedir. Tedavi, hastaların nüks oranını ve mortalite oranını etkili bir şekilde azaltabilse de, uzun süreli tedavi uygulaması sıklıkla çoklu ilaç direncine, geniş alan saç dökülmesine, bulantı ve kusmaya ve ciddi zihinsel ve psikolojik yüke neden olur 2,3. Özellikle, meme kanserinden kaynaklanan çoklu organ metastazı riski, insanları yeni bitkisel ilaç tedavisi kaynakları aramaya zorlamaktadır 4,5.
Fosfoinositid 3 kinaz (PI3K) aracılı sinyalleme, çoklu genlerin ekspresyonunu etkileyen ekleme yoluyla meme kanserinin büyümesi, çoğalması ve hayatta kalmasındarol oynar 6. PI3K'nın aşağı akış sinyal algılayıcı bir proteini olarak, çok sayıda kanıt, protein kinaz B'nin (AKT) meme kanserini daha da artırmak için memeli rapamisin (mTOR) proteini hedefi ile birleşebileceğini düşündürmektedir 7,8,9. Ayrıca, PI3K/AKT/mTOR sinyalinin devre dışı bırakılmasının, meme kanserinde malign proliferasyonu inhibe eden ve apoptozu uyaran ilaçlarda da önemli bir bileşen olduğu iddia edilmiştir10,11,12. Tümör mikroçevresindeki aşırı hipoksin, hipoksi ile indüklenebilir faktör 1 alfa'da (HIF-1α) büyük bir artışa neden olduğu ve bu da meme kanserinin ilerlemesini daha da kötüleştirdiğiiyi bilinmektedir 13,14,15. Buna paralel olarak, AKT stimülasyonu da aşırı HIF-1α birikimine yol açarak meme kanseri örneklerinde apoptozu sınırlar16,17. İlginç bir şekilde, PI3K-AKT-HIF-1α sinyalinin aktivasyonunun, akciğer kanseri18, kolorektal kanser19, yumurtalık kanseri 20 ve prostat kanseri21 dahil olmak üzere çeşitli kanserlerde patolojik ilerleme ve metastazda rol oynadığı doğrulanmıştır. HIF-1α tarafından düzenlenmesine ek olarak, çatallı kafa transkripsiyon faktörü 1 (FoxO1) aşırı ekspresyonu, meme kanseri hücrelerinde döngü durmasını ve apoptozun inhibisyonunu destekleyen AKT sinyal stimülasyonu tarafından da tetiklenir22,23. Birlikte, yukarıdaki sağlam kanıtlar, PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 sinyalinin kaskadının inhibisyonunun meme kanserinde ilaç tedavisi için potansiyel yeni bir hedef olabileceğini düşündürmektedir.
Salidrosidin (Sal) anti-kanser24,25, anti-hipoksi 26,27,28,29 ve bağışıklık arttırıcı farmakolojik aktiviteler30 uyguladığı yaygın olarak gösterilmiştir. Suda kolayca çözünebilen, bir tür feniletilanoid glikozit olan ve kimyasal yapı formülüC14H20O7ve moleküler ağırlığı 300.331,32 olan açık kahverengi veya kahverengi bir tozdur. Modern farmakolojik araştırmalar, Sal'ın PI3K-AKT-mTOR sinyalini24 kısıtlayarak mide kanseri hücrelerinin apoptozunu destekleyebileceğini göstermiştir. Daha fazla kanıt ayrıca, PI3K-AKT-HIF-1α sinyalinin Sal tedavisi ile baskılanmasının, kemoterapötik ajanlara duyarlılıklarını artırarak kanser hücrelerinin apoptozuna katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir25. Kanıtlar ayrıca Sal'ın hücre göçünü ve istilasını kısıtladığını ve insan meme kanseri MCF-7 hücrelerinde apoptozu teşvik ederek döngü durmasına neden olduğunu göstermektedir33,34. Bununla birlikte, Sal'ın PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 sinyalini düzenleyip düzenleyemeyeceği ve MCF-7 hücrelerinin malign proliferasyonunu inhibe edip edemeyeceği henüz belli değil. Bu nedenle, bu protokol, Sal'ın PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 yolu yoluyla MCF-7 hücre göçü, invazyonu, hücre döngüsü ve apoptoz üzerindeki etkilerini araştırmayı amaçladı. Hücre göçü ve invazyon değerlendirmeleri, akış sitometrisi ile apoptoz ve hücre döngüsü tespiti, reaktif oksijen türleri (ROS) ve Ca2 + floresan tayini gibi geleneksel, düşük maliyetli ve bağımsız deneyleri içeren entegre araştırma stratejileri, geleneksel bitkisel ilaçlarla anti-kanser araştırmaları için deneylerin genel tasarımı için bir referans sağlayabilir. Bu çalışmanın deneysel süreci Şekil 1'de gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma için kullanılan MCF-7 hücreleri ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz.
1. Hücre kültürü
- MCF-7 hücrelerini, %10 FBS ve %1 penisilin (10.000 U/mL)/streptomisin (10.000 μg/mL) içeren DMEM ile 37 °C'de nemlendirilmiş% 5 CO 2 atmosferinde kültürleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).
NOT: Deneyin için çanağın tabanının %90'ını kaplayan hücreler kullanıldı ve aşağıdaki gruplara ayrıldı: kontrol grubu, doksorubisin hidroklorür grubu (DXR, 5 μM) ve Sal grupları (20 μM, 40 μM ve 80 μM) veya kontrol grubu, LY294002 (10 μM, bir PI3K inhibitörü) grubu, Sal (80 μM) grubu ve LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) grubu ( Malzeme Tablosuna bakınız).
2. Hücre canlılığı testi
NOT: Bu prosedürle ilgili ayrıntılar için lütfen önceki bir raporabakın 27.
- 96 oyuklu plakalarda 8 x 104 hücre/kuyu yoğunluğuna sahip MCF-7 hücrelerini tohumlayın ve hücreler yapışana kadar gece boyunca Sal (10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 μM ve 320 μM) ile inkübe edin veya Sal (20, 40, 80 μM) 12 saat / 24 saat / 36 saat / 48 saat boyunca.
