Summary
Her presenterer vi en metode for å identifisere forbindelser som modulerer ADCC-mekanismen, en viktig kreftcelledrepende mekanisme for antitumorantistoffer. Den cytotoksiske effekten av NK-celler måles i brystkreftcellesfæroider i nærvær av trastuzumab. Bildeanalyse identifiserer levende og døde morder- og målceller i sfæroider.
Abstract
Monoklonal antistoffbasert immunterapi rettet mot tumorantigener er nå en bærebjelke i kreftbehandling. En av de klinisk relevante virkningsmekanismene til antistoffene er antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC), hvor antistoffet binder seg til kreftcellene og engasjerer den cellulære komponenten i immunsystemet, f.eks. naturlige dreperceller (NK), for å drepe tumorcellene. Effektiviteten av disse terapiene kan forbedres ved å identifisere adjuvante forbindelser som øker følsomheten til kreftcellene eller immuncellens styrke. I tillegg kan uoppdagede legemiddelinteraksjoner hos kreftpasienter medmedisinert for tidligere forhold eller kreftassosierte symptomer bestemme suksessen til antistoffbehandlingen; Derfor må slike uønskede legemiddelinteraksjoner elimineres. Med disse målene i tankene opprettet vi en kreft-ADCC-modell og beskriver her en enkel protokoll for å finne ADCC-modulerende legemidler. Siden 3D-modeller som kreftcelle sfæroider er overlegne 2D-kulturer i å forutsi in vivo-responser av svulster til kreftbehandlinger, sfæroide samkulturer av EGFP-uttrykkende HER2 + JIMT-1 brystkreftceller og NK92. CD16-cellelinjer ble satt opp og indusert med trastuzumab, et monoklonalt antistoff klinisk godkjent mot HER2-positiv brystkreft. JIMT-1 sfæroider fikk lov til å dannes i celleavvisende U-bunn 96-brønnplater. Dag 3 ble NK-celler og trastuzumab lagt til. Sfæroidene ble deretter farget med vedlegg V-Alexa 647 for å måle apoptotisk celledød, som ble kvantifisert i den perifere sonen til sfæroidene med et automatisert mikroskop. Anvendeligheten av vår analyse for å identifisere ADCC-modulerende molekyler er demonstrert ved å vise at Sunitinib, en reseptortyrosinkinasehemmer godkjent av FDA mot metastatisk kreft, nesten helt avskaffer ADCC. Genereringen av sfæroider og bildeinnsamlings- og analyserørledninger er kompatible med høy gjennomstrømningsscreening for ADCC-modulerende forbindelser i kreftcellesfæroider.
Introduction
Multicellulære tumorsfæroider (MCTS) er mye brukte tredimensjonale (3D) modeller som dannes på grunn av tendensen til adherente celler til å aggregere og representerer et viktig verktøy for å få mekanistisk innsikt i kreftcellebiologi. De kan genereres fra et bredt spekter av celletyper ved hjelp av en rekke teknikker, for eksempel væskebaserte og stillasbaserte 3D-kulturer1. Deres største fordel i forhold til monolayer 2D-modeller er at de rekapitulerer hovedtrekkene til in vivo-svulster , nemlig strukturell organisasjon og hypoksi, ved å etterligne den biologiske oppførselen til tumorceller, spesielt mekanismene som fører til terapeutisk rømning og stoffresistens2. Siden MCTS kan forbedre forutsigbarheten av toksisitet og legemiddelfølsomhet, er de mye brukt til å studere kreft i 3D og kan forbedre utviklingen av effektive medisiner for ulike typer kreft3.
For å studere noen sykdom er det et kritisk behov for relevante og praktiske modeller. Å sette opp modeller for kreftimmunologistudier er utfordrende fordi immunsystemet består av flere celletyper. Hver celletype har flere undertyper og et bredt spekter av aktiveringstilstander. Disse forskjellige immuncelletypene samhandler med kreftceller og andre tumorkomponenter, og påvirker til slutt utfallet av sykdommen. 2D in vitro cellekulturmetoder klarer ikke å rekapitulere disse komplekse cellulære interaksjonene, da de mangler oversettbarhet og ikke er i stand til å forutsi virkningen av et legemiddel på systemnivå (f.eks. i vev)4,5. Videre har musemodeller også alvorlige begrensninger på grunn av de grunnleggende forskjellene mellom menneskets og murine immunsystem. 3D-kultursystemer kan derfor fylle de nåværende hullene i tilgjengelige modeller, gi en alternativ metode og forbedre vår forståelse av kreftimmunologi6. Spesielt kan sfæroidmodeller brukes til å teste immunterapier, hovedsakelig for å vurdere effektiviteten av legemiddelscreening og terapeutiske antistoffer for å øke immuncelleinfiltrasjon og antitumorale effekter mot sfæroidmålene7. Videre har potensialet til MCTS sammensatt av celler i forskjellige metabolske og proliferative tilstander for å studere interaksjonene mellom stromaceller (f.eks. lymfocytter, makrofager, fibroblaster) og kreftceller og for utvikling av nye anticancerstrategier blitt rikelig demonstrert8. Derfor er det et viktig behov for å bekrefte prediktive og nøyaktige plattformer for å øke stofftestingsprosessen, med tanke på patofysiologien til tumormikromiljøet.
