Summary
In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von primären Cochlea-Haarzellen von Mäusen vor. Zunächst wurde das Corti-Organ aus neonatalen (3-5 Tage alten) murinen Cochleae unter dem Mikroskop präpariert. Anschließend wurden die Zellen enzymatisch zu einer Einzelzellsuspension verdaut und nach mehreren Tagen in Kultur mittels Immunfluoreszenz identifiziert.
Abstract
Cochlea-Haarzellen sind die sensorischen Rezeptoren des Hörsystems. Diese Zellen befinden sich im Corti-Organ, dem Sinnesorgan, das für das Hören zuständig ist, im knöchernen Labyrinth des Innenohrs. Cochlea-Haarzellen bestehen aus zwei anatomisch und funktionell unterschiedlichen Typen: äußeren und inneren Haarzellen. Eine Schädigung eines der beiden führt zu Hörverlust. Vor allem, da sich die inneren Haarzellen nicht regenerieren können und die Schäden an ihnen dauerhaft sind. Daher ist die In-vitro-Kultivierung von primären Haarzellen unabdingbar, um die schützende oder regenerative Wirkung von Cochlea-Haarzellen zu untersuchen. Ziel dieser Studie war es, eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von Haarzellen von Mäusen zu finden.
Nach manueller Entfernung der Cochlea-Seitenwand wurde das Hörepithel unter einem Mikroskop sorgfältig aus dem Cochlea-Modiolus präpariert, 10 Minuten lang bei 37 °C in einer Mischung aus 0,25 % Trypsin-EDTA inkubiert und mit einer 200-μl-Pipettenspitze vorsichtig in einem Nährmedium suspendiert. Die Zellsuspension wurde durch einen Zellfilter geleitet, das Filtrat wurde zentrifugiert und die Zellen wurden in 24-Well-Platten kultiviert. Die Haarzellen wurden auf der Grundlage ihrer Fähigkeit identifiziert, einen Mechanotransduktionskomplex, Myosin-VIIa, zu exprimieren, der an motorischen Spannungen beteiligt ist, und durch selektive Markierung von F-Aktin unter Verwendung von Phalloidin. Die Zellen erreichten nach 4 Tagen in Kultur eine Konfluenz von >90 %. Diese Methode kann unser Verständnis der biologischen Eigenschaften von in vitro kultivierten Haarzellen verbessern und die Effizienz von Cochlea-Haarzellkulturen demonstrieren, wodurch eine solide methodische Grundlage für die weitere auditive Forschung geschaffen wird.
Introduction
Cochlea-Haarzellen spielen eine wichtige Rolle bei der Schallerkennung und Signalübertragung an den Hörnerv. Haarzellen sind mechanistische Zellen, die als primäre Sinnesrezeptoren fungieren und Schallschwingungen in Wirbeltieren in elektrische Signale umwandeln. Das sensorische Epithel des Innenohrs von Säugetieren besteht aus einer einzigen Reihe innerer Haarzellen und drei Reihen äußerer Haarzellen. In verschiedenen basischen Membranbereichen nehmen Haarzellen Töne mit unterschiedlichen Frequenzen (zwischen 20 und 2.000 Hz) wahr1. Die Funktion der äußeren Haarzellen ist ein aktiver mechanischer Verstärkungsprozess, der bei der Feinabstimmung des Innenohrs von Säugetieren hilft und eine hohe Empfindlichkeit gegenüber Geräuschen verleiht. Innere Haarzellen sind für die Erkennung von Geräuschen zuständig. Nach der abgestuften Depolarisation werden akustische Informationen über die Hörnervenfasern an das Gehirn weitergeleitet2.