- İşlemden sonra, MCF-7 hücrelerini 10 μL / kuyu CCK-8 çözeltisi ile 2 saat boyunca birlikte inkübe edin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Ardından, otomatik bir mikroplaka okuyucu ile optik yoğunluğu 450 nm'de (OD450) ölçün.
3. Hücre göçü ve istilası
NOT: Bu prosedürle ilgili ayrıntılar için lütfen önceki bir raporabakın 35.
- Yemeğin tabanının %90'ını kaplayacak şekilde 6 oyuklu plakalara ekilmiş 2 mL 5 x 106 hücre/mL hücreyi inkübe edin.
- Steril bir pipet ucu ile hücre tek tabakasının merkezi boyunca doğrusal bir çizik sarımı gerçekleştirin. 0 saat, 24 saat ve 48 saatte optik mikroskop kullanarak görüntüler elde edin.
- Çizik yaralarının genişliğini ölçmek için Image J yazılımını kullanın.
- Transwell testi için, MCF-7 hücrelerini serum ortamı olmadan askıya alın ve Matrigel ile veya Matrigel olmadan önceden kaplanmış üst transwell odasında tohumlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Transwell odasının dibinde, kimyasal bir indükleyici olarak DMEM tam ortamı kullanın. 24 saat sonra, üst odadaki hücreleri çıkarın ve kalan istilacı ve göçmen hücreleri metanol35'e sabitleyin.
- MCF-7 hücrelerini kristal viyole solüsyonu ile boyayın ( Malzeme Tablosuna bakın). Optik mikroskop kullanarak görüntüleri yakalayın.
4. Na + - K + -ATPaz ve Ca 2 + - Mg2 + -ATPaz'ın aktivite değerlendirmesi
- Üreticinin talimatlarını izleyerek parçalanmış MCF-7 hücrelerindeki protein konsantrasyonunu ölçmek için bir bikinkoninik asit (BCA) kiti kullanın (Malzeme Tablosuna bakın).
- Parçalanmış hücrelerin örneklerini karşılık gelen gruplarında 96 oyuklu plakalara ekleyin. Bundan sonra, 37 ° C'de 5 dakika inkübe etmek için çalışma solüsyonunu ekleyin. Son olarak, OD636 değerlerini çok işlevli bir mikroplaka okuyucu ile ölçün.
5. Apoptoz ve hücre döngüsünün akış sitometrisi analizi
NOT: Bu prosedürle ilgili ayrıntılar için lütfen önceki bir raporabakın 31.
- Hücreleri sindirin ve ekin V-FITC ve propidyum iyodür (PI) ile 20 dakikalık bir boyama için fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden süspanse etmek için hasat edin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve ardından bir akış sitometresi kullanarak apoptotik hücrelerin sayısını belirleyin.
- Yeniden süspanse edilmiş numune çözeltisini 30 dakikalık bir inkübasyon için PI çözeltisi ile karıştırın, ardından bir akış sitometresi ile tespit edin.
6. DCFH-DA ve Fluo-4 floresan boyama
NOT: Bu prosedürle ilgili ayrıntılar için lütfen önceki bir raporabakın 29.
- MCF-7 hücrelerini 37 °C'de 10 μM DCFH-DA floresan probu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile 20 dakika inkübe edin. PBS ile üç kez yıkayarak fazla DCFH-DA'yı iyice çıkardıktan sonra, bir floresan mikroskobu kullanarak sırasıyla 488 nm ve 525 nm uyarma ve emisyon dalga boylarında floresan yoğunluğunu test edin.
- MCF-7 hücrelerini 5 μM Fluo-4 floresan prob çözeltisi ile 37 °C'de 45 dakika inkübe edin. PBS ile üç kez yıkadıktan sonra, bir floresan mikroskobu kullanarak sırasıyla 488 nm ve 516 nm uyarma ve emisyon dalga boylarında floresan yoğunluk değerlerini belirleyin.
7. Batı lekesi
- 6 oyuklu plakalara farklı ilaçlar içeren 2 mL 5 x 106 hücre/mL hücre süspansiyonu ekleyin ve 24 saat boyunca 37 °C,% 5CO2 inkübatörde kültürleyin.
NOT: Western blot analizi için gruplar şu şekilde belirlenmiştir: kontrol grubu, LY294002 (10 μM) grubu, Sal (80 μM) grubu ve LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) grubu ( Malzeme Tablosuna bakınız). - Hücreleri ve süpernatanı toplayın ve 560 × g'da 4 ° C'de 3 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve önceden soğutulmuş PBS ile iki kez yıkayın. Her yıkamadan sonra hücreleri 560 × g'da 4 °C'de 3 dakika santrifüjleyin.
- 15 dakikalık bir buz banyosu için 7.2. adımdan hücre örneğine 50 μL lizis tamponu ekleyin. Süpernatan protein örneğini toplamak için 8550 × g'de 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
- Bir BCA yöntemi kullanarak protein konsantrasyonunu tespit ettikten sonra, protein örneğini adım 7.3'te 4:1 oranında yükleme tamponu ile karıştırın, metal bir banyoda 100 °C'de 10 dakika denatüre edin ve oda sıcaklığına soğutun.
- Adım 7.4'ten 20 μg protein numunesi ekleyin, %10 SDS-PAGE kullanarak farklı moleküler ağırlıklara35sahip proteinleri ayırın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve ardından 0.22 μm PVDF membranlarına aktarın. % 5 BSA ile blokajdan sonra, membranları karşılık gelen primer antikorlarla gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
NOT: Aşağıdaki primer antikorların seyreltik konsantrasyonu 1:1.000'dir: bölünmüş kaspaz-9/7/3 (CC-9/7/3), Bim, Bax, Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α, FoxO1 ve β-aktin (Malzeme Tablosuna bakınız). - Ertesi gün, membranları keçi anti-tavşan IgG sekonder antikoru ile 37 ° C'de 2 saat inkübe edin. Bir ECL kemilüminesan çözeltisi kullanarak membranları geliştirin ve temassız bir kantitatif western blot görüntüleme sistemi kullanarak görüntüleri yakalayın (Malzeme Tablosuna bakın).
8. qRT-PCR
- MCF-7 hücrelerini 3 dakika boyunca 4 ° C'de 560 x g'de toplamak için santrifüjleme yapın ve 5 × 106 hücreye 500 μL tampon RL1 ekleyin. Üfleyin ve hiçbir hücre kütlesi görünmeyene kadar bir pipetle tekrar tekrar karıştırın.