Brystkreft (BC) er den hyppigste kreftdiagnosen over hele verden hos kvinner. Den kliniske klassifiseringen av denne heterogene sykdommen er basert på tilstedeværelsen av transmembranreseptorer, f.eks. østrogen (ER) og progesteron (PR) reseptorer (kollektivt kalt hormonreseptorer, HR) sammen med overekspresjon eller amplifisering av det humane epidermale vekstfaktorreseptor 2 (HER2) proteinet / onkogenet. Basert på immunhistokjemisk ekspresjon av disse reseptorene, er fire subtyper ofte anerkjent: luminal A (HR + / HER2-), luminal B (HR + / HER2 +), HER2-positiv (HR-/HER2 +) og trippel-negativ brystkreft (HR-/HER2-). HER2 + -gruppen utgjør 10-15% av BC-tilfellene og er preget av høyt HER2-uttrykk med fravær av ER og PR, har en dårligere prognose sammenlignet med luminale svulster, og krever spesifikke legemidler rettet mot HER2 / neu-proteinet9.
BC-utvikling er en multi-trinns prosess, og en tidlig diagnose er avgjørende for en vellykket behandling av sykdommen10. Til tross for nylig oppstått personlige BC-behandlingsalternativer (f.eks. Endokrine og anti-HER2 antistoffbehandlinger), fortsetter BC å utfordre onkologer. Akkurat som kirurgi, kjemoterapi og strålebehandling, kan disse personlige terapiene også ha alvorlige bivirkninger, og pasienter kan utvikle motstand mot disse midlene, noe som gjør det til en langsiktig utfordring å bestemme den beste strategien11,12. Derfor er forbedret forståelse av samspillet mellom svulsten og dens mikromiljø viktig og forventes å gi nye retninger for utvikling av nye behandlinger som tar hensyn til spesifisitetene til de forskjellige BC-subtypene13. En ny bølge av immunterapier, som antistoffmedikamentkonjugater, adoptive T-celleterapier, vaksiner og nye HER2-rettede monoklonale antistoffer (mAbs) blir studert i en bred populasjon av pasienter med HER2-uttrykkende svulster14.
Trastuzumab representerer for eksempel en effektiv behandlingsmodalitet for HER2+ BC. Som en del av virkemåten medierer trastuzumab fragmentkrystalliserbar gammareseptor (FcγR)-avhengige aktiviteter. FcγRs utmerker seg ved deres affinitet for Fc-fragmentet og immunresponsen de initierer. Aktivering av FcγRIIIa (CD16A) på naturlige dreperceller (NK) er avgjørende for å formidle antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC), mens utløsing av FcγRIIa (CD32A) og FcγRIIIa på makrofager induserer antistoffavhengig cellulær fagocytose (ADCP)15. Studier på dyremodeller viste at mus som manglet FcγRI (CD64) og FcγRIII (CD16) reseptorer ikke var i stand til å initiere beskyttende immunresponser mot tumorspesifikke antigener, noe som avslørte at ADCC sannsynligvis er en viktig virkningsmekanisme for mAb trastuzumab16.
Siden NK-celler tyr til tumorcellebundet Abs for kreftcelledrap ved ADCC, er ekspresjon av Fc-reseptorer avgjørende for effektiv behandling med trastuzumab17 (figur 1). Videre er deres virkning effektivt balansert av en stimulering av aktiverende og hemmende reseptorer, for eksempel Killer-celle immunoglobulinlignende (KIR) reseptorer18.
Figur 1. Mekanisme for ADCC i sammenheng med en antitumorrespons. Fcγ-reseptoren til en naturlig drepercelle (NK) gjenkjenner Fc-regionen av et antistoff, som tidligere hadde bundet seg til et overflateantigen på en kreftcelle. Denne immunologiske synapsen fører til degranulering av NK-cellen som frigjør cytotoksiske mediatorer som granzymer og perforin. Disse molekylene bidrar til poredannelse i cellemembranen og aktiverer apoptotiske veier som forårsaker programmert celledød av målcellen (bilde opprettet med Biorender.com). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Immunterapiutvikling for HER2+ BC representerer et felt i utvikling. I dette tilfellet bør man vurdere interaksjoner mellom ulike komponenter i immunsystemet. Videre har tidligere publikasjoner omfattende testet kombinasjonsterapier som involverer alle typer tradisjonelle, immun- eller celleterapier for å identifisere synergiserende kombinasjoner19.
Flere 3D-modeller av HER2+ BC har tidligere blitt brukt til oppdagelse av legemidler. For eksempel brukte Balalaeva et al. SKBR-3 sfæroider som overuttrykker HER2 for å vurdere cytotoksisiteten til det HER2-målrettede immuntoksinet 4D5scFv-PE4020. I en annen studie ble et 3D Matrigel-basert HER2 + BC-kultursystem etablert for å måle cellevekst som respons på trastuzumab og endokrine midler21. Disse studiene fremhever viktigheten av tumorsfæroidmodeller av HER2 som overuttrykker kreftceller i å representere en effektiv strategi for klinisk å forbedre terapeutiske responser22.
Vår gruppe identifiserte tidligere Sunitinib, en multimålrettet tyrosinkinasehemmer, som en hemmer av trastuzumabavhengig ADCC i JIMT-1 HER2+ BC-celler i en 2D-kulturanalyse. Studien viste at Sunitinib induserer autofagi og svekker NK-cellenes drapsfunksjon, nedregulerer HER2-uttrykk og forbedrer overflatefeste av JIMT-1-celler17.
Her etablerte vi en ny 3D, sfæroid ADCC-modell (NK.92.CD16+Trastuzumab+JIMT-1-EGFP kreftceller) som skulle brukes til screeningapplikasjoner med høy gjennomstrømning, og for å validere de ovennevnte funnene ble Sunitinib brukt som modellforbindelse. Først genererte vi EGFP som uttrykker JIMT-1-celler17 og vokste sfæroider fra disse cellene. ADCC ble indusert av NK-celler sammen med trastuzumab, og sfæroider ble holdt i kultur i nærvær eller fravær av testforbindelser i 24 timer (figur 2). Kvantifisering av ADCC er basert på påvisning av apoptotisk kreftcelledød (Annexin V-farging) ved hjelp av et analysesystem med høyt innhold.
