Summary
אנו מציגים שיטה לחקר הפצה מחדש של תאי גידול מגרורות ריאה הכוללת פרוטוקול כירורגי להמרה סלקטיבית של גרורות ריאה, ולאחר מכן זיהוי תאי גידול מחודשים באיברים שלישוניים.
Abstract
גרורות - ההתפשטות המערכתית של סרטן - היא הגורם המוביל למוות הקשור לסרטן. למרות שנהוג לחשוב על גרורות כתהליך חד-כיווני שבו תאים מהגידול הראשוני מפיצים ושולחים גרורות לזרעים, תאי גידול בגרורות קיימות יכולים גם להפיץ מחדשוליצור נגעים חדשים באתרים שלישוניים בתהליך המכונה "גרורות מגרורות" או "זריעת גרורות לגרורות". זריעת גרורות לגרורות עלולה להגביר את העומס הגרורתי ולפגוע באיכות חייו ובהישרדותו של החולה. לכן, הבנת התהליכים העומדים מאחורי תופעה זו חיונית לשכלול אסטרטגיות הטיפול בחולים עם סרטן גרורתי.
מעט ידוע על זריעת גרורות לגרורות, בין היתר בשל מגבלות לוגיסטיות וטכנולוגיות. מחקרים על זריעת גרורות לגרורות מסתמכים בעיקר על שיטות ריצוף, שעשויות להיות לא מעשיות עבור חוקרים החוקרים את העיתוי המדויק של אירועי זריעת גרורות לגרורות או מה מקדם או מונע אותם. זה מדגיש את היעדר מתודולוגיות המאפשרים את המחקר של זריעת גרורות לגרורות. כדי להתמודד עם זה, פיתחנו - ותאר כאן - פרוטוקול כירורגי מוריני להמרה סלקטיבית של גרורות ריאה, המאפשר סימון ספציפי ומעקב אחר גורל של תאי גידול העוברים מהריאה לאתרים שלישוניים. למיטב ידיעתנו, זוהי השיטה היחידה לחקר הפצה מחדש של תאי גידול וזריעת גרורות לגרורות מהריאות שאינה דורשת ניתוח גנומי.
Introduction
גרורות הן הגורם המוביל למוות הקשור לסרטן1. סרטן גרורתי מתעורר כאשר תאים מהגידול הראשוני מתפשטים בכל הגוף ומתרבים לגידולים הניתנים לגילוי קליני באיברים מרוחקים 2,3.
למרות שנהוג לחשוב על גרורות כתהליך חד-כיווני שבו תאי הגידול מתפשטים מהגידול הראשוני ומאכלסים איברים מרוחקים4, עדויות קליניות וניסיוניות הולכות וגדלות מצביעות על כך שקיים תהליך מורכב ורב-כיווני יותר. הוכח כי תאי גידול במחזור הדם יכולים לזרוע מחדש את הגידול הראשוני (אם הוא עדיין במקום)5,6,7,8,9, ותאי גידול ממוקדים גרורתיים קיימים יכולים לנסוע לאתרים שלישוניים וליצור נגעים חדשים 10,11,12,13 . ואכן, עדויות מניתוחים גנומיים שנערכו לאחרונה מצביעות על כך שחלק מהנגעים גרורתיים אינם נובעים מהגידול הראשוני, אלא מגרורות אחרות - תופעה המכונה "גרורות מגרורות" או "זריעת גרורות לגרורות"14,15,16. זריעת גרורות עד גרורות יכולה להנציח את תהליך המחלה גם לאחר הסרת הגידול הראשוני, להגדיל את הנטל הגרורתי ולפגוע באיכות החיים וההישרדות של החולה. לכן, הבנת התהליכים שמאחורי זריעת גרורות לגרורות חיונית לשכלול אסטרטגיות הטיפול בחולים עם מחלה גרורתית.
למרות ההשלכות הקליניות החמורות, מעט ידוע על זריעת גרורות לגרורות, בין היתר בשל מגבלות לוגיסטיות וטכנולוגיות. מחקרים בבני אדם מוגבלים על ידי מיעוט דגימות קליניות. כריתה קלינית וביופסיה של נגעים גרורתיים אינן שכיחות, כמו גם ביופסיה של איברים בריאים לכאורה, שבהם עשויים לארוב תאי גידול בודדים מופצים. משמעות הדבר היא כי מחקרים בבני אדם אפשריים בדרך כלל רק באמצעות דגימות נתיחה מאנשים שהגידולים העיקריים שלהם עדיין במקומם או שנכרתו בעבר אך עדיין זמינים לחוקרים. כאשר דגימות כאלה זמינות, יש לבצע ניתוחי שושלת של התקדמות הסרטן בשיטות ריצוף14. עם זאת, ריצוף בתפזורת של גידולים ראשוניים תואמים וגרורות אינו בעל הרגישות הדרושה למעקב מקיף אחר שושלת. לדוגמה, ריצוף בתפזורת של נגע אחד עשוי לחשוף תת-שיבוט שאינו ניתן לגילוי באף אחד מהנגעים התואמים לו. במקרה זה, לא ניתן יהיה לקבוע את מקורו של תת-שיבוט זה. ייתכן שהוא היה נוכח בגידול הראשוני או גרורות אחרות בתדירות נמוכה מגבול הגילוי, או שהוא נוצר לאחר הקולוניזציה הראשונית של הנגע הגרורתי שבו נמצא. ריצוף תא בודד מספק רגישות מוגברת, אך עלותו הגבוהה מגבילה את היישום בקנה מידה גדול של טכניקה זו. האופי הרטרוספקטיבי של מחקרים אלה פירושו גם שהם מספקים תובנה מוגבלת לגבי אירועים גרורתיים חולפים ונוף המחלה בנקודות זמן שונות.