NOT: Tampon RL1, toplam RNA izolasyon kitindeki bileşenlerden biridir (Malzeme Tablosuna bakın). - Adım 8.1'deki hücre homojenatlarını toplama tüpüne gömülü DNA temizleme kolonuna aktarın ve 2 dakika boyunca 4 ° C'de 8.550 × g'da santrifüjleyin. DNA temizleme kolonunu çıkarın ve süpernatanı toplama tüpünde tutun.
NOT: DNA temizleme sütunu ve toplama tüpü, toplam RNA izolasyon kitindeki bileşenlerden ikisidir (Malzeme Tablosuna bakın). - Adım 8.2'den itibaren 500 μL süpernatan için 800 μL tampon RL2 ekleyin ve hafifçe karıştırın.
NOT: Tampon RL2, toplam RNA izolasyon kitindeki bileşenlerden biridir ( Malzeme Tablosuna bakın). Kullanmadan önce 60 mL tampon RL2'ye 120 mL susuz etanol ekleyin. - Adım 8.3'teki karışımın 700 μL'sini toplama tüpüne gömülü yalnızca RNA kolonuna aktarın ve 1 dakika boyunca 4 ° C'de 8.550 × g'da santrifüjleyin. Atık sıvıyı toplama tüpüne atın.
NOT: Yalnızca RNA sütunu, toplam RNA izolasyon kitindeki bileşenlerden biridir (Malzeme Tablosuna bakın). - Adım 8.3'ten kalan karışımı işlemek için adım 8.4'ü tekrarlayın.
- Yalnızca RNA kolonuna 500 μL tampon RW1 ekleyin ve 1 dakika boyunca 4 ° C'de 8.550 × g'da santrifüjleyin. Atık sıvıyı toplama tüpüne atın.
NOT: Tampon RW1, toplam RNA izolasyon kitindeki bileşenlerden biridir ( Malzeme Tablosuna bakın). - Yalnızca RNA kolonuna 700 μL tampon RW2 ekleyin ve 1 dakika boyunca 4 ◦C'de 8.550 × g'de santrifüjleyin. Atık sıvıyı toplama tüpüne atın. Adım 8.7'yi bir kez tekrarlayın.
NOT: Tampon RW2, toplam RNA izolasyon kitindeki bileşenlerden biridir ( Malzeme Tablosuna bakın). - Yalnızca RNA kolonunu toplama tüpüne geri yerleştirin ve kalan tampon RW2'yi çıkarmak için 8550 × g'de 4 °C'de 2 dakika santrifüjleyin.
- Yalnızca RNA kolonunu yeni bir toplama tüpüne aktarın ve 65 ° C'de önceden ısıtılmış 100 μL RNaz içermeyen ddH2O'yu yalnızca RNA sütunu için zarın merkezine damlatın. 25 °C'de 2 dakika bekletin ve RNA çözeltisini 1 dakika boyunca 4 °C'de 8.550 × g'da santrifüjleyerek toplayın.
NOT: RNaz içermeyen ddH2O, toplam RNA izolasyon kitindeki bileşenlerden biridir ( Malzeme Tablosuna bakın). - 4 μL 5x reaksiyon tamponu, 1 μL oligo (dT)18 primeri, 1 μL rastgele heksamer primeri, 1 μL gene özgü primer (bakınız Tablo 1), 1 μL enzim karışımı ve 5 μg ekleyin RNA çözeltisi adım 8.9'dan 100 μL 8 tüplü bir şeride yerleştirin. Reaksiyon sistemini 20 μL'ye kadar RNaz içermeyen su ile destekleyin.
- Sistemin reaksiyon koşullarını aşağıdaki gibi ayarlayın: (1): 95 °C, 30 s, 1 döngü; (2): 95 °C, 5 sn, 50 döngü, 60 °C, 34 sn; (3): 95 °C, 5 sn, 1 döngü, 65 °C, 60 sn, 97 °C, 1 sn; ve (4): 42 °C, 30 sn, 1 döngü. qRT-PCR prosedürünü yürütün.
NOT: Hedef genlerin nispi ekspresyon seviyeleri 2−ΔΔCT yöntemi36,37 ile kantitatif olarak analiz edildi. qRT-PCR analizi için kullanılan her bir genin primer bilgisi Tablo 1'de listelenmiştir.
9. İstatistiksel analiz
- Verileri, üç bağımsız deneyin ortalama ± standart sapması olarak ifade edin.
- Grafik ve analiz yazılımı kullanarak birden fazla grup arasındaki karşılaştırmaları analiz edin (Malzeme Tablosuna bakınız) tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından bir Tukey testi ile. Bu çalışmada P < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak tanımlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sal'ın MCF-7 hücrelerinde aşırı proliferasyonu inhibe etme ve yara iyileşmesini geciktirme üzerindeki etkileri
Sal'ın meme kanserine karşı potansiyelini araştırmak için, ilk önce insan meme kanseri MCF-7 hücre hattının hücre proliferasyon toksisitesi ve çizik testlerini kullanarak antikanser özelliklerini test ettik. Bu hücreler, 24 saat boyunca bir Sal konsantrasyon serisi (5-320 μM) ile birlikte inkübe edildi ve hücre proliferasyonu bir CCK-8 testi kullanılarak değerlendirildi. 40 μM'de hücre canlılığında %50'lik bir azalma ile Sal'ın hücre proliferasyonu üzerinde doza bağlı bir inhibitör etkisi gözlenmiştir (Şekil 2A). Daha sonra 20 μM, 40 μM ve 80 μM'lik sal konsantrasyonları sonraki zaman noktaları ve yara iyileşmesi değerlendirmesi için seçildi. Şekil 2B'deki sonuçlar, Sal'ın 24 saatlik birlikte inkübasyondan sonra MCF-7 hücre canlılığında %50'lik bir azalma ile zamanla MCF-7 hücrelerinin canlılığını inhibe edebileceğini göstermektedir. Şekil 2C-R, yara çizik testi ile belirlendiği gibi, Sal tedavisinin MCF-7 hücrelerinin yara iyileşmesi üzerindeki inhibitör etkisini göstermektedir. Diğer hücre çizik testleri, Sal ile 24 saatlik kültürün (20 μM, 40 μM ve 80 μM) yara iyileşme sürecini keskin bir şekilde engellediğini doğruladı (Şekil 2C, D).