Figur 2. ADCC i et 3D sfæroid samkultursystem. Våre eksperimentelle innstillinger er basert på et 3D sfæroidsystem som mer nøyaktig kan modellere in vivo mikromiljøet sammenlignet med 2D-modeller. JIMT-1 EGFP brystkreftceller ble sådd på en konkav celleavstøtende bunn for å danne en rundformet cellulær klynge, kalt sfæroid. ADCC ble deretter initiert ved å legge til NK92. CD16 naturlige dreperceller (E:T-forhold = 20:1) og et anti-HER2 monoklonalt antistoff, trastuzumab. Den eksperimentelle modellen har vist seg effektiv og lett anvendelig for identifisering av ADCC-modifiserende testforbindelser (bilde laget med Biorender.com). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Vi demonstrerte at innsamling av data på denne måten kan gjøres i sanntid og er statistisk robust for bruk i screening med høyt innhold i kreftmedisinoppdagelse. Det er viktig at denne modellen tillater en utvidet validering av et større sett med forbindelser, og den kan brukes på flere analyser av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sette opp JIMT-1-forbedret fluorescerende protein (EGFP) sfæroidmodell
- For å danne en U-formet celleavvisende bunn, belegg 96-brønnsplaten med 0,5% agarose-PBS-løsning (30 μL / brønn). Inkuber platen ved romtemperatur i ca. 30-45 min.
- Vask JIMT-1-EGFP-cellene to ganger med 2 ml steril PBS (generering av JIMT1-EGFP-cellelinje ble rapportert i en tidligere publikasjon17). Bruk T25 vevskulturflasker og JIMT-1-medier (DMEM/F-12 medium supplert med 20 % føtalt bovint serum (FBS), 0,3 U/ml insulin (100 IE/ml, Humulin R) og 1 % penicillin-streptomycin) til cellekultur.
- Tilsett 2 ml trypsin-EDTA til kolben og inkuber den i 10 minutter i en CO2 -inkubator.
- Trykk på kolben for å sjekke om JIMT-1-celler løsnet etter inkubasjonstiden.
- Bruk 2 ml JIMT-1 medium for å stoppe fordøyelsen og samle cellesuspensjonen i en 15 ml slange.
- Tell cellene i et Bürker-kammer med 0,4 % trypanblå (80 μL av fargestoffet + 20 μL av cellesuspensjonen) og juster celletallet til 20 000 celler/ml.
- Pipette 100 μL av cellesuspensjonen (2000 celler/brønn) til hver brønn i 96-brønnplaten (forhåndsbelagt med 0,5 % agarose-PBS-oppløsning som angitt i 1,1).
- La cellene klumpe seg sammen i løpet av en 3-dagers inkubasjonstid ved 37 °C i en CO2 -inkubator.
- Kontroller regelmessig størrelsen og formen på sfæroider med et omvendt mikroskop.
2. Belegg på HCS-platen
MERK: For å forhindre festing av JIMT-1-EGFP sfæroider til glassoverflaten på platen, er det avgjørende å belegge HCS-platen (High Content Screening) (ellers ville analyse med høyt innhold ikke være mulig).
- På dag 3 etter induksjon av sfæroider, belegg 96-brønns høyinnhold screeningplate med Pluronic-F127 (0,5% i DMSO, 50 μL / brønn) og inkuber platen i 45 minutter ved romtemperatur.
- Aspirer belegningsoppløsningen og vask brønnene to ganger med DMEM/F-12-serumfritt medium (100 μL/brønn).
3. Overføring av sfæroider til HCS-platen
- Bruk en 1 ml pipette, overfør sfæroidene i triplikater til glassbunnen 96-brønns HCS-plate.
4. Forbehandling av JIMT-1 EGFP sfæroider med testforbindelser
- Legg til testforbindelsen (f.eks. Sunitinib fortynnet i DMSO i en konsentrasjon på 40 μM) ved å pipetere 10 μL/brønn og tilsett 10 μL ferskt JIMT-1-medium til kontrollbrønnene (CTL).
- Inkuber platen i 1 time i en CO2 -inkubator ved 37 ° C.
5. Induksjon av ADCC ved å legge til effektorcellene
CD16.176V.NK92-celler (heretter kalt NK-celler) ble dyrket i α-MEM supplert med 20 % FBS, 1 % MEM-NEAA, 1 % Na-pyruvat, 1 % glutamin, 1 % penicillin-streptomycin og 100 IE/ml IL-2.
- Samle NK-cellene i kolben i et 15 ml rør. Tell cellene med trypanblå (80 μL av fargestoffet + 20 μL av cellesuspensjonen) og juster celletettheten til 20: 1 effektor-til-mål (E: T) forhold (40.000 NK-celler / brønn).
- Beis NK-cellene med 10 μM Cell Tracker Blue (CTB, 1 μL i 1 ml α-MEM NK-medium) og plasser dem i en CO2 -inkubator ved 37 °C i 1 time.
- Sentrifuger NK-cellene ved 150 x g i 3 minutter ved romtemperatur to ganger for å vaske overskuddet av fargestoffet med 1 ml α-MEM-medium.
- Samle NK-cellepelleten på nytt i 1 ml ferskt JIMT-1 medium.