במודלים של בעלי חיים, ההתקדמות הטכנולוגית האחרונה מאפשרת כעת מיפוי פילוגנטי פרוספקטיבי ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה 17,18,19,20. טכניקות אלה משתמשות בעריכת גנום CRISPR/Cas9 כדי להנדס תאים עם ברקוד מתפתח - מוטציות תורשתיות המצטברות עם הזמן. לאחר הריצוף, ניתן לעקוב אחר השושלת של כל תא בהתבסס על הפרופיל המוטציוני של הברקוד 17,18,19,20 שלו. ואכן, טכנולוגיה כזו כבר משמשת למיפוי זריעת גרורות לגרורות. במאמר שפורסם לאחרונה, Zhang et al. הראו כי תאי סרטן השד והערמונית בגרורות עצם מאדים מהעצם לזרע גרורות משניות באיברים מרובים21.
בעוד שלשיטות חדשניות אלה יש פוטנציאל גדול ליצור מפות פילוגנטיות מפורטות ברזולוציה גבוהה של התקדמות הסרטן, הן מאוד לא מעשיות עבור אלה החוקרים את העיתוי המדויק של אירועי זריעת גרורות לגרורות ומה מקדם או מונע אותם. מילוי פערי הידע הללו חיוני לשכלול ההבנה והטיפול שלנו בסרטן גרורתי, אך ניכר מחסור בטכנולוגיות שיאפשרו מחקרים כאלה. כדי לענות על צורך זה, פיתחנו לאחרונה - ומציגים כאן - טכניקה חדשנית המאפשרת לנו לסמן באופן ספציפי תאים סרטניים באמצעות פוטוהמרה באתר גרורתי (הריאה) ולאחר מכן לזהות אותם מחדש באיברים שלישוניים. באמצעות טכניקה זו, הראינו לאחרונה כי תאי סרטן השד אכן מתאדים מגרורות ריאה ואיברים שלישוניים של זרעים13. טכניקה זו עשויה לשמש גם כדי לקבוע את העיתוי של אירועי הפצה מחדש בתוך חלון צר ולכמת תאים סרטניים redisseminated, להקל על המחקר של organotropism של תאים redisseminated ומה מקדם/מונע הפצה חוזרת.
בעוד שפוטו-המרה ומערכות cre/lox מקומיות המחליפות לצמיתות חלבון פלואורסצנטי אחד בחלבון פלואורסצנטי אחר שימשו בעבר לסימון ומעקב אחר תאי הגידול 11,22,23, למיטב ידיעתנו, שום גישה לסימון מרחבי-זמני של תאי הגידול לא הותאמה למיקוד הריאה - אחד האתרים הנפוצים ביותר של גרורות בקרב גברים ונשים שאובחנו עם כל אחד מ-14 סוגי הסרטן הנפוצים ביותר 24. כל סוג תא סרטני וכל פרוטוקול ליצירת גרורות ריאה ניתן להשתמש עם ההליך שלנו, מה שהופך אותו שימושי באופן נרחב עבור חוקרי גרורות. כל התאים הסרטניים המשמשים ליצירת גרורות ריאה צריכים לבטא חלבון הניתן להמרה או להחלפת אור, וחוקרים יכולים לבחור באיזה חלבון להשתמש בהתבסס על הצרכים והמשאבים הספציפיים שלהם. במחקר זה, השתמשנו ב-6DT1 תאי סרטן שד שביטאו ביציבות את החלבון הפלואורסצנטי Dendra2 (6DT1-Dendra2) הניתן להמרה לאור ירוק-לאדום,25 המתויג להיסטון H2B. הזרקנו 5.0 × 104 6DT1-Dendra2 תאים לתוך כרית שומן החלב הרביעית של נקבות עכברי Rag2-/- עכברים. גידולים ראשוניים היו מוחשיים בין 12 ל -16 ימים לאחר ההזרקה ולא נכרתו במשך הניסוי. גרורות ריאה ספונטניות התפתחו בין 19 ל -26 ימים לאחר הזרקת תאי הגידול. ניתוחי פוטוקונפורמציה בוצעו בין 26 ל -29 ימים לאחר הזרקת תאי גידול. עכברים הוקרבו עד 72 שעות לאחר הניתוח עקב עומס גרורות ריאתיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות לשימוש בבעלי חוליות, כולל אישור מראש של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במכללת אלברט איינשטיין לרפואה.
לפני הניתוח, גרורות ריאה אמורות להיווצר בעכברים באמצעות תאים סרטניים המבטאים חלבון הניתן להמרה / פוטו-המרה; פורסמו מספר פרוטוקולים ליצירת גרורות ריאה 26,27,28.
1. הכנה לניתוח
- הכן אזורי עבודה נפרדים להכנת עכבר (הסרת שיער ואינטובציה), ניתוח והתאוששות.
- לעקר את כל כלי הניתוח באוטוקלאב.
הערה: מכיוון שטכניקה של טיפים בלבד משמשת לניתוח זה, ניתן להשתמש במעקר חרוזים חמים כדי לעקר מכשירים להליכים הבאים. - הפעל את פלטפורמת הניתוח המחוממת ואפשר לה להגיע ולהתייצב ב 37-40 מעלות צלזיוס.
- יש להשרות הרדמה עם 5% איזופלורן, ולאחר מכן להוריד את האיזופלורן ל-3%. בצע בדיקות צביטת בוהן מעת לעת לאורך כל ההליך כדי להעריך את הלימות ההרדמה.
- הניחו את העכבר המורדם במצב דקוביטוס צדדי ימני. הסירו את שיער החזה/פלג הגוף השמאלי העליון (ראו איור 1A) על-ידי מריחת קרם דה-פילטורי על האזור. הרטיבו חתיכת גזה או מגבת נייר במים ונגבו את השיער ואת קרם השיער. יש לחזור על הפעולה לפי הצורך עד להסרת כל השיער משדה הניתוח.
הערה: אין להשאיר קרם depilatory על העכבר במשך יותר מ 20 שניות, כמו זה יכול להזיק לעור. - קשר כפול ~ 3 מ"מ מעל בסיס קטטר 22 G עם תפר משי 2-0. השאירו זנבות באורך 2 אינץ'.