Malign migrasyonun baskılanması ve MCF-7 hücrelerinin Sal tarafından invazyonu
Çok sayıda tümör hücresinin göçü ve parakanser dokularını istila etme eğilimi, malign tümörlerin tipik özellikleri olarak kabul edilmektedir. Sal'ın MCF-7 hücrelerinin göçü ve istilası üzerindeki etkileri, hücre dışı matriks jeli ile kaplanmış veya kaplanmış bir transwell sistemi kullanılarak daha fazla test edildi. Sal tedavisi, MCF-7 hücrelerinin istenmeyen migrasyonunu (Şekil 3A-F) ve invazyonunu (Şekil 3G-L) önemli ölçüde azalttı. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, Sal ile tedavi, MCF-7 hücrelerinin göçünü şaşırtıcı bir şekilde nötralize etti. Neredeyse oybirliğiyle, MCF-7 hücrelerinin kötü niyetli istila süreci, Sal ile inkübasyondan sonra etkili bir şekilde kapatıldı (Şekil 3B). Yukarıdaki veriler, Sal'ın meme kanserini inhibe etmedeki avantajlarını tam olarak doğruladı.
Sal'ın MCF-7 hücrelerinde apoptozu teşvik etmede ve döngü durmasını artırmadaki etkileri
Kanser hücrelerinin ölümsüzleşmesi ve periyodik olarak çoğalması, kanserin kötüleşmesi ve yayılması için fırsatlar sağlar. Doğal olarak, apoptozun teşviki ve siklus baskılanması da kanseri önlemek için kabul edilen stratejiler haline gelmiştir. Akım sitometri sonuçları, Sal tedavisinin erken ve geç apoptotik evrelerde MCF-7 hücre sayısını artırdığını düşündürmektedir (Şekil 4A). Bu arada, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, Sal tedavisi, S fazı hücrelerinin oranını azaltırken, G0 / G1 fazındaki hücre sayısını da keskin bir şekilde arttırdı (Şekil 4B). Apoptoz ve siklus durmasının teşviki, Sal'ın meme kanserine karşı olası farmakolojik etkisi olarak hizmet edebilir.
Sal'ın MCF-7 hücrelerinde hücre içi ROS ve Ca2+ aşırı üretimini uyarma üzerindeki etkisi
Hücre içi ROS veCa2+ üretiminin sürekli uyarılması, tümör hücrelerinin büyümesini etkili bir şekilde inhibe edebilir. Şekil 5A-E, DCFH-DA immünofloresan boyama ile değerlendirilen ROS içeriğini göstermektedir. ROS için kantitatif sonuçlar Şekil 5F'de gösterilmektedir. Ca2+ konsantrasyonunu saptamak için fluo-4 immünofloresan boyaması kullanıldı (Şekil 5G-K). Şekil 5L, Ca2+ için nicel sonuçları göstermektedir. DCFH-DA sonuçları, Sal'ın kontrol grubuna kıyasla ROS floresan sinyallerini önemli ölçüde arttırdığını gösterdi (Şekil 5A). Tutarlı bir şekilde, Sal müdahalesi, vurgulanan Fluo-4 floresan sinyali ile kanıtlanan Ca2 + üretimini de belirgin şekilde artırdı (Şekil 5B). Bu sonuçlar toplu olarak ROS ve Ca2 + sinyallerinin Sal'ın meme kanseri karşıtı aktivitesinde kısmen rol oynayabileceğini göstermiştir.
MCF-7 hücrelerinin mitokondriyal yolunda apoptozu indüklemede Sal'ın etkisi
Mitokondriyal disfonksiyonun neden olduğu apoptozun birçok tümör hücresinin nihai kaderini belirlediğine dair çok sayıda kanıt vardır. Sal'ın MCF-7 hücrelerinde mitokondriyal fonksiyon regülasyonuna ve apoptozu teşvik edici etkilere aracılık edip etmediğinin belirlenmesinde, ilk olarak Sal'ın Na+-K+-ATPaz (Şekil 6A) veCa2+-ATPaz'ın (Şekil 6B) enzim canlılıklarını kısıtladığı gösterildi, böylece mitokondriyal disfonksiyonu teşvik etmedeki potansiyel rolünü gösterdi. Daha sonra, western blot ve qRT-PCR verileri, Sal tedavisinin pro-apoptotik faktörler CC-9 (Şekil 6C,D,G), CC-7 (Şekil 6C,E,H), CC-3 (Şekil 6C,F,I), Bim (Şekil 6C,J,M) ve Bax'ın (Şekil 6C,L,O) protein ve gen ekspresyonunu desteklediğini, anti-apoptotik Bcl-2'nin protein ve gen ekspresyonunu inhibe ettiğini gösterdi (Şekil 6C,K,N). Bu veriler kısmen, apoptoz ile birlikte MCF-7 hücrelerindeki mitokondriyal disfonksiyonun, Sal'ın meme kanserine karşı etki mekanizmasında rol oynayabileceğini göstermektedir.
Sal'ın MCF-7 hücrelerinde PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 yolunun baskılanması üzerindeki etkisi
PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 yolu, tümör büyümesini düzenleyen çok önemli bir sinyal iletim yolu olarak, meme kanserinin patolojik ilerlemesinde ve kötüleşmesinde rol oynar. Western blot sonuçları, Sal tedavisinin p-PI3K/PI3K (Şekil 7A,B) ve p-AKT/AKT (Şekil 7A,C) oranlarını belirgin olarak sınırladığını göstermiştir. Bu arada, mTOR (Şekil 7A, D), HIF-1α (Şekil 7A, E) ve FoxO1'in (Şekil 7A, F) protein ekspresyonu da Sal tedavisi ile belirgin şekilde baskılanmıştır. Daha fazla qRT-PCR analizi, Sal uygulamasının PI3K (Şekil 7G), AKT (Şekil 7H), mTOR (Şekil 7I), HIF-1α (Şekil 7J) ve FoxO1 (Şekil 7K) gen ekspresyon seviyelerini azalttığını göstermiştir. Sonuç olarak, PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 yolağının aktivasyonunun inhibisyonu, Sal'ın meme kanserine karşı potansiyel bir moleküler mekanizması olabilir.