Hörverlust kann durch genetische Defekte, Alterung, Lärmtraumata oder den übermäßigen Gebrauch von ototoxischen Medikamenten verursacht werden, die weltweit ein großes Gesundheitsproblem darstellen 3,4. Hörverlust resultiert hauptsächlich aus irreversiblen Schäden an Haarzellen5. In Bezug auf lärminduzierten Hörverlust haben sich die Forscher zwar über mehrere Details ihrer Ätiologie geeinigt, aber es fehlt ein umfassendes Verständnis der zahlreichen zugrunde liegenden Mechanismen. Äußere Haarzellen sind besonders anfällig für akustische Überbelichtung6. Mechanosensitive Cochlea-Haarzellen sind an altersbedingtem Hörverlust beteiligt. Die molekularen und zellulären Mechanismen, die der Degeneration von Haarzellen zugrunde liegen, sind jedoch noch unbekannt. Mehrere Veränderungen in den molekularen Prozessen führen zu Haarzellalterung, oxidativem Stress, DNA-Schadensreaktion, Autophagie und Dysregulation der Expression und Transkription von Genen, die mit der Spezialisierung von Haarzellen zusammenhängen7.
Da das Innenohr vom Schläfenbein tief im härtesten Knochen des Körpers umhüllt ist, ist es experimentell nicht zugänglich, was eine Herausforderung für die Erforschung der Mechanismen der Reparatur und Regeneration von Haarzellen darstellt. Die Etablierung von In-vitro-Kulturen zur Untersuchung der Funktion von Haarzellen ist daher zu einer idealen Methode geworden, um die Regenerations- und Verletzungsmechanismen des Innenohrs zu erforschen. Die Verfahren zur Herstellung von organotypischen Cochlea-Kulturen wurden in früheren Studienbeschrieben 8,9,10. Forscher auf der ganzen Welt haben verschiedene Techniken der Cochlea-Mikrodissektion und Oberflächenpräparation eingesetzt. Trotz der anhaltenden Herausforderungen konnten verschiedene primäre Haarzellkultursysteme erfolgreich in vitro etabliert werden. Cochlea-Organkulturen enthalten verschiedene Zelltypen, darunter Haarzellen, Deiters-Zellen, Hensen-Zellen, Säulenzellen und Hörnervenfasern. Ein tiefgreifendes Verständnis der Veränderungen in Haarzellen auf zellulärer und molekularer Ebene nach einer Verletzung wird die Entwicklung leistungsfähigerer Forschungswerkzeuge ermöglichen. Ziel dieser Studie war es, die Schritte zur Isolierung von Cochlea-Organen von neugeborenen Mäusen und zur enzymatischen Ablösung der reichlich vorhandenen Haarzellen für In-vitro-Studien zu demonstrieren. Die Beschaffenheit der kultivierten Zellen wurde durch Immunfluoreszenzfärbung bestätigt.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden vom Xi'an Jiaotong University Committee on the Use and Care of Animals genehmigt (Nr. 2021-847).
1. Sterilisation und Materialvorbereitung
- Sterilisieren Sie die Präparierwerkzeuge mittels Hochtemperatur- und Hochdruck-Dampfdesinfektion und trocknen Sie sie über Nacht in einem 50 °C warmen Inkubator.
- 100 ml des Nährmediums mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 10 mg/ml Penicillin/Streptomycin (10 ml FBS und 10 μl Penicillin-Stammlösung zu 90 ml Modified Eagle Medium (EMEM) von Dulbecco geben) im Voraus zubereiten und bei 4 °C lagern.
2. Dissektion und Entfernung des Schläfenbeins zur Entnahme von Hörepithelien
- Euthanasie einer Gesamtzahl von 10 neugeborenen Mäusen (im Alter zwischen P3 und P5) durch Enthauptung auf Eis. Verwenden Sie bei Bedarf eine alternative, ethisch anerkannte Methodik.
- Halten Sie den Kopf an Ort und Stelle, öffnen Sie die Kopfhaut entlang der sagittalen Naht mit einer Mikro-Operationsschere und trennen und fixieren Sie die Kopfhaut beidseitig mit den Fingern, wie in Abbildung 1A gezeigt.
- Entfernen Sie das Gehirn mit einem kleinen Periostlift und halbieren Sie den Basalschädel. Schneiden Sie den Schädel mit einer Schere ab und drehen Sie ihn nach vorne, um den Schädel zu öffnen. Benutze die Spitze der Schere, um das Gehirn abzukratzen und die Schädelbasis freizulegen.