- אינטובציה העכבר עם קטטר זה כפי שתואר קודם29,30. כדי לאשר אינטובציה מוצלחת, חבר נורת ניפוח לקצה הצנתר וסחט בעדינות.
הערה: עכברים שעברו אינטובציה בהצלחה יחוו עליית חזה דו-צדדית עם לחיצת נורה. - הדקו היטב את תפר המשי 2-0 סביב חוטם העכבר באמצעות קשר כפול כדי לשמור על צנתר האינטובציה במקומו.
2. ניתוח לחשיפת הריאה
הערה: בצע את כל שלבי הניתוח (איור 1), כולל המרת אור, במכסה מנוע או בארון זרימה למינרי כדי למנוע זיהום של שדה הניתוח.
- שטפו ידיים עם סבון חיטוי ולבשו כפפות סטריליות חדשות.
הערה: מכיוון שטכניקה של טיפים בלבד משמשת לניתוח זה, ניתן להשתמש גם בכפפות לא סטריליות. מומלץ לחטא כפפות לא סטריליות בחומר חיטוי על בסיס אלכוהול. - להכין מינון של 0.1 מ"ג / ק"ג של buprenorphine (0.03 מ"ג / מ"ל) ולהזריק תת עורית עבור שיכוך כאבים.
הערה: משככי כאבים מולטימודאליים, כולל חוסמי כאב מקומיים ותרופות נוגדות דלקת לא סטרואידיות, יש להשתמש בשילוב עם buprenorphine אם הם לא צפויים להפריע לביולוגיה של עניין. - יש למרוח משחה אופתלמית על שתי עיני העכבר כדי למנוע נזק לקרנית.
- הניחו את העכבר במצב דקוביטוס צדדי ימני על משטח הניתוח המחומם.
- חבר את מכונת ההנשמה לצנתר האינטובציה. יש להקפיד להחזיק את הצנתר יציב, שכן אפילו תנועות קלות עלולות להפריע למיקום הצנתר ולהוביל לאוורור לקוי.
- שימו לב לחזה יציב, מבוקר הנשמה, דו-צדדי עולה ויורד.
- הצמידו את הגפיים למשטח הניתוח באמצעות סרט תיוג. ייצבו את שדה הניתוח על-ידי הנחת פיסת נייר דבק נוספת לאורך גבו של העכבר ואבטחת העור הגבי והפרווה למשטח הניתוח (איור 1A).
- פתח את כלי הניתוח המעוקרים.
- החל פתרון chlorhexidine על העור של העכבר כדי לעקר את אתר הניתוח.
- זהה את השטח ~ 7 מ"מ משמאל לעצם החזה ו~ 7 מ"מ מעל השוליים התת-קוסטליים. הרימו את העור מעל אזור זה בעזרת מלקחיים ובצעו חתך מעגלי ~ 10 מ"מ באמצעות מספריים חדים לניתוח מיקרו, תוך הקפדה לחתוך רק את העור.
- הסירו את הרקמה הרכה מעל כלוב הצלעות (איור 1B). צרוב כל כלי גדול בשני הקצוות עם עט cautery.
הערה: בנוסף לכריתת כל הרקמה הרכה הנמצאת מתחת לחתך המעגלי בקוטר 10 מ"מ בעור, הסרת רקמה רכה נוספת שאינה שרירית מההיקף מקלה על שלבים עתידיים של ההליך. - ביד אחת, השתמש במלקחיים כדי להריםאת הצלע 6 או 7. עם היד השנייה, השתמשו בלהב יחיד של מספריים מנתחים זעירים קהים – בזווית מקבילה לדופן בית החזה, קצה מעוגל הפונה כלפי מטה – וחדרו בזהירות את השריר הבין-קוסטליה-6 אוה-7 כדי להיכנס לחלל בית החזה (איור 1C). סובבו בעדינות את המספריים לפי הצורך וחתכו כדי לבצע חתך ~ 10 מ"מ בחלל הבין-קוסטלי, תוך הקפדה להימנע מלגעת ברקמת הריאה ולחתוך את הצלעות.
- פריקה עדינה של אוויר דחוס לכיוון החתך הבין-קוסטלי כדי להגדיל את החלל בין הריאה לקיר החזה. יש לפרוק את האוויר תחילה בפרק כף היד או ביד כדי למצוא את חוזק הזרימה המתאים ולנקות את הזרבובית מכל פסולת, ולאחר מכן בפרצים קצרים בחתך כדי למנוע פגיעה בריאות.
- ביד אחת, השתמש במלקחיים כדי להריםאת הצלע 6 או 7. עם היד השנייה, להחזיק את retractor סגור ולהכניס אותו לתוך חתך intercostal. כוונו את להבי הריאה כך שיהיו מקבילים לדופן בית החזה, תוך הקפדה להימנע מלגעת בריאה עצמה (איור 1D).
- ברגע שהמחזיר נמצא במקומו, שחררו לאט את הידית, ואפשרו למושך להיפתח ולחשוף את הריאה (איור 1E). איור 2A מראה תמונות מייצגות של גרורות ריאה חשופות לפני המרת פוטו, כולל איך הן נראות לעין בלתי, ובתעלות הפלואורסצנטיות FITC (ירוקות, לא פוטומרות) ו-TRITC (אדומות, פוטו-מומרות) תוך שימוש בתאורת שדה רחב.
3. המרת פוטו גרורות ריאה
הערה: פרטים ווריאציות על השלבים הבאים ניתן למצוא בדיון.
- יש למרוח בעדינות 2-3 טיפות PBS סטריליות המחוממות ל-37°C על רקמת הריאה החשופה כדי למנוע התייבשות.