Şekil 1: Sal'ın meme kanseri MCF-7 hücre hattına karşı etkisinin şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: MCF-7 hücre proliferasyonu toksisitesi ve Sal. (A) ve (B), Sal tedavisinin MCF-7 hücre aktivitesi üzerindeki doz-zaman etkilerini göstermektedir. (C-R) Yara çizik testi ile belirlendiği üzere, Sal tedavisinin MCF-7 hücrelerinde yara iyileşmesi üzerindeki inhibitör etkisi. Yukarıdaki veriler ortalama ± SD, n = 3 olarak gösterilmiştir. ##p < 0.01 ile kontrol grubuna karşı. Ölçek çubukları: 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Sal tedavisi ile MCF-7 hücrelerinin malign göçünün ve istilasının baskılanması. Sal tedavisi, MCF-7 hücrelerinin istenmeyen (AF) migrasyonunu ve (G-L) invazyonunu önemli ölçüde azaltır. Yukarıdaki veriler ortalama ± SD, n = 3 olarak gösterilmiştir. <#p < 0.05 ve ##p < 0.01 kontrol grubuna karşı. Ölçek çubukları: 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Sal tarafından apoptozun teşviki ve hücre döngüsünün baskılanması. Akış sitometrisi ile tespit edildiği gibi, Sal'ın MCF-7 hücreleri üzerindeki (A) apoptotik teşvik ve (B) hücre döngüsü durdurma etkileri. Yukarıdaki veriler ortalama ± SD, n = 3 olarak gösterilmiştir. #p < 0.05 ve ##p < 0.01 kontrol grubuna karşı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Sal tedavisinin neden olduğu MCF-7 hücrelerinde ROS ve Ca2+ dalgalanması. (A-E) ROS içeriği DCFH-DA immünofloresan boyama ile değerlendirildi. (F) ROS için nicel sonuçlar. (G-K) Fluo-4 immünofloresan boyamasıCa2+ konsantrasyonunu saptamak için kullanıldı. (L) Ca2+ için nicel sonuçlar. Yukarıdaki veriler ortalama ± SD, n = 3 olarak gösterilmiştir. #p < 0.05 ve ##p < 0.01 kontrol grubuna karşı. Ölçek çubukları: 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: MCF-7 hücrelerinde apoptoz ile birlikte mitokondriyal disfonksiyonun indüklenmesinde Sal tedavisinin etkisi. (A) Na+-K+-ATPaz ve (B)Ca2+-ATPaz'ın azaltılmış enzim aktiviteleri. (C) (D) CC-9, (E) CC-7, (F) CC-3, (J) Bim, (K) Bcl-2 ve (L) Bax proteinleri ve (G) kaspaz-9, (H) kaspaz-7, (I) kaspaz-3, (M) Bim, (N) Bcl-2 ve (O) Bax genleri için temsili protein ekspresyon bantları ve bunlara karşılık gelen istatistiksel sonuçlar. Yukarıdaki veriler ortalama ± SD, n = 3 olarak gösterilmiştir. #p < 0.05 ve ##p < 0.01 kontrol grubuna karşı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Sal tedavisi ile PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 yolunun baskılanması . (A) Western blot analizi ile tespit edilen temsili protein bantları. Sal, (B) p-PI3K/PI3K, (C) p-AKT/AKT, (D) mTOR, (E) HIF-1α ve (F) FoxO1'in protein ekspresyonunu azalttı. (G) PI3K, (H) AKT, (I) mTOR, (J) HIF-1α ve (K) FoxO1'in gen ekspresyon seviyeleri azaltıldı. Yukarıdaki veriler ortalama ± SD, n = 3 olarak gösterilmiştir. # #p < 0.01 ile kontrol grubu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: MCF-7 hücrelerinde ROS ve Ca2+ üretiminin Sal tarafından uyarılması, PI3K sinyal iletiminin inhibisyonu eşliğinde. mTOR'un katılımı ile AKT'nin fosforilasyonu Sal uygulamasından sonra daha da azaldı. Sonuç olarak, HIF-1α ve FoxO1'in aşağı regüle ekspresyonu, MCF-7 hücrelerinin periyodik malign proliferasyonunu bloke etti. Bu arada, MCF-7 hücrelerinin gelişmiş apoptozu, Sal'ın anti-meme kanseri potansiyelini önerdi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Gen | GenBank katılım no. | Astar dizisi (5'-3') | Uzunluk (bp) | |
| Kaspaz-9 | NM_001229 | F, GACCAGAGATTCGCAAACCAGAGG | 92 | |
| R, AAGAGCACCGACATCACCAAATCC | ||||
| Kaspaz-7 | F, AGTGACAGGTATGGGCGTTC | 164 | ||
| R, CGGCATTTGTATGGTCCTCTT | ||||
| Kaspaz-3 | NM_001354777 | F, CCAAAGATCATACATGGAAGCG | 185 | |
| R, CTGAATGTTTCCCTGAGGTTTG | ||||
| Bım | NM_001204106 | F, AAGGTAATCCTGAAGGCAATCA | 130 | |
| R, CTCATAAAGATGAAAAGCGGGG | ||||
| Bcl-2 Serisi | NM_000633 | F, GACTTCGCCGAGATGTCCAG | 129 | |
| R, GAACTCAAAGAAGGCCACAATC | ||||
| Bax | NM_001291428 | F, CGAACTGGACAGTAACATGGAG | 157 | |
| R, CAGTTTGCTGGCAAAGTAGAAA | ||||
| β-aktin | NM_031144 | F, AATCTGGCACCACACCTTCTACAA | 172 | |
| R, GGATAGCACAGCCTGGATAGCAA | ||||
| F, ileri; R, ters. | ||||
Tablo 1: Ters transkripsiyon-kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu için kullanılan primerler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Meme kanseri her yaştan bireyi etkilemekte ve hesaplanamayan fiziksel ve zihinsel yüke ve büyük ekonomik baskıya neden olmaktadır1. Meme kanseri, her geçen yıl artan morbidite ve mortalitesi ile konvansiyonel tedavilerin ötesinde etkili bitkisel bazlı bileşik tedaviler arayışı açısından da dünya çapında ilgi görmektedir 4,5. Umut verici bir şekilde, çok sayıda kanıt Sal 24,25,38'in anti-kanser etkilerini ortaya koymuştur. Ne yazık ki, Sal'ın meme kanserindeki rolü ve altta yatan moleküler mekanizmalar hala büyük ölçüde bilinmemektedir. Bu çalışma, Sal'ın insan meme kanseri MCF-7 hücre hattının proliferasyonu, göçü ve istilası üzerindeki önemli inhibitör etkilerini vurgulamaktadır. Daha sonra, Sal'ın tahriş edici apoptoz ve MCF-7 hücrelerinin döngü durması potansiyelini ortaya çıkardık. Bu arada, bu veriler Sal uygulamasının ROS ve Ca2+ düzeylerini artırdığını da göstermiştir. Moleküler mekanizmaların daha fazla araştırılması, Sal'ın meme kanseri tedavisinde apoptozu teşvik edici etkisini ve Sal'ın PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1 yolu üzerindeki etkisini gösterdi.