- Beobachten Sie die bilateralen Schläfenknochen an der Schädelbasis (Abbildung 1C). Schneiden Sie mit einer Schere die Schädelbasis entlang der Mittellinie ab, kratzen Sie die Haut ab und entfernen Sie unnötigen Knochen (Abbildung 1D,D').
- Die Schläfenknochen werden aufbewahrt und in sterile 35-mm-Petrischalen mit frischer Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) überführt (Abbildung 1E).
- Verwenden Sie zwei #5-Pinzetten, um die Bulla und das umgebende Gewebe aus dem petrosen Teil des Schläfenbeins zu entfernen (Abbildung 1E).
HINWEIS: In diesem Stadium wäre das knöcherne Labyrinth im Schläfenbein der Mäuse nicht vollständig verkalkt und würde leicht mit einer Pinzette präpariert werden können. - Halten Sie die Pinzette mit einer Hand fest, um den halbkreisförmigen Teil des Schläfenbeins zu fixieren, und stecken Sie mit der anderen Hand den unteren Fuß der Pinzette in die runde Fensternische, um den lateralen Knochen der Cochlea vom Scala-Vestibulum zu trennen. Entfernen Sie vorsichtig den petrosen Teil des Schläfenbeins, ohne das OC-Epithel zu berühren. Anschließend wird das knöcherne Labyrinth der Cochlea vorsichtig vom basalen Ende bis zum apikalen Ende abgetrennt und entfernt (Abbildung 1F).
- Das Organ des sensorischen Corti-Epithels wird vorsichtig mit einer #5-Pinzette vom Modiolus isoliert (Abbildung 1G).
- Halten Sie das Spiralband fest, trennen Sie es vorsichtig mit einer mikrooperativen Pinzette von der Stria vascularis und übertragen Sie das saubere Hörepithel mit einer 200-μl-Pipette in eine 3 mm große sterile Kulturschale mit HBSS (Abbildung 1H).
- Entnehmen Sie 20 Proben von jedem Tier und überführen Sie sie schnell in eine sterile 100 mm Petrischale mit HBSS für den nächsten Präparationsschritt (Abbildung 1).
3. Enzymatische Disaggregation zur Gewinnung von Hörhaarzellen
- Das Hörepithel wird in 10 ml frisches DMEM mit 0,25 % Trypsin überführt und 12 Minuten lang bei 37 °C inkubiert.
- Mit einer 200-μl-Pipettenspitze die Haarzellen unter einem Operationsmikroskop vorsichtig von der Basallamina und anderen Zellen trennen.
- Fügen Sie weitere 10 ml Nährmedium hinzu, um die Disaggregation zu hemmen.
- Die suspendierten Zellen im Nährmedium werden durch einen 70-μm-Filter filtriert, das Filtrat in einem sauberen 50-ml-Röhrchen gesammelt und 5 Minuten lang bei 300 × g zentrifugiert.
- Resuspendieren Sie die Haarzellen in mindestens 5 ml Nährmedium, indem Sie sie mit einer 1.000-μl-Pipettenspitze vorsichtig auf und ab pipettieren. Vermeiden Sie das Einbringen von Blasen.
- Legen Sie im Voraus ein Deckglas auf den Boden einer Sechs-Well-Platte. Zählen Sie die Zellen und kultivieren Sie sie mit einer Dichte von 10bis 6 Zellen/ml in Sechs-Well-Platten.
- Die adhärenten Zellen werden in 2 ml DMEM (mit 10 % FBS, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin) bei 37 °C und 5 % CO2 gezüchtet. Wechseln Sie täglich das Nährmedium.
HINWEIS: Es sollte erwähnt werden, dass die Verwendung dieses Protokolls nicht dazu führt, dass reine Haarzellen gewonnen werden. Basierend auf dieser primären Zellkulturmethode empfehlen wir die Verwendung von d2- oder d3-Zellen für weitere Studien, da Haarzellen etwa 70 % der Zellen in Kultur ausmachen und sich in einem guten Zustand befinden können.
4. Immunfluoreszenz-Färbung
- Entnehmen Sie die kultivierten Zellen von d1 bis d6 (eine Vertiefung pro Tag). Saugen Sie das Nährmedium ab und spülen Sie die Zellen 2x mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Fixieren Sie die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd für 15 Minuten bei Raumtemperatur (RT).