- מניחים חתיכת נייר אלומיניום סטרילי עם מגרעת קטנה מעל העכבר. מקם את המגרעת ישירות מעל רקמת הריאה החשופה וגודל אותה כך שתחשוף רק את החלק הפתוח של בית החזה וכמה מילימטרים של הרקמה הרכה והעור שמסביב כדי להבטיח המרה של הריאה החשופה בלבד.
- מניחים קופסה עם מגרעת מעל העכבר ורדיד אלומיניום. ודא כי המגרעת היא ישירות מעל הריאה החשופה.
- הניחו את מנורת המרת האור ישירות מעל המגרעת שעל הקופסה (איור 1F).
- הפעל את מנורת הפוטו-המרה ואפשר 6 דקות של הארה רציפה של רקמת הריאה החשופה.
הערה: עקוב אחר הסימנים החיוניים של העכבר באמצעות תוכניות ניטור פיזיולוגיות על מכונת ההנשמה. - לאחר המרת הצילום, כבה את המנורה והסר את המנורה, הקופסה ומסיכת רדיד האלומיניום מהעכבר.
4. נוהל סגירת דופן החזה
- חזור על שלב 2.13 כדי להפריד את הריאה מקיר החזה.
- אחזו בזהירות בידית המשליפה וסחטו כדי לסגור את הלהבים.
- תמרן את retractor סגור מתוך החלל intercostal, בזהירות כדי למנוע נגיעה ברקמת הריאה.
- באמצעות תפר משי 5-0, סגרו את החתך הבין-קוסטלי בעזרת תבנית תפר רציפה פשוטה המשלבת את הצלע משני צידי החתך (איור 1G). משכו את התפר בחוזקה כדי לוודא שקצוות הפצע מתאפסים ולבסס מחדש את שלמות דופן בית החזה (איור 1H). היזהר לא להדק את התפר יתר על המידה כמו זה עלול לקרוע את השרירים intercostal.
- אבטחו את התפר על ידי קשירת שני קצוות התפר יחד פי 4. חותכים את זנבות התפרים קרוב ככל האפשר לקשר.
- סגור את העור עם סיכות כירורגיות.
- הסר אוויר עודף מחלל בית החזה עם מזרק אינסולין 1 מ"ל עם מחט 28 גרם מחוברת. אתר את תהליך הקסיפואיד באופן מישושי, והכנס את המחט ממש מתחת, מתקדם לכיוון כתף שמאל כדי להיכנס לחלל בית החזה דרך הסרעפת. למשוך בחזרה על מזרק ~ 1 מ"ל; הסר את המחט מהעכבר ופרוק את האוויר מהמזרק. חזור על תהליך זה 3-4x.
הערה: יש להקפיד לא לנקב איברים פנימיים. יתר על כן, חשוב להשתמש מזרק 1 מ"ל ולחזור על ההליך 3-4x במקום להשתמש מזרק נפח גדול יותר ולנסות להסיר את כל האוויר בבת אחת. שימוש במזרק בנפח גדול יותר עלול לגרום לוואקום גדול מדי בחלל בית החזה ולהוביל להתנפחות ונזק לרקמת הריאה. - כבה את האיזופלורן.
- יש להמשיך באוורור עם 100% חמצן עד שהעכבר מראה סימני התעוררות.
- ברגע שהעכבר מראה סימני התעוררות, נתקו את צנתר האינטובציה ממכונת ההנשמה, חתכו את התפר סביב החוטם והוצאו את העכבר.
- שחרר את העכבר והעבר אותו לכלוב נקי הממוקם ~ 2 מטר מתחת למנורת חום. יש לפקח עד להתאוששות מלאה. אם העכבר מראה סימנים של קשיי נשימה או חוסר ניידות, להרדים אותו עם 5% איזופלורן במשך 5 דקות, להבטיח הרדמה נאותה על ידי התבוננות באובדן רפלקסים על צביטת הבוהן, ולהרדים באמצעות נקע צוואר הרחם.
- ברגע שהעכבר מתעורר לחלוטין מההרדמה ומתחיל לנוע, הכינו מנה נוספת של 0.1 מ"ג/ק"ג של בופרנורפין והזריקו אותו תת עורית לשיכוך כאבים לאחר הניתוח.
- לאחר הניתוח, יש לוודא שהעכברים שוכנו בנפרד. לספק אנטיביוטיקה במי השתייה (enrofloxacin, ריכוז סופי 0.4 מ"ג / מ"ל).
- ב-3 הימים שלאחר הניתוח יש לבדוק את העכבר פעמיים ביום לאיתור סימני מצוקה. לטיפול בכאב, יש לתת 0.1 מ"ג/ק"ג בופרנורפין (0.03 מ"ג/מ"ל) תת עורית כל 4-6 שעות. הרדימו את העכבר אם הוא מראה סימנים של זיהום, חוסר תנועה או קשיי נשימה. לאחר היום השלישי, עכברים ניתן לבדוק פעם ביום.
5. עיבוד דגימה וזיהוי תאים פוטומרים באמצעות ניקוי רקמות
- בין 3 ל 5 ימים (או משך הזמן הרצוי) לאחר ניתוח photoconversion, להרדים את העכבר עם 5% isoflurane, להפחית isoflurane מ 5% ל 2.5% לאחר זירוז, להבטיח הרדמה נאותה על ידי התבוננות אובדן רפלקסים על צביטת הבוהן, ולבצע זילוח transcardial מסוף עם 10 מ"ל של PBS בטמפרטורת החדר, ואחריו 10 מ"ל של 4% paraformaldehyde מקורר ל 4 ° C כפי שתואר קודם31.
- לאסוף את האיברים המעניינים ולנקות אותם אופטית כפי שתואר קודם31.
- דמיינו את הרקמות שנוקו במיקרוסקופ בהיר כפי שתואר קודם לכן31. לחלופין, מקם את הרקמות המנוקות בצלחת תחתית זכוכית ותמונה בתעלות FITC ו- TRITC כדי להמחיש תאים ירוקים (שאינם פוטומרים) ואדומים (פוטומרים) באמצעות דיסק קונפוקלי, מסתובב או מיקרוסקופ רב-פוטונים.