- Legg til de fargede NK-cellene sammen med anti-HER2-antistoffet (Ab) (trastuzumab, oppløst i steril destillert H2O) til målet JIMT-1 sfæroider ved å pipetere 55 μL / brønn av CTB-fargede NK-celler og 55 μL / brønn på 10 μg / ml Ab i JIMT-1 medium (totalt behandlingsvolum tilsatt for ADCC er 110 μL / brønn og den endelige Sunitinib-konsentrasjonen er 20 μM).
MERK: For valg av Ab-konsentrasjon og E:T-ratio støttet vi oss på vår forrige publikasjon17. Foreløpige eksperimenter ble utført med forskjellige E:T-forhold og konsentrasjoner av trastuzumab for å vurdere hvilken som var mest effektiv for å indusere ADCC i sfæroider (tilleggsfigur S1). - Tilsett 110 μL/brønn av ferske JIMT-1 medium for å kontrollere (CTL) brønner.
- Inkuber platen i 24 timer i en CO2 -inkubator ved 37 ° C.
MERK: Siden NK92-celler er kjent for å utøve uspesifikke cytotoksiske funksjoner, kan JIMT-1-celler for kontroll inkuberes sammen med begge NK-cellene alene og med en isotypekontroll eller en F(ab')2 Ab. Her ble F(ab')2-trastuzumab (TR-F(ab')2) brukt som negativ CTL. TR-F(ab')2-fragmentet ble fremstilt som rapportert av Tóth et al.19 og tilsatt i samme volum som trastuzumab sammen med NK-celler som beskrevet i 5.5. Konsentrasjonen ble justert til 6,6 μg/ml, tilsvarende en ekvimolær konsentrasjon med trastuzumab23.
6. Vedlegg V-647 farging av sfæroider
- For å måle apoptotisk celledød, flekker sfæroidene med Annexin V-Alexa Fluor 647-konjugat i 1 time i JIMT-1-medium (1:100) ved pipettering 50 μL / brønn.
7. Bildebehandling
MERK: Platen er avbildet ved 24 timer etter tilsetning av NK-effektorcellene til målcellene. For bildebehandling brukes en High-Content Analyzer og en bildeanalyseprogramvare.
- Velg typen mikroplate fra listen over plater ved hjelp av Platetype-alternativet . Bruk 96-brønns High-Content Screening (HCS) plate.
- Velg Two Peak autofokus ettersom analysen utføres i plater med 10x objektiv med 0,3 numerisk blenderåpning (NA), ved hjelp av henholdsvis autofokus og objektiv . Velg konfokalmodus med alternativet Opt. Mode og bruk Binning 2 ved å bruke Binning-alternativet .
- For bildesfæroider velger du de aktuelle kanalene ved hjelp av alternativet Kanalvalg . For å oppdage de EGFP-transduserte JIMT-1-cellene, velg EGFP (integrasjonstid 200 ms, lasereffekt 50 %, stabelhøyde 2,0 μm; f.eks. 488 nm em: 500-550 nm), og for å oppdage apoptotiske celler bruk Alexa 647 (integrasjonstid 100 ms, lasereffekt 50 %, stabelhøyde 10,0 μm; f.eks. 640 nm em: 650-760 nm). For å visualisere NK-cellene i sfæroidene, velg følgende kanal: DAPI (integrasjonstid 100 ms, lasereffekt 50%, stabelhøyde 2,0 μm; f.eks: 405 nm em: 435-480 nm).
- I alternativet Layoutvalg velger du Z-stabler siden celler i sfæroidene har en tendens til å være på forskjellige fokalplan i mikroskopet. 10 plan (med avstand på 10 μm) er tilstrekkelig til å dekke hele sfæroidområdet. Sett verdiene for det første planet og det siste planet til henholdsvis 0 μm og 90 μm.
MERK: Før du starter målingen, kan prøvebilder tas med øyeblikksbildefunksjonen for å kontrollere de riktige innstillingene. - Angi antall brønner og felt for avbildning ved hjelp av alternativet Definer oppsett .
8. Analyse med høyt innhold (HCA)
MERK: Analyser bildene med Harmony-programvaren, eller eksporter bilder for analyse ved hjelp av en foretrukket tredjepartsprogramvare. For analyse av ADCC-effektivitet måles fluorescensintensiteten til vedlegg V 647. Målceller drept av ADCC vises i det perifere området av sfæroidene. Derfor måles Annexin V-positive celler i denne sfæroide "ringen". For å validere denne metoden ble det utført analyser med ulike parametere for å vurdere hvilken som var mest pålitelig og ga best resultat (tilleggsfigur S2). En ADCC-brønn vises i videoen for å demonstrere bildeanalyseprosessen trinn for trinn.
- Identifiser sfæroidene ved EGFP-fluorescensen til JIMT-1-celler ved å bruke alternativet Finn teksturregioner og filtrer dem ut etter størrelse (> 25 000 μm2).
- Fjern kantlinjeobjekter ved hjelp av alternativet Velg populasjon .
- Siden Annexin V positive (apoptotiske) celler vises i periferien av sfæroider, måles anneksinintensiteten i denne apoptotiske 'Ring', valgt av Select Region-alternativet (ytre grense -90%) for å bestemme apoptotisk celledød.
- Uttrykk intensitetsverdier for vedlegg V som gjennomsnittlig intensitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EGFP som uttrykker JIMT-1-celler ble generert, og sfæroider ble dyrket fra disse cellene. Sunitinib ble brukt som testforbindelse da det tidligere var vist å påvirke forløpet av ADCC17. Sfæroider fikk lov til å klumpe seg i 72 timer. Dag 3 ble 10 μg/ml trastuzumab (eller ekvimolære 6,6 μg/ml TR-F(ab')219) og NK-celler (20:1) tilsatt sfæroidene i nærvær eller fravær av 20 μM sunitinib (1 time forbehandling), i en total tid på 24 timer. JIMT-1 alene og JIMT-1 co-inkubert med NK-celler (20:1) ble brukt som CTL. Sfæroider ble farget med vedlegg V 647 i 1 time for å påvise apoptotisk celledød og ble deretter avbildet med en High-Content Analyzer.