- Entfernen Sie das Fixiermittel und spülen Sie die Zellen 3 x 3 min lang mit PBS.
- Permeabilisieren Sie die Zellen mit PBS mit 0,2% Triton X-100 für 10 min bei RT.
- Inkubieren Sie die permeabilisierten Zellen mit einer Blockierungslösung, die aus 10% FBS in PBS besteht, für 20 min bei RT.
- Färben Sie die Zellen mit monoklonalen Anti-Myosin-Antikörpern (verdünnt auf 1:200 in PBS) bei 4 °C über Nacht.
- Waschen Sie die Zellen 3x mit sterilem PBS und inkubieren Sie sie mit sekundären Antikörpern (Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit MYO7A, verdünnt 1:500 in PBS) und Fluorescein-markiertem Phalloidin (Alexa Fluor 488, zur Identifizierung der Zellstruktur) für 2 h bei RT.
- Spülen Sie die Zellen 3x mit PBS, um die Sekundärantikörper zu entfernen.
- Geben Sie 1-2 Tropfen Eindeckmedium mit DAPI auf die Objektträger, montieren Sie die Deckgläser und legen Sie sie unter ein konfokales Laserscanning-Mikroskop, um Fotos von den Zellen aufzunehmen.
5. Statistische Analyse
- Führen Sie eine Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) durch, gefolgt von Tukey-Post-hoc-Tests, um die Veränderungen der Grauwerte von Myosin-VIIa und Phalloidin im Laufe der Zeit zu analysieren. Verwenden Sie die Buchstabenmarkierungsmethode, um statistische Unterschiede zu markieren.
- Führen Sie zusätzliche Einweg-ANOVAs durch, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Tests, um das Phalloidin-positive Zellverhältnis zwischen Zellproben von Tag 1 bis Tag 6 und das Myosin-VII-positive Zellverhältnis an denselben Tagen zu vergleichen.
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Representative Results
Nach diesem Protokoll haben wir die isolierten Zellen ausgesät. Primäre Cochlea-Haarzellsamen galten als erfolgreich, wenn die Zellen nicht im Nährmedium schwammen und sich innerhalb von 24 Stunden ausbreiteten. Wir bestimmten die Anzahl der Haarzellen, nachdem sie am Boden der Schale anhafteten und sich in flachen Aggregaten ausbreiteten. Nach 1 Tag wurden lebende Haarzellen fest an den Boden der Kulturschale geklebt und nicht anhaftende Zellen wurden durch Spülen mit PBS entfernt. Typischerweise verdoppelte sich die Anzahl der Zellen nach 3 Tagen Kultur (Abbildung 2).
Die Immunfluoreszenz (IF) zeigte die Expression von Myosin-VIIa und Phalloidin bis d6 (Abbildung 3A). Wir beobachteten, dass der Myosin-VIIa-Grauwert und das positive Zellverhältnis mit der Zeit abnahmen, während der Phalloidin-Grauwert und das positive Zellverhältnis im Vergleich zu denen bei d1 nach der Kultur gleich blieben (Abbildung 3B-D). Wir verwendeten eine organische Kultur als Positivkontrolle, um zu überprüfen, ob es sich bei den Myosin-VIIa-positiven Zellen tatsächlich um Haarzellen handelte. Ergänzende Abbildung S1 zeigt die Immunfluoreszenzfärbung von Myosin-VIIa (grün), Phalloidin (grün) und 4′6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, blau) im Hörepithel nach 2 Tagen Kultur.
Mit Hilfe von IF haben wir bestätigt, dass es sich bei den erhaltenen Zellen um Haarzellen handelt. Insbesondere beobachteten wir, dass die meisten kultivierten Zellen eine positive Färbung für den auditorischen Zellmarker Myosin-VIIa (rot) Protein aufwiesen, der auch unter dem Fluoreszenzmikroskop ein längliches Erscheinungsbild aufwies (Abbildung 3A). Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass es sich bei den kultivierten Zellen hauptsächlich um Haarzellen handelte.