6. עיבוד דגימה וזיהוי של תאים פוטומוסבים באמצעות פירוק רקמות
- מרדימים את העכבר עם 5% איזופלורן למשך 5 דקות, מבטיחים הרדמה נאותה על ידי התבוננות באובדן רפלקסים על צביטת הבוהן, ומקריבים באמצעות נקע צוואר הרחם 3-5 ימים לאחר הפוטו-המרה.
- לאסוף ולעכל את האיברים המעניינים כפי שתואר קודם13.
- צלחת את הרקמות מעוכלות ומניחים אותם באינקובטור לדבוק לילה כפי שתואר קודם13.
- למחרת, צייר את התאים המצופים בערוצי FITC ו- TRITC כדי להציג באופן חזותי תאים ירוקים (שאינם פוטומרים) ואדומים (פוטומרים) כפי שתואר קודם לכן13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שלבי הניתוח המתוארים בפרוטוקול זה מתוארים באיור 1. בקיצור, העכבר מורדם, והשיער מוסר מבית החזה השמאלי. לאחר מכן העכבר מונשם ומאוורר, מה שמאפשר לעכבר לקבל חמצן בזמן שחלל בית החזה פתוח. רקמות רכות מוסרות כדי לחשוף את כלוב הצלעות, וחתך נעשה בשרירintercostal 6 או 7. מחזיר מוכנס לפרצה הבין-קוסטלית ומשוחרר כדי לפזר את הצלעות הסמוכות ולחשוף את הריאה השמאלית וכל גרורות פוטו-המרה עליה. לאחר מכן הריאה והגרורות נחשפות לאור כחול כדי לצלם את הנגעים החשופים. לאחר הפוטו-המרה, מסירים את ה-retractor, תופרים את הצלעות בחזרה זו לזו, והעור שמעל נסגר. לבסוף, אוויר עודף מוסר מחלל בית החזה כדי להקל על הלחץ על הריאות ולאפשר לעכבר לחדש נשימה עצמאית וספונטנית.
ניתן להתאים את הפרוטוקול המתואר כאן למספר חלבונים שונים הניתנים להמרה / פוטו-מתג. הקפדה על כך שתאים פוטו-מומרים יגיעו לשיא עוצמת הפלואורסצנטיות שלהם בערוץ שעבר פוטו-המרה יכולה להקל על זיהויים באיברים אחרים. התנאים הדרושים להשגת שיא עוצמת הפלואורסצנטיות לאחר פוטו-המרה צריכים להיקבע אמפירית, מכיוון שהם עשויים להשתנות עם היבטים אחרים של הניסוי כגון החלבון הניתן להמרה פוטו-המרה ועוצמת האור המשמש לפוטו-המרה. איור 2B,C מדגים כיצד עוצמת הפלואורסצנטיות השתנתה הן בערוצי FITC (לא פוטומרים) והן בערוצי TRITC (פוטו-המרה) כפונקציה של משך החשיפה לאור כחול בדגימת ex vivo. קבענו כי 6 דקות של חשיפה לאור כחול הפיקו את האות הבהיר ביותר בערוץ שעבר פוטו-המרה, וכי חשיפה נוספת הובילה להלבנה. לאחר מכן מדדנו את עוצמת הפלואורסצנטיות בשני הערוצים לפני ואחרי 6 דקות של חשיפה לאור כחול, in vivo, וקיבלנו תוצאות דומות (איור 2D).
לאחר מכן, המוח, הכבד והריאה הימנית שאינה פוטו-המרה נקצרו מעכברים שעברו את הניתוח הזה עם (קבוצת ניסוי) וללא (קבוצת ביקורת) מנורת הפוטו-המרה דולקת. הרקמות נוקו אופטית כפי שתואר קודם לכן31, הונחו בצלחת תחתית זכוכית, וצולמו במיקרוסקופ מולטיפוטון32 שנבנה במיוחד באמצעות עדשה אובייקטיבית 25x 1.0 NA ואורך גל עירור של 880 ננומטר. פלואורסצנטיות נלכדה עבור התעלות הירוקות והאדומות באמצעות מסנני הפסים 525/35 ננומטר ו-580/60 ננומטר, בהתאמה. תאים שעברו המרה ותאים שאינם פוטו-המרה יכולים להיות מזוהים בבירור בכל שלושת סוגי הרקמה מעכברים שעברו את הניתוח עם חשיפה לאור כחול (איור 3). כצפוי, רק תאי גידול שאינם פוטו-פוטומטורים נמצאו ברקמות של עכברים שעברו את הניתוח ללא חשיפה לאור כחול.