Kötü huylu ve kontrolsüz proliferasyon, meme kanseri gelişimini hızlandırabilir ve lenfatik39 ve beyin metastazı40 riskini artırabilir. Şu anda, piyasada bulunan kemoterapötik ilaçlar yavaş yavaş ortaya çıkmıştır, ancak bunlar meme kanserini tedavi etmek için düşük duyarlılık sorununa sahiptir, bu nedenle insanları daha güçlü bileşikler veya yeni ilaç kombinasyonları aramaya zorlamaktadır 2,3. Bu çalışmadaki veriler ilk olarak Sal tedavisinin MCF-7 hücrelerinin malign proliferasyonunu sınırladığını göstermiştir. Sonraki hücre çizik deneyleri, 12 saat ve 24 saatlik Sal inkübasyonunun MCF-7 hücrelerinin yakınsama oranını azalttığını doğruladı. Tümör hücresi migrasyonu ve invazyon yeteneği testleri, anti-tümör ilaçların taranması için hassas göstergeler olarak kabul edilmektedir24,25. Bu çalışmadaki veriler, Sal'ın önceki bulgulara uygun olarak MCF-7 hücre göçü ve istilası sürecini güçlü bir şekilde azalttığını göstermiştir33,34. Tümör hücrelerinin kontrolsüz hücre döngüsü, hücre ölümsüzlüğünün kaderini belirler24. Bu nedenle, apoptoz teşviki ve hücre döngüsü kesintisi, bileşiklerin antikanser potansiyelini değerlendirmek için tanınmış ve kabul edilmiş indeksler haline gelmiştir25. Bu çalışmada, akış sitometrisi analizi, erken ve geç apoptotik hücrelerin oranının artmasıyla kanıtlandığı gibi, Sal tedavisinin MCF-7 hücrelerinde apoptozu arttırdığını göstermiştir. Ayrıca, G0/G1 hücrelerinin oranı arttırıldı ve MCF-7 hücre döngüsünün S fazı bozuldu, bu da Sal'ın meme kanseri hücreleri üzerindeki hücre döngüsünü bloke edici etkilerini gösterdi.
Hafif hipoksik meme kanseri hücresi mikroçevresi, ROS veCa2+ üretimindeki sınırlamalarla ilişkilidir; bu nedenle, aşırı ROS ve Ca2+ birikimi meme kanseri hücrelerinde apoptotik olayları indükleyebilir41. Bu çalışmadaki immünofloresan sonuçları, Sal müdahalesinin ROS veCa2+ üretimini büyük ölçüde uyardığını ve bu da MCF-7 hücrelerinin apoptozunu daha da indükleyebileceğini kanıtladı. Ortaya çıkan kanıtlar, pro-apoptotik proteinler Bax ve Bim'in yüksek seviyelerinin yanı sıra anti-apoptotik protein Bcl-2'nin düşük seviyelerinin, mitokondriyal membranın içine ve dışına materyal geçişini geçici ve zorla açabildiğini ve böylece tümör hücrelerinin programlanmış apoptozunu tetikleyebileceğini ortaya koymuştur42. Bu çalışmada, Sal'ın MCF-7 hücreleri ile birlikte inkübasyonu, Bcl-2'nin protein ve gen ekspresyonunu azaltırken Bax ve Bim'i önemli ölçüde artırdı, böylece meme kanseri hücrelerinde apoptozu teşvik etmedeki potansiyel farmakolojik etkilerini düşündürdü. Bu veriler ayrıca Sal'ın, mitokondriyal apoptoz yolunun temel aşağı akış göstergeleri olan CC-9, CC-7 ve CC-3 proteinlerinin ve bunlara karşılık gelen genlerin ekspresyonunu belirgin bir şekilde indüklediğini öne sürdü. Yukarıdaki veriler kısmen, Sal'ın meme kanseri üzerindeki proapoptotik etkisinin mitokondriyal apoptozun aktivasyonu ile ilişkili olabileceğini düşündürmektedir.
Moleküler mekanizma çalışmaları, PI3K'nın fosforilasyonunun AKT fosforilasyonunu daha da indükleyebileceğini ve meme kanseri hücrelerininbüyümesini hızlandırabileceğini doğrulamıştır 6,7. Bu arada, büyük mTOR birikimi de AKT fosforilasyon sürecine katılarak meme kanserinin bozulmasına katkıda bulunur 8,9. Bir yandan, fosforile AKT, meme kanseri hücre döngüsünü teşvik etmek ve apoptozu yavaşlatmak için FoxO1 ekspresyonunu doğrudan uyarır22,23. Paralel olarak, aktive AKT dolaylı olarak FoxO1 vermek için HIF-1α ekspresyonunu aktive eder, bu da meme kanseri ilerlemesi ve metastazile sonuçlanır 16,17. Sonuç olarak, PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1 yolağının aktivasyonunun inhibisyonu meme kanseri tedavisi için yeni bir strateji olabilir. PI3K inhibitörü LY294002'nin müdahalesiyle veriler, Sal'ın PI3K'nın fosforilasyonunu gözlemlenebilir şekilde baskıladığını gösterdi. mTOR protein ekspresyonunun aşağı regülasyonu ile bağlantılı olarak Sal, fosforile AKT'nin ekspresyon seviyelerini de düşürdü. Sonuç olarak, HIF-1α ve FoxO1 protein ekspresyonu da Sal tedavisinden sonra büyük ölçüde azaldı. Benzer şekilde, qRT-PCR sonuçları, Sal tedavisinin PI3K, AKT, HIF-1α ve FoxO1 gen seviyelerini büyük ölçüde azalttığını ve MCF-7 hücrelerinin döngü durması ve apoptozunun desteklenmesine katkıda bulunduğunu uyumlu bir şekilde ortaya koymuştur (Şekil 8). Toplu olarak, elde edilen veriler, Sal'ın meme kanserine karşı etkili olan doğal bitkisel kökenli potansiyel bir aktif bileşik olabileceğini düşündürmektedir. Sal tedavisi ile MCF-7 hücre apoptozu ve hücre döngüsü inhibisyonunun teşvik edilmesi, meme kanseri hücrelerinin göç ve invazyon yeteneğini büyük ölçüde zayıflattı. Özellikle, Sal'ın meme kanserine karşı moleküler etki mekanizması, PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1 yolunun inhibisyonu ile ilişkili olabilir. Genel olarak, birden fazla deneysel yöntemi birleştiren bu protokol, meme kanseri önleyici ilaçların araştırılması ve geliştirilmesi için belirli bir referans değeri sağlar.