Som indikert ved Annexin V-farging, forårsaket tilsetning av NK-celler sammen med trastuzumab til JIMT-1-cellene celledød i tumorsfæroidene. Anneksinpositive (apoptotiske) celler dukket opp i den perifere sonen av sfæroidene som synlige i figur 3A. På den annen side resulterte ikke tilsetning av NK-celler alene i tumorcelleapoptose. For å skille mellom trastuzumabs evne til å rekruttere ADCC og dens direkte biologiske effekt, ble TR-F(ab')2 manglende funksjonell FcR-bindingsevne brukt som negativ kontroll av trastuzumab. Siden TR-F(ab')2 ble vist å være ineffektiv i denne modellen (figur 3B), er effekten sannsynligvis mediert via ADCC. Videre reduserte forbehandling med Sunitinib Annexin V-farging i sfæroidene, bekreftet Sunitinib-indusert ADCC-resistens og avslørte forebygging av apoptotisk celledød i JIMT-1 sfæroider samtidig inkubert med NK-celler og trastuzumab.
Figur 3. Deteksjon av ADCC-effektorforbindelser i en 3D sfæroidmodell. Tumor sfæroider ble generert med JIMT-1-EGFP celler. Etter en inkubasjonstid på 3 dager ble sfæroider overført til en HCS-plate, tidligere belagt med Pluronic F-127 for å forhindre cellefeste. Neste dag ble 10 μg/ml trastuzumab (TR) (eller ekvimolær 6,6 μg/ml TR-F(ab')2 som negativ CTL) og NK92. CD16-celler (forhåndsfarget med Cell Tracker Blue) ble tilsatt brønnene (E:T-forhold på 20:1), i fravær eller tilstedeværelse av 20 μM Sunitinib (SUN). JIMT-1 sfæroider alene og JIMT-1 sfæroider co-inkubert med NK-celler (20: 1) ble brukt som CTL. (A) Etter en inkubasjonstid på 24 timer ble vedlegg V 647 (rød farge) brukt til å farge sfæroidene i 1 time for å visualisere apoptotiske celler. (B) Bilder av 3 sfæroider/tilstand ble tatt og analysert for fluorescensintensiteten til vedlegg V 647 i det perifere området av sfæroidene (ringregionen). Histogram viser 4 uavhengige eksperimenter (means±SEM). Data ble analysert med Kruskal-Wallis-test etterfulgt av Dunns post-hoc-test (*p < 0,05, #p < 0,05, ns: ikke signifikant). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Disse dataene bekrefter at Sunitinib hemmer ADCC. ADCC-forsterkende forbindelser forventes å bli identifisert på lignende måte. Oppsummert kan vår HCS-analyse være egnet for identifisering av forbindelser som påvirker ADCC.
Tilleggsfigur S1. Optimalisering av E:T-ratio og trastuzumabkonsentrasjon. JIMT-1-EGFP-celler ble brukt til å generere sfæroider. Dag 3 ble sfæroider overført til en HCS-plate og NK-celler ble tilsatt ved forskjellige E:T-forhold (20:1, 40:1 og 60:1) med 10, 20 og 50 μg/ml trastuzumab (TR) for å se hvilken som var den mest effektive behandlingen som kunne indusere celledød i sfæroidene. Kontroll (JIMT-1-EGFP) ble behandlet med JIMT-1 cellekulturmedier. (A) Etter 24 timer ble celler farget med vedlegg V 647 (rød farge) i 1 time og apoptotisk celledød ble målt med HCA. Histogrammer viser 3 uavhengige eksperimenter (means±SEM). Søylene representerer intensiteten til vedlegg V 647 rundt JIMT-1 sfæroider. (B) Bilder av 3 sfæroider/tilstand ble analysert for Annexin V 647 intensiteten i ringregionen. Data ble analysert ved hjelp av enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys post-hoc-test (*p < 0,05, **p < 0,01, ns: ikke signifikant). Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S2. Evaluering av JIMT-1 celleapoptose i sfæroidene. JIMT-1-EGFP-celler ble brukt til å generere sfæroider. Dag 3 ble sfæroider overført til HCS-plate og forbehandlet med 20 μM sunitinib (SUN) i 1 time, deretter ble NK-celler tilsatt ved 20:1 E:T-ratio med 10 μg/ml trastuzumab. Etter 24 timer ble cellene farget med vedlegg V 647 i 1 time og apoptotisk celledød ble målt med HCA. Bilder av 3 sfæroider/tilstand ble analysert for Annexin V 647-intensiteten (kontroll: JIMT-1-EGFP, ADCC: 20:1 NK-celler+10 μg/ml trastuzumab, ADCC+SUN: 20 μM Sunitinib+20:1 NK-celler+10 μg/ml trastuzumab). Søylene representerer intensiteten til vedlegg V 647 rundt JIMT-1 sfæroider (ring) (A), i hele sfæroiden (B) og i hele brønnen (C). Histogrammer viser 3 uavhengige eksperimenter (means±SEM). Data ble analysert ved hjelp av enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys post-hoc-test (*p < 0,05, **p < 0,01, ns: ikke signifikant). Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Til tross for betydelige forbedringer i behandling av BC de siste tiårene, utvikler pasienter fortsatt regelmessig medisineringsresistens eller opplever negative bivirkninger24. Den høye morbiditeten og dødeligheten knyttet til BC krever en kontinuerlig undersøkelse av de underliggende molekylære mekanismene, akkurat som robuste screeningplattformer for å identifisere nye molekyler som kan brukes til terapeutisk utvikling25. Disse strategiene krever cellekulturbaserte translasjonsanalyser. 3D-tumorkultursystemer, som sfæroider og tumororganoider, har nylig dukket opp som billige, enkle å implementere modeller som representerer viktige aspekter ved tumorpatofysiologi nærmere enn konvensjonelle monolagskulturer. En av disse funksjonene er det romlig koordinerte samspillet mellom ulike tumorassosierte immunceller og kreftceller. Dette gjør 3D-samkulturmodeller til overlegne verktøy for medikamentscreening rettet mot modulatorer som virker på immunceller for å behandle maligniteter26.