Abbildung 1: Dissektion und Entfernung des Schläfenbeins zur Entnahme von Hörepithelien. (A) Enthauptung und Öffnung des Schädels entlang der sagittalen Naht; (B) Entfernung des Gehirns. (C) Blick auf die bilateralen Schläfenknochen in der Schädelbasis. Die rechten Schläfenknochen (D) nach Entfernung von Knochen und Tissuren, die das Schläfenbein (D') umgeben, markiert mit OC und PSD. (E) Übertragen Sie die Schläfenknochen in frische Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), entfernen Sie den Steigbügel und legen Sie ihn mit der ovalen Fensterseite nach oben auf. (F) Das knöcherne Labyrinth der Cochlea vom basalen bis zum apikalen Ende vorsichtig abtrennen und entfernen. Das Organ des Corti-Sinnesepithels (G) klebte an der Stria vascularis, (H) getrennt von der Stria vascularis. Maßstabsbalken = 1.000 μm (C-H). Abkürzungen: OC = Corti-Organ; PSD = hinterer Bogengang; SV = Stria vascularis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Haarzellen 4 Tage nach der Kultivierung. Lichtmikroskopische Untersuchung 4 Tage nach der Kultivierung. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Nachweis von Markern auf der Haarzelloberfläche mittels Immunfluoreszenz. (A) Myosin-VIIa (rot), Phalloidin (grün) und DAPI (blau) Immunfluoreszenzfärbung von Tag 1 bis Tag 6 nach der Zellkultur. (B, C) Grauwertanalyse von Myosin-VIIa und Phalloidin; Statistische Unterschiede sind durch Buchstaben gekennzeichnet. (D) Vergleich des Phalloidin-positiven Zellverhältnisses zwischen Zellproben von Tag 1 bis Tag 6 und Myosin-VII an denselben Tagen. Großbuchstaben stehen für statistische Ergebnisse für Phalloidin, während Kleinbuchstaben für statistische Ergebnisse für Myosin-VIIa stehen. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts dargestellt. N = 5; Maßstabsbalken = 50 μm. Für die Grauwertanalyse von Myosin-VIIa und Phalloidin wurde eine Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) mit anschließendem Tukey-Post-hoc-Test durchgeführt. Es wurde eine Einweg-ANOVA durchgeführt, um das Phalloidin- und Myosin-VII-positive Zellverhältnis zwischen Zellproben von d 1 bis d 6 zu vergleichen. Unterschiedliche Buchstaben zeigen statistische Unterschiede in der Phalloidin-Färbung an, während kleine Buchstaben statistische Unterschiede in der Myosin-VIIa-Färbung anzeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung S1: Immunfluoreszenzdetektion von Haarzelloberflächenmarkern in organischer Kultur. Die Immunfluoreszenzfärbung von Myosin-VIIa (grün), Phalloidin (grün) und DAPI (blau) wurde auf d 2 der organischen Kultur durchgeführt. Maßstabsleiste = 10 μm. Abkürzungen: IHC, innere Haarzelle; OHC, äußere Haarzelle; DAPI, 4′,6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S2: Immunfluoreszenzdetektion von Oberflächenmarkern in passageierten Haarzellen. (A) Die Immunfluoreszenzfärbung von Myosin-VIIa (rot), Phalloidin (grün) und DAPI (blau) wurde an organischen Kulturen an den Passagen 2 und 3 durchgeführt. (B) Vergleich der Anzahl der Phalloidin-positiven Zellen, Myosin-VIIa-positiven Zellen und der Gesamtzahl der Zellen von den Primärzellen bis zur Passage 3. N = 3; Maßstabsleiste = 100 μm. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Im Vergleich zur HEI-OC1-Zelllinie bildeten Primärkulturen von Haarzellen den physiologischen Zustand der Zellen in vivo genauer nach. Daher scheint die auditive Primärkulturmethode, bei der lebende Zellen aus Cochlea-Organen isoliert und sofort kultiviert werden, ein wertvolles Werkzeug für umfangreiche Forschungen am auditorischen System zu sein. Bestimmte Techniken sind entscheidend für eine erfolgreiche Kultur. Erstens erhöht die Minimierung der Dauer der Trennung des Corti-Organs vom Schläfenbein die Wahrscheinlichkeit einer anhaltenden Aktivität der Haarzellen. Folglich ist es für Forscher unerlässlich, das Zeitintervall zwischen der Sektion und dem Eintauchen von Organen in PBS zu minimieren. Basierend auf unseren experimentellen Beobachtungen reicht eine Dauer von ca. 2-3 h aus, um 10 Mäuse zu sezieren und die 20 Innenohren auf einmal zu erhalten. Während des enzymatischen Disaggregationsprozesses ist es ratsam, die Dauer auf 12 min zu beschränken und die Cochlea-Organe nach einer Inkubationszeit von 8 min in Pipetten zu überführen. Die Organe wurden nach ca. 10 Pipettierzyklen unter dem Mikroskop beobachtet und die enzymatische Disaggregation gestoppt, als sich fast alle Zellen von der Basilarmembran gelöst hatten. Ansonsten wurden die Organe für weitere 4 Minuten in den Inkubator zurückgebracht. Auch die Wahl des Antibiotikums ist wichtig. Wir empfehlen die Verwendung von 10 mg/ml Penicillin/Streptomycin, um mögliche Kontaminationsprobleme zu vermeiden, da einige Aminoglykosid-Antibiotika ototoxisch sein und zum Absterben von Haarzellen führen können.
Obwohl Myosine der Klasse VII in tierischem Gewebe weit verbreitet sind, wird Myosin-VIIa nur in den Haarzellen der vestibulären und cochleären Organe des Innenohrs exprimiert. Myosine der Klasse VIIa spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Stereozilienstruktur, da sie dazu beitragen, Stereozilien in der Knöchelgelenksregion in Haarzellen miteinander zu verbinden11. Nach einer Zunahme der Dauer der primären Zellkultur und der Anzahl der Zellpassagen nahm auch der Abbau von Myosin-VIIa im Laufe der Zeit zu, während Phalloidin stabil blieb, was darauf hindeutet, dass die Funktion der auditorischen Zellen mit der Zeit abnahm. Die Haupteinschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass auditorische Zellen nur innerhalb von 6-7 Tagen verwendet werden können und länger brauchen, um zu wachsen als HEI-OC1-Zellen12. Darüber hinaus ist es unvermeidlich, dass Primärzellen schließlich altern und absterben und ein begrenztes Wachstumspotenzial aufweisen. Darüber hinaus sind die zeitlichen und wirtschaftlichen Kosten für die Isolierung und Kultivierung von Haarzellen oft hoch und erfordern umfangreiches Fachwissen. Das Corti-Organ enthält eine Vielzahl von neurosensorischen Zellen, darunter Innenhaare, Außenhaare und Stützzellen. Mit diesem Protokoll wurde eine Methode zur Trennung und Kultivierung dieser Zellen in vitro eingeführt. Primäre Zellen können zwischen Haar- und Stützzellen unterschieden werden, indem Myosin-VIIa bzw. Sox2 gefärbt wird13,14. Äußere und innere Haarzellen erfüllen unterschiedliche Funktionen. Die äußeren Haarzellen ändern schnell ihre Länge und Steifigkeit als Reaktion auf Änderungen des Membranpotenzials und werden in innere Haarzellen umgewandelt. Prestin ist ein Motorprotein der äußeren Haarzellen, während Slc17a8 (vGlut3) spezifisch in IHCs exprimiert wird und zur Unterscheidung innerer Haarzellen in vitro verwendet werden kann15,16,17,18.