איור 1: סקירה כללית של הפרוטוקול הניתוחי לניתוח פוטו-המרה ריאתי. (A) עכבר מפורק שהונח על במת הניתוח והודבק במקומו. (B) ניקוי מעגלי בקוטר 10 מ"מ של העור והרקמה הרכה מעל כלוב הצלעות. (C) פריצה ראשונית של שריר בין-קוסטלי באמצעות מספריים מנתחים זעירים קהים. (D) מחזיר סגור המוכנס בחתך בין-קוסטלי בקוטר 10 מ"מ. (E) משחזר פתוח החושף רקמת ריאה. (F) מנורת פוטו-המרה במקומה ישירות מעל בית החזה הפתוח של העכבר. (G) תפר רציף פשוט המשלב את הצלע משני צידי החתך הבין-קוסטלי. (H) תפר מהודק ומאובטח כדי להחזיר את שלמות דופן בית החזה. (I) הוצאת אוויר מחלל בית החזה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: קביעת התנאים הדרושים להשגת עוצמת שיא פלואורסצנטית בערוץ שעבר פוטומירציה. (A) תמונות מייצגות של גרורות ריאה חשופות המבטאות Dendra2 לפני חשיפה לאור כחול בתאורת החדר ללא פילטרים ובהגדלה נמוכה (1) ובהגדלה גבוהה (2), והגדלה גבוהה בתעלות FITC (3) ו-TRITC עם תאורת שדה רחב (4). (B) תמונות פלואורסצנטיות של גרורות ריאה המבטאות Dendra2 לפני חשיפה לאור כחול, ולאחר 2 דקות, 4 דקות, 6 דקות ו-8 דקות של חשיפה לאור כחול, ex vivo. (C) עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת מנורמלת של גרורות ריאה מבטאות Dendra2 כפונקציה של משך החשיפה לאור כחול, ex vivo. (D) עוצמת פלואורסצנטיות מנורמלת ממוצעת של גרורות ריאה מבטאות Dendra2 לפני ואחרי 6 דקות של חשיפה לאור כחול, in vivo. מוטות קנה מידה = 2 מ"מ (A), 400 מיקרומטר (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונות מייצגות של תאים סרטניים שעברו פוטוהמרה (שורה עליונה) ותאים סרטניים שאינם פוטו-מומרים (שורה תחתונה) שנמצאו בריאה, במוח ובכבד של עכברים שעברו ניתוח פוטו-המרה. פסי קנה מידה = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים S1: מנורת מערך LED 400 ננומטר מותאמת אישית.(א) כבוי ו-(ב) מופעל. CF = מאוורר קירור, R = רפלקטור, LED = LED בהספק גבוה של 400 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול כירורגי להמרה סלקטיבית של תאי גידול בריאה. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לסמן באופן סלקטיבי תאים סרטניים בריאה ולעקוב אחר גורלם על ידי זיהויים מחדש בכל הגוף בנקודת זמן מאוחרת יותר, מה שמקל על חקר גרורות מגרורות ריאה. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן היה לדמיין תאים פוטו-מומרים במוח, בכבד ובריאה הימנית של עכברים שעברו את הניתוח עם פוטו-המרה, מה שמצביע על כך שתאים אלה חזרו מגרורות הריאה שהומרו לאתרים שלישוניים אלה. לא מצאנו תאים אדומים באיברים של עכברים שלא עברו פוטו-המרה, מה שמצביע על כך שאוטופלואורסצנטיות טבעית בתאים אינה בהירה מספיק כדי להתבלבל עם תאים סרטניים שהומרו לאור.
תשומת לב קפדנית להיבטים מסוימים של הניסוי יכולה להגדיל את שיעור ההצלחה של הליך זה. ראשית, בעת יצירת גרורות ריאה, יש לקחת בחשבון את הפרוטוקול ליצירת גרורות וחלבון הניתן להמרה / פוטו-החלפה. דווח כי חלק מהחלבונים הפלואורסצנטיים הם אימונוגניים 33,34,35,36. לפיכך, תאים סרטניים המבטאים חלבונים כאלה עשויים שלא לשלוח גרורות באופן ספונטני בעכברים בעלי יכולת חיסון. ואכן, ראינו כי גידולים ראשוניים נוצרים הן בעכברים סינגניים, בעלי יכולת חיסונית (FVB) והן בעכברים מדוכאי חיסון (Rag2-/-) לאחר הזרקה אורתוטופית של תאי 6DT1-Dendra2. עם זאת, גרורות התפתחו רק בעכברי Rag2-/, מה שמצביע על כך שדנדרה2 עשוי להיות אימונוגני במקצת. דרכים להתגבר על האימונוגניות הפוטנציאלית של חלבונים פלואורסצנטיים כדי ליצור גרורות ריאה כוללות שימוש בעכבר מדוכא חיסון, יצירת גרורות באמצעות הזרקת ורידים בזנב, שימוש בחלבון אחר הניתן להמרה / פוטו-החלפה, או שימוש בחיה טרנסגנית שבה החלבון הניתן להמרה / פוטו-החלפה מקודד גנטית כך שהעכברים נסבלים לחלבון37. יש לקחת בחשבון גם את חוזקו ויציבותו של האות הפלואורסצנטי בערוץ הפוטומר. עבור חלבונים רבים הניתנים להמרה / פוטו-סוויפ, האות בערוץ הפוטו-המרה פוחת עם הזמן כאשר החלבון מתפרק ומדולל עם חלוקת התא. אנו ואחרים הראינו בעבר כי Dendra2 מקושר H2B photoconvert יכול להיות מזוהה באופן אמין במשך 7 ימים בתאים מתחלקים ו 16 ימים בתאים שאינם מתחלקים38,39. קישור החלבון הניתן להמרה לחלבון עם קצב תחלופה נמוך יכול להאריך את מחצית החיים של האות המומר. שיטות לפתרון מודל גרורות הריאה חייבות להיות תלויות במטרת המחקר ובסוג התא הסרטני בו נעשה שימוש.
שנית, חשוב לתזמן את הניתוח כראוי בהתאם למודל המחלה המעניין. אלה שעובדים עם מודלים של מחלות עם גרורות ריאה הגדלות במהירות עשויים להיות בעלי מסגרת זמן מוגבלת לביצוע הניתוח לפני שהעכברים הופכים המומים מדי על ידי נטל הגידול כדי להתאושש מהניתוח ו / או לשרוד את פרק הזמן הרצוי לאחר הניתוח. הבנה מעמיקה של ציר הזמן של מודל המחלה, כמו גם השימוש באסטרטגיות הדמיה לא פולשניות כגון טומוגרפיה ממוחשבת מיקרו, עשויים לסייע בתזמון הליך זה.