Bu çalışmada, Sal'ın meme kanserine karşı moleküler mekanizmasına dair doğrudan bir kanıt yoktur. PI3K nakavt fareleri, PI3K proteininin yüksek veya düşük ekspresyonuna sahip meme kanseri hücre hatları ve lokal yüzey plazmon rezonans teknikleri, meme kanserinin önlenmesi ve tedavisi için Sal'ın doğrudan moleküler hedeflerini doğrulamak için kullanılabilecek sonraki adımlardır29,31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Sichuan Eyaleti Sağlık Komisyonu (120025) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% penicillin/streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT0185 | |
| Annexin V-FITC/PI kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | AP101 | |
| Automatic microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| Bax antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #5023 | |
| BCA kit | Biosharp Life Sciences | BL521A | |
| Bcl-2 antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #15071 | |
| Bim antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #2933 | |
| Ca2+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-4-2 | |
| Cell counting kit-8 | Biosharp Life Sciences | BS350B | |
| Cell cycle staining kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | CCS012 | |
| cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technology, Inc. | #9661 | |
| cleaved caspase-7 | Cell Signaling Technology, Inc. | #8438 | |
| cleaved caspase-9 | Cell Signaling Technology, Inc. | #20750 | |
| Crystal violet solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| DMEM high glucose culture medium | Servicebio Technology Co., Ltd. | G4510 | |
| Doxorubicin hydrochloride | MedChemExpress | HY-15142 | |
| ECL chemiluminescent solution | Biosharp Life Sciences | BL520B | |
| Fetal bovine serum | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | 164210 | |
| Flow cytometer | BD | FACSCanto  |
|
| Fluo-4 AM | Beyotime Biotechnology | S1060 | |
| FoxO1 antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT1758 | |
| Goat anti-rabbit IgG secondary antibody | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | 70-GAR0072 | |
| GraphPad Prism software | La Jolla | Version 6.0 | |
| HIF-1α antibody | Affinity Biosciences | BF8002 | |
| Human breast cancer cell line MCF-7 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | CL-0149 | |
| Loading buffer | Biosharp Life Sciences | BL502B | |
| LY294002 | MedChemExpress | HY-10108 | |
| Matrigel | Thermo | 356234 | |
| mTOR antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11405 | |
| Na+–K+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-2-2 | |
| Optical microscope | Olympus | IX71PH | |
| p-AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YP0006 | |
| PI3K antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11525 | |
| p-PI3K antibody | Affinity Biosciences | AF3241 | |
| Quantitative western blot imaging system | Touch Image Pro | eBlot | |
| Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G3330-100 | |
| ROS assay kit | Beyotime Biotechnology | S0033S | DCFH-DA fluorescence probe is included here |
| Salidroside | Chengdu Herbpurify Co., Ltd. | H-040 | |
| SDS-PAGE kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G2003-50T | |
| Total RNA isolation kit | Foregene | RE-03014 | |
| Trypsin | HyClone | SH30042.01 | |
| β-actin | Affinity Biosciences | AF7018 |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 71 (3), 209-249 (2021).
- Franzoi, M. A., et al. Evidence-based approaches for the management of side-effects of adjuvant endocrine therapy in patients with breast cancer. Lancet Oncology. 22 (7), e303-313 (2021).
- Prionas, N. D., Stephens, S. J., Blitzblau, R. C. Early-stage breast cancer: Tailored external beam fractionation approaches for treatment of the whole or partial breast. Seminars in Radiation Oncology. 32 (3), 245-253 (2022).
- Wei, W. C., et al. Diterpenoid vinigrol specifically activates ATF4/DDIT3-mediated PERK arm of unfolded protein response to drive non-apoptotic death of breast cancer cells. Pharmacological Research. 182, 106285 (2022).
- Zhu, Y., et al. Apoptosis induction, a sharp edge of berberine to exert anti-cancer effects, focus on breast, lung, and liver cancer. Frontiers in Pharmacology. 13, 803717 (2022).
- Ladewig, E., et al. The oncogenic PI3K-induced transcriptomic landscape reveals key functions in splicing and gene expression regulation. Cancer Research. 82 (12), 2269-2280 (2022).
- Lu, Z. N., Song, J., Sun, T. H., Sun, G. UBE2C affects breast cancer proliferation through the AKT/mTOR signaling pathway. Chinese Medical Journal. 134 (20), 2465-2474 (2021).
- Weng, H. C., et al. The combination of a novel GLUT1 inhibitor and cisplatin synergistically inhibits breast cancer cell growth by enhancing the DNA damaging effect and modulating the Akt/mTOR and MAPK signaling pathways. Frontiers in Pharmacology. 13, 879748 (2022).
- Silveira Rabelo, A. C., et al. Calotropis procera induced caspase dependent apoptosis and impaired Akt/mTOR signaling in 4T1 breast cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 22 (18), 3136-3147 (2022).
- Tohkayomatee, R., Reabroi, S., Tungmunnithum, D., Parichatikanond, W., Pinthong, D. Andrographolide exhibits anticancer activity against breast cancer cells (MCF-7 and MDA-MB-231 cells) through suppressing cell proliferation and inducing cell apoptosis via inactivation of ER-α receptor and PI3K/AKT/mTOR signaling. Molecules. 27 (11), 3544 (2022).