Im Vergleich zu organischen Kulturen verändert sich die Morphologie der Haarzellen in primären Haarzellkulturen signifikant, was zu unterschiedlichen Morphologien und Mechanotransduktionsfunktionen führt. Organische Kulturen sind dreidimensionale primäre Zellkulturen, die stereotype Zellmuster, Polarität, Haarbündelbildung und neuronale Verbindungen innerhalb der Corti-Organe aufweisen. Im Gegensatz dazu haben primäre HEI-OC1-Zellen eine typische polygonale Form und wachsen flach durch statische Adhärenz in einer zweidimensionalen Kulturumgebung19. Organische Kulturen und Primärzellen werden direkt aus Geweben isoliert und weisen eine normale Zellmorphologie und wichtige funktionsbezogene Marker auf. Im Gegensatz zu HEI-OC1-Zellen, die im Allgemeinen stark proliferativ sind, leichter zu kultivieren und zu transfizieren sind und jahrzehntelang erhalten werden können, haben diese Zellen jedoch eine begrenzte Lebensdauer und eine begrenzte Expansionskapazität.
Primärzellen haben viele Vorteile in der Zellkultur. Da Primärzellen aus Körpergeweben gewonnen und unter optimalen Wachstumsbedingungen kultiviert werden, ahmen sie die In-vivo-Gewebeumgebung genau nach. Die Verwendung von Primärzellen vermeidet viele ethische Einwände, die gegen Tierversuche erhoben werden, und liefert relevantere Ergebnisse als Zelllinien. Vorselektierte Primärzellen sind adäquate Modelle, die die molekulare Signalübertragung in vivo genau abbilden. Zellen verschiedener Spender reagieren unterschiedlich auf entzündungsfördernde Zytokine. Die Kosten für Isolierung und Kultur sind oft hoch, obwohl sie kostengünstiger sind als die von Tiermodellen. Die Materialien und Tiere, die in der hier beschriebenen primären Haarzellkultur verwendet wurden, waren einfach, ihre Kosten waren relativ niedrig und das System war einfach zu bedienen. Wenn keine optimalen Kulturbedingungen aufrechterhalten werden, können sich die Eigenschaften der Primärzellen mit nachfolgenden Passagen ändern. Mit zunehmender Anzahl der Passagen schwächte sich auch der Zellzustand ab (Ergänzende Abbildung S2). Da sie ohne Modifikation direkt aus nativem Körpergewebe gewonnen wurden, ahmten die erhaltenen auditorischen Haarzellen ihren In-vivo-Zustand und ihre Physiologie genau nach. Daher bieten primäre Haarzellen ein hervorragendes Modellsystem für die Untersuchung der Physiologie und Biochemie von Haarzellen, einschließlich des Zellstoffwechsels und der Arzneimitteltoxizität. Obwohl Primärzellen in vitro nur wenige Tage erhalten werden können, können sie nach genetischer Transformation immortalisiert und unbegrenzt geteilt werden, um sekundäre Zelllinien zu erhalten.
Zusammenfassend beschreibt das aktuelle Protokoll die Isolierung von Hörhaarzellen aus dem Schläfenbein mittels Mikrodissektion und enzymatischer Disaggregation. Das gesamte Protokoll dauerte ca. 3 Stunden, von der Sektion der Maus bis zur Zellplattierung. Die kultivierten Zellen wurden in hoher Reinheit gehalten und blieben 6-7 Tage lang gesund. Trotz der inhärenten Einschränkungen von primären Haarzellkulturen, die auf nur zwei Passagen beschränkt sind, verwendete dieses Protokoll einfache Methoden und Materialien und stellte damit einen neuen Weg für die Durchführung hocheffizienter Forschung an Cochlea-Haarzellen dar.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (NFSC 82101224 to YG) unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm BioLite cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 130182 | using for culture |
| 35 mm Nunc cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 150318 | using for culture |
| 6-well palate | Thermo Fisher Scientific | 310109005 | using for culture |
| 70 µm cell strainers | BD Company | 352350 | using for filter |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | immunofluorescent staining |
| Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientifc | A11008 | immunofluorescent staining |
| day 3-5 neonatal murine | provided by Xi'an Jiaotong University | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | using for culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | using for culture |
| Forceps | Dumont | 5# | using for dissection |
| Leica anatomy microscope | Germany | S9i | using for dissection |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | using for culture |
| Rabbit plyclonal to Myosin VIIa | Abcam company | ab92996 | immunofluorescent staining |
| Scissor | Belevor | 10cm/04.0524.10 | using for dissection |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | immunofluorescent staining |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | using for culture |
References
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