שלישית, חיתוך לא מכוון של כלי דם מרכזיים במהלך הסרת רקמות רכות עלול לגרום לדימום יתר, המוביל לראות לקויה של שדה הניתוח ו / או exsanguination, כפי שתואר קודם40. הימנעות מכלי דם מרכזיים ושימוש בעט צרוב במהלך הניתוח יכולים למנוע זאת. רביעית, בעת הכנסה והסרה של המשליף, חשוב מאוד לשמור על להבי הנשלף מקבילים לדופן החזה בכל עת. הטיית הלהבים לכיוון הריאה מגבירה את הסיכון לנזק ריאתי, והפניית הלהבים לכיוון דופן החזה מגבירה את הסיכון לפריצת דופן החזה באזורים אחרים. אם החדרה או הסרה של המשליך באופן מקביל אינה נראית אפשרית, ניתן להשתמש במספריים הזעירים החותכים הקהים כדי להגדיל מעט את אורך החתך הבין-קוסטלי לפני שתנסה להחדיר/להסיר את המשליך שוב. לבסוף, יש להקפיד על כך שכלוב הצלעות נאטם מחדש לחלוטין בסוף הניתוח. כאשר תופרים את הצלעות בחזרה זו לזו, יש להתחיל בתפירה ~ 1 מ"מ לפני תחילת החתך ולהסתיים ~ 1 מ"מ אחרי. זה עוזר למנוע פתחים שיורית על קצות החתך. בנוסף, יש להקפיד למשוך ולקשור את התפר חזק מספיק כדי למנוע רווח בין הצלעות, אך לא חזק עד כדי כך שהתפרים יקרעו את השרירים הבין-קוסטליים הסמוכים וייצרו פרצות נוספות. אם לא ניתן להשיג איטום מחדש של חלל בית החזה, יש להקריב את העכבר באופן אנושי במהלך הניתוח, שכן הוא יתקשה מאוד או לא יוכל לנשום בכוחות עצמו כאשר האוורור המכני מופסק.
מקור האור והמתודולוגיה המדויקת להמרת פוטו עשויים להשתנות בין מעבדות. ניתן להשתמש בכל מקור אור ומתודולוגיות בטוחות, עקביות ומתאימות לדגם. לדוגמה, פוטו-המרה יכולה להתבצע על ידי העברת העכבר לסטריאוסקופ או למיקרוסקופ אחר המסוגל להאיר אור באורך הגל ובעוצמה הדרושים לפוטו-המרה על הריאה החשופה. אנו משתמשים במנורת מערך דיודות פולטת אור של 400 ננומטר שנבנתה במיוחד בעוצמתה הגבוהה ביותר כדי להמיר גרורות ריאה מבטאות Dendra2 בפוטו (איור משלים S1). כדי לתמוך במנורה שמעל העכבר ולוודא שהמנורה ממוקמת באותו מרחק מעל כל עכבר, חתכנו פתח בגודל 6.5 x 6.5 ס"מ בתחתית קופסת קרטון פתוחה (18.4 ס"מ (L) x 13.2 ס"מ (W) x 7.3 cm (H)). אנו מניחים את הקופסה הפוכה מעל העכבר ומניחים את המנורה בגודל 8.5 x 8.5 ס"מ מעל המגרעת בגודל 6.5 x 6.5 ס"מ (איור 1F), כך שהמנורה נתמכת, והאור הכחול יכול להגיע לרקמת הריאה החשופה.
חשוב לציין כי היבטים מסוימים של פרוטוקול זה, כולל ניתוח ושימוש בחומרי הרדמה, עשויים לשנות את קינטיקה ההפצה ואת היכולת של תאי הגידול 41,42,43,44. ככזה, יש להשתמש בבקרות נאותות כדי להבטיח שהתוצאות לא יתבלבלו על ידי הנוהל.
המגבלה העיקרית של טכניקה זו היא שרק גרורות בחלק החשוף של הריאה יעברו פוטו-המרה. לכן, לא כל תא סרטני שיוצא מהריאה יעבור פוטומיור וכל כימות של תאים מדומים יהיה יחסי. למרות מגבלה זו, טכניקה זו עדיין יכולה לספק תובנה חשובה לגבי הפצה מחדש של תאי גידול, כולל קביעה אם ומתי זה קורה, מה מקדם או מונע את זה, ואת organotropism של תאים redisseminated. למיטב ידיעתנו, זוהי הטכניקה הראשונה המאפשרת סימון סלקטיבי ומעקב אחר גורלם של תאי הגידול בריאה. לסיכום, פרוטוקול זה מתאר טכניקה חדשנית שניתן להשתמש בה כדי להקל ולשפר את המחקר של הפצה מחדש של תאי גידול וזריעת גרורות לגרורות ללא ניתוח גנומי. התמקדות בגרורות ריאה הופכת את ההליך לשימושי ורלוונטי לחוקרי גרורות החוקרים את רוב סוגי הסרטן העיקריים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לווייד קובה על עזרתו בטומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (S10RR029545), ורה דסמארה והילרי גוזיק ממתקן הדימות האנליטי על הכשרתן ועזרתן במיקרוסקופיה, מרכז הסרטן ע"ש איינשטיין מונטיפיורי, המכון הלאומי לסרטן (P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), מרכז גרוס ליפר ביופוטוניקה, תוכנית הדימות המשולבת לחקר הסרטן, מלגת סר הנרי וולקום לפוסט-דוקטורט (221647/Z/20/Z), ופרס METAvivor לפיתוח קריירה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0-30 V, 0-3 A Power Supply | MPJA | 9616 PS | |
| 12 VDC, 1.2 A Unregulated Plug Supply | MPJA | 17563 PD | |
| 28 G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | |
| 400 nm light emitting diode array lamp | LedEngin Inc. | 897-LZPD0UA00 | Photoconversion lamp, custom-built (individual parts included below) |
| 5-0 braided silk suture with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic used in drinking water |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | Analgesic |
| Cables (Cable Assemblies) 2.5 JK-ST 72" ZIP CD | Mouser | 172-0250 | |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Micro Dissecting Scissors |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | Used during mouse intubation |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| High power LEDs - single color ultraviolet 90 watts | Mouser | LZP-D0UA00 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Isoflurane SOL 250 mL PVL | Covetrus | 29405 | Anesthetic |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| LED Lighting Reflectors CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PIN | Mouser | 928-C11395TM | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron up to 3.4GHz / Ball Bearing / Copper Core / CPU Cooling Fan | CompUSA | #S457-1023 | |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Micro Dissecting Scissors |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory cream |
| Personnet mini retractor | Roboz | RS-6504 | Retractor |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W | Addgene | 51005 | Dendra2 lentivirus |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA - Black | Mouser | 565-1440-48-0 | |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA - Red | Mouser | 565-1440-48-2 | |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Wound closing system veterinary kit | Clay Adams | IN015 | Veterinary surgical stapling kit |
References
- Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer Medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
- Gupta, G. P., Massagué, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Reviews. Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, T., et al. Self-seeding circulating tumor cells promote the proliferation and metastasis of human osteosarcoma by upregulating interleukin-8. Cell Death & Disease. 10 (8), 575 (2019).