- Jin, X. Y., et al. TPI1 activates the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway to induce breast cancer progression by stabilizing CDCA5. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 191 (2022).
- Li, Z. W., et al. Atractylodin induces oxidative stress-mediated apoptosis and autophagy in human breast cancer MCF-7 cells through inhibition of the P13K/Akt/mTOR pathway. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 36 (8), 23081 (2022).
- Chen, F., et al. Extracellular vesicle-packaged HIF-1α-stabilizing lncRNA from tumour-associated macrophages regulates aerobic glycolysis of breast cancer cells. Nature Cell Biology. 21 (4), 498-510 (2019).
- You, D., et al. Mitochondrial malic enzyme 2 promotes breast cancer metastasis via stabilizing HIF-1α under hypoxia. Chinese Journal of Cancer Research. 33 (3), 308-322 (2021).
- La Camera, G., et al. Adipocyte-derived extracellular vesicles promote breast cancer cell malignancy through HIF-1α activity. Cancer Letters. 521, 155-168 (2021).
- Jeong, Y. J., et al. Ascofuranone suppresses EGF-induced HIF-1α protein synthesis by inhibition of the Akt/mTOR/p70S6K pathway in MDA-MB-231 breast cancer cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 542-550 (2013).
- Zhang, T., et al. Targeting the ROS/PI3K/AKT/HIF-1α/HK2 axis of breast cancer cells: Combined administration of polydatin and 2-deoxy-d-glucose. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3711-3723 (2019).
- Han, N. N., et al. HIF-1α induced NID1 expression promotes pulmonary metastases via the PI3K-AKT pathway in salivary gland adenoid cystic carcinoma. Oral Oncology. 131, 105940 (2022).
- Sun, L. T., Zhang, L. Y., Shan, F. Y., Shen, M. H., Ruan, S. M. Jiedu Sangen decoction inhibits chemoresistance to 5-fluorouracil of colorectal cancer cells by suppressing glycolysis via PI3K/AKT/HIF-1α signaling pathway. Chinese Journal of Natural Medicines. 19 (2), 143-152 (2021).
- Gao, T., et al. SIK2 promotes reprogramming of glucose metabolism through PI3K/AKT/HIF-1α pathway and Drp1-mediated mitochondrial fission in ovarian cancer. Cancer Letters. 469, 89-101 (2020).
- Zhu, W. H., et al. Dihydroartemisinin suppresses glycolysis of LNCaP cells by inhibiting PI3K/AKT pathway and downregulating HIF-1α expression. Life Sciences. 233, 116730 (2019).
- Sajadimajd, S., Yazdanparast, R. Differential behaviors of trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells treated with menadione reveal the involvement of Notch1/Akt/FOXO1 signaling elements. Molecular and Cellular Biochemistry. 408 (1-2), 89-102 (2015).
- Sajadimajd, S., Yazdanparast, R., Akram, S. Involvement of Numb-mediated HIF-1α inhibition in anti-proliferative effect of PNA-antimiR-182 in trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells. Tumor Biology. 37 (4), 5413-5426 (2016).
- Rong, L., et al. Salidroside induces apoptosis and protective autophagy in human gastric cancer AGS cells through the PI3K/Akt/mTOR pathway. Biomedicine & Pharmacotherapy. 122, 109726 (2020).
- Zeng, Q., et al. Salidroside promotes sensitization to doxorubicin in human cancer cells by affecting the PI3K/Akt/HIF signal pathway and inhibiting the expression of tumor-resistance-related proteins. Journal of Natural Products. 85 (1), 196-204 (2022).
- Wang, X. B., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA210/ISCU1/2 (COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801 (2019).
- Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912, 174617 (2021).
- Jiang, S. N., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. European Journal of Pharmacology. 925, 175015 (2022).
- Wang, X. B., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115278 (2022).
- Vasileva, L. V., et al. Antidepressant-like effect of salidroside and curcumin on the immunoreactivity of rats subjected to a chronic mild stress model. Food and Chemical Toxicology. 121, 604-611 (2018).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
- Fan, F. F., et al. Salidroside as a potential neuroprotective agent for ischemic stroke: A review of sources, pharmacokinetics, mechanism and safety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 129, 110458 (2020).
- Hu, X. L., Zhang, X. Q., Qiu, S. F., Yu, D. H., Lin, S. X. Salidroside induces cell-cycle arrest and apoptosis in human breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 398 (1), 62-67 (2010).
- Zhao, G., Shi, A. P., Fan, Z. M., Du, Y. Salidroside inhibits the growth of human breast cancer in vitro and in vivo. Oncology Reports. 33 (5), 2553-2560 (2015).
- Bai, J. R., et al. The enhanced mitochondrial dysfunction by cantleyoside confines inflammatory response and promotes apoptosis of human HFLS-RA cell line via AMPK/Sirt 1/NF-κB pathway activation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 149, 112847 (2022).
- Hou, Y., et al. Longzhibu disease and its therapeutic effects by traditional Tibetan medicine: Ershi-wei Chenxiang pills. Journal of Ethnopharmacology. 249, 112426 (2020).
- Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapus ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).
- Cui, L. J., et al. Salidroside promotes apoptosis of human HCT116 colon cancer cells by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway. Pharmacological Research - Modern Chinese Medicine. 3, 100088 (2022).
- Wu, S. L., et al. Genome-wide 5-Hydroxymethylcytosine profiling analysis identifies MAP7D1 as a novel regulator of lymph node metastasis in breast cancer. Genomics Proteomics & Bioinformatics. 19 (1), 64-79 (2021).
- Du, J. W., et al. Targeted NIRF/MR dual-mode imaging of breast cancer brain metastasis using BRBP1-functionalized ultra-small iron oxide nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 116, 111188 (2020).
- Wang, S. F., et al. Mitochondrial stress adaptation promotes resistance to aromatase inhibitor in human breast cancer cells via ROS/calcium up-regulated amphiregulin-estrogen receptor loop signaling. Cancer Letters. 523, 82-99 (2021).
- Zuo, Y., et al. Activation of mitochondrial-associated apoptosis signaling pathway and inhibition of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway by voacamine suppress breast cancer progression. Phytomedicine. 99, 154015 (2022).