I dette arbeidet har vi introdusert en ny sfæroidmodell for NK-cellemediert trastuzumab-avhengig ADCC mot JIMT-1 brystkarsinomceller og beskrevet en automatisert bildebehandlings- og analysearbeidsflyt for evaluering av NK-cellemediert kreftcelledreping. Prosedyren ble implementert for et bildebehandlings- og bildeanalyseprogram med høyt innhold som muliggjorde overvåking av NK-cellenes sykdomsrelevante evne til å indusere kreftcelleapoptose. Den multimålrettede tyrosinkinasehemmeren Sunitinib som en forbindelse som induserer resistens mot trastuzumabavhengig ADCC i JIMT-1-celler i 2D-cellekulturanalyser ble tidligere identifisert. Sunitinib svekker drapsfunksjonen til NK-celler og induserer autofagi, nedregulering av HER2-uttrykk og øker adherensen av JIMT-1-celler17. For å validere vår sfæroidanalyserørledning for identifikasjon av forbindelser, testet vi Sunitinib som en modellforbindelse og viser at det i betydelig grad kan hemme NK-cellers evne til å drepe kreftcellesfæroidene som reproduserer effekten den demonstrerte i monolag.
Vår metode er enkel, bestående av vekst av sfæroider i agarosebelagte 96-brønns vevskulturplater, en engangsoverføring av de dannede sfæroidene til en glassbunnmikroplate egnet for HCS- og HCA-applikasjoner, tilsetning av testforbindelser og de separat fargede NK-cellene aktivert for å drepe ved administrering av trastuzumab, en enkelt-trinns celledødsfarging og mikroskopianalysen. Ingen alvorlige manipulasjoner blir brukt på brønnene etter begynnelsen av samdyrkingen av de to celletypene og medikamentell behandling for å unngå å kompromittere sfæroidenes integritet. Analysen tar bare 4 dager å utføre. Belegg av bunnen av 96-brønns vevskulturplater med 1% lavsmeltende agarose som en del av prosedyren er et billig alternativ til å bruke ultra-lave festeplater for å forhindre at JIMT-1-celler fester seg til platens overflate og for å fremme spontan organisering av tumorcellene i sfæroider. Siden bildeopptak ikke er mulig over agaroseputen og den U-formede plastoverflaten, måtte sfæroidene overføres til bildeplaten. Avgjørende var passiveringen av glassoverflaten på HCS-platen med det bioinerte overflateaktive middelet, Pluronic-F127 før sfæroidoverføring. Uten dette trinnet spredte sfæroider seg ut på bunnen av brønnene, noe som gjorde avbildning og analyse vanskelig.
En human tumorcellelinje som stabilt uttrykker EGFP ble brukt til å danne sfæroider17. Den genetisk kodede markøren gir vedvarende fluorescens gjennom hele protokollen i stedet for celleflekker. Uovervåket teksturanalyse av EGFP-signalet gir grunnlag for å gjenkjenne sfæroidenes kompakte kjerne, som omfatter hele sfæroiden uten celledødsinduksjon. Når NK-celler ble lagt til og ADCC ble indusert, utgjorde den markerte oppløsningen av konturene noen ganger en utfordring for bildeanalysealgoritmen for å avgrense omrisset av sfæroiden. Fordi Annexin V-positive celler ble funnet hovedsakelig i periferien av sfæroidene, ble dette problemet omgått ved å evaluere celledød i en perifer ringformet region generert av den innebygde bildesegmenteringsmodulen til programvaren ved å utvide den veldefinerte sfæroidkjernen. Ekspansjonsfaktoren som definerer den ytre grensen til dette området ble valgt for å omfatte penumbra av døende, makulerte og spredte celler i alle tilfeller etter visuelt kuratering av hundrevis av sfæroidbilder. Bestemmelse av total fluorescens av det apoptotiske ringområdet i de maksimale projeksjonene av Z-stack-bilder ga lavere eksperimentelle feil og en mer uttalt ADCC-effekt enn å måle enten hele sfæroidområdet eller hele brønnområdet (tilleggsfigur S2). Fluorescerende etiketter ble valgt for merking av BC-cellene (EGFP) og påvisning av celledød (Alexa 647) for å utelukke et behov for kanalseparasjon. En endepunktavlesning ble valgt basert på fluorescerende merking for eksponert fosfatidylserin, en apoptotisk markør, i motsetning til å overvåke reduksjonen av EGFP-fluorescens for å bestemme levedyktigheten til sfæroider over tid, noe som kan være et annet alternativ. Anneksinfarging tillot mer nøyaktig og sensitiv identifisering av celledød. I prinsippet er det mulig å forbedre dagens endimensjonale fargemetode ved å supplere den med ytterligere, mer presise celledødsmarkører som kan identifisere celledødsmodaliteten (f.eks. fluorescerende caspase-substrater) og den omkomne celletypen.