- Liu, H., et al. Tumor-derived exosomes promote tumor self-seeding in hepatocellular carcinoma by transferring miRNA-25-5p to enhance cell motility. Oncogene. 37 (36), 4964-4978 (2018).
- Kim, M. -Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Zhang, Y., et al. Tumor self-seeding by circulating tumor cells in nude mouse models of human osteosarcoma and a preliminary study of its mechanisms. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 140 (2), 329-340 (2014).
- Dondossola, E., Crippa, L., Colombo, B., Ferrero, E., Corti, A. Chromogranin A regulates tumor self-seeding and dissemination. Cancer Research. 72 (2), 449-459 (2012).
- Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Coste, A., et al. Hematogenous dissemination of breast cancer cells from lymph nodes is mediated by tumor microenvironment of metastasis doorways. Frontiers in Oncology. 10, 571100 (2020).
- Borriello, L., Condeelis, J., Entenberg, D., Oktay, M. H. Breast cancer cell re-dissemination from lung metastases-a mechanism for enhancing metastatic burden. Journal of Clinical Medicine. 10 (11), 2340 (2021).
- Ullah, I., et al. Evolutionary history of metastatic breast cancer reveals minimal seeding from axillary lymph nodes. The Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1355-1370 (2018).
- Gundem, G., et al. The evolutionary history of lethal metastatic prostate cancer. Nature. 520 (7547), 353-357 (2015).
- Brown, D., et al. Phylogenetic analysis of metastatic progression in breast cancer using somatic mutations and copy number aberrations. Nature Communications. 8, 14944 (2017).
- Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. Rapidly evolving homing CRISPR barcodes. Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).
- Kalhor, R., et al. Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR. Science. 361 (6405), eaat9804 (2018).
- McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), aaf7907 (2016).
- Junker, J. P., et al. Massively parallel clonal analysis using CRISPR/Cas9 induced genetic scars. bioRxiv. , 056499 (2017).
- Zhang, W., et al. The bone microenvironment invigorates metastatic seeds for further dissemination. Cell. 184 (9), 2471.e20-2486.e20 (2021).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Grau, N., et al. Spatiotemporally controlled induction of gene expression in vivo allows tracking the fate of tumor cells that traffic through the lymphatics. International Journal of Cancer. 147 (4), 1190-1198 (2020).
- Riihimäki, M., Thomsen, H., Sundquist, K., Sundquist, J., Hemminki, K.
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Zhang, G. -L., Zhang, Y., Cao, K. -X., Wang, X. -M. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mice mammary fat pad. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
- Pavese, J., Ogden, I. M., Bergan, R. C. An orthotopic murine model of human prostate cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological analysis of lung metastasis following lateral tail-vein injection of tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (159), (2020).
- Das, S., MacDonald, K., Sucie Chang, h-y, Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Hsu, C. -W., et al. EZ Clear for simple, rapid, and robust mouse whole organ clearing. eLife. 11, e77419 (2022).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Gambotto, A., et al. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope. Gene Therapy. 7 (23), 2036-2040 (2000).
- Han, W. G. H., Unger, W. W. J., Wauben, M. H. M. Identification of the immunodominant CTL epitope of EGFP in C57BL/6 mice. Gene Therapy. 15 (9), 700-701 (2008).
- Stripecke, R., et al. Immune response to green fluorescent protein: implications for gene therapy. Gene Therapy. 6 (7), 1305-1312 (1999).
- Rosenzweig, M., et al. Induction of cytotoxic T lymphocyte and antibody responses to enhanced green fluorescent protein following transplantation of transduced CD34(+) hematopoietic cells. Blood. 97 (7), 1951-1959 (2001).
- Grzelak, C. A., et al. Elimination of fluorescent protein immunogenicity permits modeling of metastasis in immune-competent settings. Cancer Cell. 40 (1), 1-2 (2022).
- Fluegen, G., et al. Phenotypic heterogeneity of disseminated tumour cells is preset by primary tumour hypoxic microenvironments. Nature Cell Biology. 19 (2), 120-132 (2017).
- Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903.e14-1914.e14 (2019).
- Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A permanent window for investigating cancer metastasis to the lung. Journal of Visualized Experiments. (173), (2021).
- Tohme, S., Simmons, R. L., Tsung, A. Surgery for cancer: a trigger for metastases. Cancer Research. 77 (7), 1548-1552 (2017).
- Al-Sahaf, O., Wang, J. H., Browne, T. J., Cotter, T. G., Redmond, H. P. Surgical injury enhances the expression of genes that mediate breast cancer metastasis to the lung. Annals of Surgery. 252 (6), 1037-1043 (2010).
- Lu, N., Piao, M. -H., Feng, C. -S., Yuan, Y. Isoflurane promotes epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis of bladder cancer cells through HIF-1α-β-catenin/Notch1 pathways. Life Sciences. 258, 118154 (2020).
- Jiao, B., et al. Relationship between volatile anesthetics and tumor progression: unveiling the mystery. Current Medical Science. 38 (6), 962-967 (2018).