Denne metoden kan endres med minimale endringer for å studere andre effektorimmuncelletyper (makrofager, T-celler og kimære antigenreseptor [CAR]-uttrykkende immunceller) og aktivatormolekyler (f.eks. cytokiner, interleukiner). Med sikte på enkelhet, robusthet og kort behandlingstid, har vi ikke uttømt mulighetene HCA kan tilby for denne analysen. Bilde- og analyseprotokollene er egnet til tillegg av ytterligere fluorescerende etiketter. Denne analysen er tilpasningsdyktig for å studere mer komplekse sfæroider ved å legge til forskjellige typer celler og bruke multipleksede fluorescerende prober for å skille disse celletyper og spesifikke fluorescerende markører for å knytte dem til pågående cellulære hendelser 4,5. Protokollen kan tilpasses alle HC-bilder, og bildene kan analyseres med hvilken som helst bildeanalyseprogramvare som inneholder en teksturanalysemodul.
Sentralt aspekt av viktigheten av denne protokollen, er bruken av sfæroider. Derfor må en rekke parametere vurderes. Det er kjent at celler i 3D-kultur viser en dempet respons på forbindelser sammenlignet med celler dyrket i monolayers21,22. Bruken av 2D-cellekulturer tillater ikke å forutsi det effektive konsentrasjonsområdet for et testet middel i hele organismen. Da vi satte opp 3D-modellen vår, testet vi høyere sammensatte konsentrasjoner og E:T-forhold enn de som ble rapportert i 2D. For eksempel ble protokollen optimalisert ved å øke E:T-forholdet fra 2:1 som ble brukt i vår 2D ADCC-analyse17, til 20:1 for kreftsfæroidene. Begrunnelsen bak dette kan være at stoffene ikke var i stand til effektivt å trenge inn i kjernen av sfæroider og hovedsakelig påvirket cellene i de ytre lagene. På den annen side økte ikke økt konsentrasjon av trastuzumab ADCC-responsen ytterligere (tilleggsfigur S1). Dette valget kan variere mellom cellelinjer og mål. Dermed ville det være interessant å teste denne protokollen på andre cellelinjer, for eksempel en ikke-HER2 BC-cellelinje, med tanke på at HER2-ekspresjonsnivå er en viktig determinant ADCC-responsen20.
Oppsummert representerer vår nye metode en rask og robust plattform for å analysere effekten av forbindelser i en 3D-immunkreftmodell med potensial til å bli brukt til screening av legemidler med høy gjennomstrømning. Dette understreker relevansen av å bruke HER2+ BC sfæroider og NK92. CD16-celler forbedrer forståelsen av de molekylære mekanismene til trastuzumab ytterligere, og gir dermed en mulighet til å forutse effekten av trastuzumabavhengig ADCC i det terapeutiske potensialet in vivo27. Jakten på nye anti-tumor immunmodulatorer kan ha stor nytte av denne analysen. Metoden kan utvides til personlig kjemosensitivitetstesting av pasientavledede tumorcellekulturer. Vi har demonstrert at de tradisjonelle 2D-kokulturene som brukes i immuncelledreping og ADCC-tester, kan konverteres til 3D-sfæroidanalyser, noe som potensielt øker translasjonsrelevansen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærte ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
LV mottok finansiering fra National Research, Development and Innovation Office tilskudd GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE, OTKA K132193 og K147482. Dette prosjektet har mottatt finansiering fra HUN-REN ungarske forskningsnettverk. CD16.176V.NK-92 celler ble hentet fra Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Philadelphia, PA, på vegne av Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), er beskyttet av patenter over hele verden, og ble lisensiert av Nantkwest, lnc. (www.nantkwest.com). Forfatterne takker György Vereb og Árpád Szöőr for deres hjelp med bruken av NK-92-cellelinjen og TR-F(ab')2, og for teknisk rådgivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well glass bottom Cell Carrier Ultra microplates | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | LLC 6055302 | for spheroids measurements |
| 96-well tissue culture plates | TPP | 92096 | for cell seeding |
| α-MEM medium | Sigma | M8042 | in NK medium |
| Agarose | Sigma | A9539 | for spheroids seeding |
| Annexin V-Alexa Fluo 647 conjugate | Invitrogen-ThermoFisher Scientific | A23204 | for apoptosis measurement with HCS |
| CD16.176 V.NK-92 cells | Dr. Kerry S. Campbell (the Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA on behalf of Brink Biologics, Inc. San Diego, CA) | ATCC CRL-2407 | for cell culture |
| Cell Tracker Blue | Invitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) | C2110 | for staining of NK cells |
| DMEM/F-12 medium | Sigma | D8437 | in JIMT1-EGFP medium |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | for coating HCS plate before transfering the spheroids |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | JIMT-1-EGFP and NK medium |
| Glutamine | Gibco | 35,050–061 | in NK medium |
| GraphPad Prism 8.0.1 | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | for statistical analysis | |
| Harmony software | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | for HCA | |
| IL-2 | Proleukin, Novartis Hungária Kft., Budapest, Hungary | PHC0026 | in NK medium |
| Insulin (Humulin R) | Eli Lilly | HI0219 | JIMT-1-EGFP medium |
| JIMT-1 breast cancer cells | for cell culture | ||
| MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11,140–050 | in NK medium |
| Na-pyruvate | Lonza | BE13-115E | in NK medium |
| Opera Phenix High-Content Analysis equipment | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | HH14001000 | for HCA |
| PBS (Posphate buffered saline) | Lonza | BE17-517Q | for washing the cells |
| Penicillin-Streptomycin | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1-EGFP and NK medium |
| pLP-1, pLP-2, pLP-VSV-G, pWOXEGFP | Invitrogen, (Prof. József T zsér, University of Debrecen) |
for JIMT-1-EGFP cell line | |
| Pluronic-F127 | Sigma | P2443 | for coating HCS plate before transfering the spheroids |
| Sunitinib malate | SigmaAldrich | PZ0012 | for treatments |
| Trastuzumab Ab (humanized anti-HER2 monoclonal antibody) | Herzuma®, EGIS Pharmaceuticals, Budapest, Hungary | NDC-63459-303-43 | for treatments |
| Trastuzumab-F(ab')2 | Gift from Prof. György Vereb and Árpád Ször |
Department of Biophysics and Cell Biology, University of Debrecen | for treatments |
| Trypan blue 0.4% solution | Sigma | T8154 | for cell counting |
| Trypsin-EDTA 1X in PBS | Biosera | LM-T1706 | for cells detachment |
References
- Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell Biosci. 12 (1), 155 (2022).
- Mittler, F., et al. High-content monitoring of drug effects in a 3D spheroid model. Front Oncol. 7, 293 (2017).
- Badr-Eldin, S. M., Aldawsari, H. M., Kotta, S., Deb, P. K., Venugopala, K. N. Three-dimensional in vitro cell culture models for efficient drug discovery: Progress so far and future prospects. Pharmaceuticals (Basel). 15 (8), 926 (2022).
- Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744 (2020).
- Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research. Pharmaceutics. 12 (12), 1186 (2020).
- Fitzgerald, A. A., Li, E., Weiner, L. M. 3D culture systems for exploring cancer immunology. Cancers (Basel). 13 (1), 56 (2020).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Sci Rep. 6, 19103 (2016).
- Boucherit, N., Gorvel, L., Olive, D. 3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies. Front Immunol. 11, 603640 (2020).
- Li, Y., et al. Recent progress on immunotherapy for breast cancer: Tumor microenvironment, nanotechnology and more. Front Bioeng Biotechnol. 9, 680315 (2021).
- Lo Nigro, C., et al. NK-mediated antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity in solid tumors: Biological evidence and clinical perspectives. Ann Transl Med. 7 (5), 105 (2019).
- Sun, Y. S., et al. Risk factors and preventions of breast cancer. Int J Biol Sci. 13 (11), 1387-1397 (2017).
- Liu, P. H., Wei, J. C., Wang, Y. H., Yeh, M. H. Female breast cancer incidence predisposing risk factors identification using nationwide big data: A matched nested case-control study in taiwan. BMC Cancer. 22 (1), 849 (2022).
- Burguin, A., Diorio, C., Durocher, F. Breast cancer treatments: Updates and new challenges. J Pers Med. 11 (8), 808 (2021).
- Costa, R. L. B., Czerniecki, B. J. Clinical development of immunotherapies for HER2(+) breast cancer: A review of HER2-directed monoclonal antibodies and beyond. NPJ Breast Cancer. 6, 10 (2020).
- Musolino, A., et al. Role of fcgamma receptors in HER2-targeted breast cancer therapy. J Immunother Cancer. 10 (1), e003171 (2022).
- Petricevic, B., et al. Trastuzumab mediates antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity and phagocytosis to the same extent in both adjuvant and metastatic HER2/NEU breast cancer patients. J Transl Med. 11, 307 (2013).
- Guti, E., et al. The multitargeted receptor tyrosine kinase inhibitor sunitinib induces resistance of HER2 positive breast cancer cells to Trastuzumab-mediated ADCC. Cancer Immunol Immunother. 71 (9), 2151-2168 (2022).
- Barok, M., et al. Trastuzumab decreases the number of circulating and disseminated tumor cells despite Trastuzumab resistance of the primary tumor. Cancer Lett. 260 (1-2), 198-208 (2008).
- Toth, G., et al. The combination of Trastuzumab and Pertuzumab administered at approved doses may delay development of Trastuzumab resistance by additively enhancing antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity. MAbs. 8 (7), 1361-1370 (2016).
- Ehlers, F. aI., et al. ADCC-inducing antibody Trastuzumab and selection of KIR-HLA ligand mismatched donors enhance the NK cell anti-breast cancer response. Cancers (Basel). 13 (13), 3232 (2021).
- Gangadhara, S., Smith, C., Barrett-Lee, P., Hiscox, S. 3d culture of Her2+ breast cancer cells promotes AKT to MAPK switching and a loss of therapeutic response. BMC Cancer. 16, 345 (2016).
- Balalaeva, I. V., Sokolova, E. A., Puzhikhina, A. D., Brilkina, A. A., Deyev, S. M. Spheroids of Her2-positive breast adenocarcinoma for studying anticancer immunotoxins in vitro. Acta Naturae. 9 (1), 38-43 (2017).
- Selis, F., et al. Pegylated Trastuzumab fragments acquire an increased in vivo stability but show a largely reduced affinity for the target antigen. Int J Mol Sci. 17 (4), 491 (2016).
- Johnston, R. L., et al. High content screening application for cell-type specific behaviour in heterogeneous primary breast epithelial subpopulations. Breast Cancer Res. 18 (1), 18 (2016).
- Kandaswamy, C., Silva, L. M., Alexandre, L. A., Santos, J. M. High-content analysis of breast cancer using single-cell deep transfer learning. J Biomol Screen. 21 (3), 252-259 (2016).
- Esquer, H., Zhou, Q., Abraham, A. D., Labarbera, D. V. Advanced high-content-screening applications of clonogenicity in cancer. SLAS Discov. 25 (7), 734-743 (2020).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced Her2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
