Summary
AcroSensE माउस मॉडल और लाइव सेल इमेजिंग विधियों यहाँ वर्णित शुक्राणु एक्रोसोम के उपकोशिकीय डिब्बे में कैल्शियम गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करते हैं और कैसे वे झिल्ली संलयन और एक्रोसोम एक्सोसाइटोसिस के लिए अग्रणी मध्यवर्ती चरणों को विनियमित करते हैं।
Abstract
एक्रोसोम एक्सोसाइटोसिस (एई), जिसमें शुक्राणु का एकल एक्सोसाइटोटिक पुटिका प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ़्यूज़ होता है, निषेचन के लिए आवश्यक एक जटिल, कैल्शियम-निर्भर प्रक्रिया है। हालांकि, कैल्शियम सिग्नलिंग एई को कैसे नियंत्रित करता है, इसकी हमारी समझ अभी भी अधूरी है। विशेष रूप से, इंट्रा-एक्रोसोमल कैल्शियम गतिशीलता और एई की ओर जाने वाले मध्यवर्ती चरणों के बीच परस्पर क्रिया अच्छी तरह से परिभाषित नहीं है। यहां, हम एक ऐसी विधि का वर्णन करते हैं जो एक्रोसोमल कैल्शियम गतिशीलता में स्थानिक और लौकिक अंतर्दृष्टि प्रदान करती है और झिल्ली संलयन और एक्रोसोम पुटिका के बाद के एक्सोसाइटोसिस के साथ उनका संबंध है। विधि एक्सोसाइटोसिस (AcroSensE) के लिए एक एक्रोसोम-लक्षित सेंसर व्यक्त करने वाले एक उपन्यास ट्रांसजेनिक माउस का उपयोग करती है। सेंसर mCherry के साथ जुड़े आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम इंडिकेटर (GCaMP) को जोड़ता है। इस संलयन प्रोटीन विशेष रूप से एक्रोसोमल कैल्शियम गतिशीलता और झिल्ली संलयन घटनाओं के समवर्ती अवलोकन को सक्षम करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। लाइव AcroSensE शुक्राणु में एक्रोसोमल कैल्शियम गतिशीलता और एई की वास्तविक समय की निगरानी उच्च फ्रेम-दर इमेजिंग और एक उत्तेजक वितरण प्रणाली के संयोजन का उपयोग करके प्राप्त की जाती है जो एकल शुक्राणु को लक्षित कर सकती है। यह प्रोटोकॉल कच्चे डेटा की मात्रा निर्धारित करने और विश्लेषण करने के लिए बुनियादी तरीकों के कई उदाहरण भी प्रदान करता है। क्योंकि AcroSensE मॉडल आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड है, इसके वैज्ञानिक महत्व को आसानी से उपलब्ध आनुवंशिक उपकरणों का उपयोग करके बढ़ाया जा सकता है, जैसे कि अन्य माउस आनुवंशिक मॉडल या जीन-संपादन (CRISPR) आधारित विधियों के साथ क्रॉसब्रेडिंग। इस रणनीति के साथ, शुक्राणु क्षमता और निषेचन में अतिरिक्त सिग्नलिंग मार्गों की भूमिकाओं को हल किया जा सकता है। सारांश में, यहां वर्णित विधि एक विशिष्ट उपकोशिकीय डिब्बे में कैल्शियम गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक सुविधाजनक और प्रभावी उपकरण प्रदान करती है-शुक्राणु एक्रोसोम-और कैसे उन गतिशीलता झिल्ली संलयन और एक्रोसोम एक्सोसाइटोसिस के लिए मध्यवर्ती चरणों को नियंत्रित करती है।
Introduction
शुक्राणु कैपेसिटेशन नामक प्रक्रिया के दौरान निषेचन करने की क्षमता प्राप्त करते हैं1. इस प्रक्रिया का एक समापन बिंदु यह है कि शुक्राणु एई से गुजरने की क्षमता प्राप्त करता है। दो दशकों से अधिक डेटा स्तनधारी शुक्राणु (2,3 में संक्षेपित) में एई के एक जटिल, बहु-चरण मॉडल की उपस्थिति का समर्थन करता है। हालांकि, जीवित शुक्राणु में एई का अध्ययन चुनौतीपूर्ण है, और वर्तमान में पर्याप्त संकल्प के साथ इस प्रक्रिया की निगरानी के लिए उपलब्ध तरीके बोझिल हैं और कई तैयारी चरणों की आवश्यकता होती है4, एई के अंतिम चरण का पता लगाने तक सीमित हैं (उदाहरण के लिए, पीएनए5 का उपयोग करके), साइटोसोलिक कैल्शियम में परिवर्तन के माप तक सीमित हैं (एक्रोसोमल कैल्शियम गतिशीलता के विपरीत), या या तो साइटोसोलिक कैल्शियम गतिशीलता या एई6 के माप तक सीमित हैं।
शारीरिक परिस्थितियों में वास्तविक समय एई अध्ययन की कुछ प्रमुख सीमाओं को दूर करने के लिए और कैल्शियम गतिशीलता और एई के बीच परस्पर क्रिया की जांच को सक्षम करने के लिए, एक अद्वितीय माउस मॉडल उत्पन्न किया गया था। इस माउस मॉडल में, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड Ca2+-सेंसर (GCaMP3) और mCherry से बना एक फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त किया जाता है और एक्रोसिन प्रमोटर और सिग्नलिंग पेप्टाइड2 का उपयोग करके एक्रोसोम को लक्षित किया जाता है। लक्षित दोहरी GCaMP3-mCherry सेंसर कैल्शियम सांद्रता के एक साथ वास्तविक समय माप और माइक्रोस्कोपी और एक एकल कोशिका उत्तेजक वितरण प्रणाली(चित्रा 1)का उपयोग कर शारीरिक परिस्थितियों में जीवित शुक्राणु में एक्रोसोमल सामग्री की स्थिति को सक्षम बनाता है। एक्रोसोमल मैट्रिक्स, झिल्ली संलयन और एई के एक घटक के रूप में शुक्राणु से फोटोटेबल और पीएच-असंवेदनशील एमचेरी प्रतिदीप्ति का नुकसान होगा, क्योंकि यह प्रोटीन एक्रोसोम पुटिका से बाहर फैलता है। इस संबंध में, एई के समय और घटना को प्रतिबिंबित करने के लिए मॉडल की क्षमता एक्रोसोम-लक्षित जीएफपी माउस लाइन 7,8,9 के लाभों के समान है।
इस ट्रांसजेनिक माउस लाइन में उपयोग किए जाने वाले GCaMP3 संस्करण में 400 माइक्रोन का अनुमानित KD और Ca2+ के लिए 10-4-10-3 M10 की गतिशील रेंज है, जो इस पुटिका के लिए उपयुक्त है। हमने दिखाया कि GCaMP3 की विशेषताओं का यह संयोजन प्लाज्मा झिल्ली और बाहरी एक्रोसोमल झिल्ली (OAM)2के बीच संलयन ताकना गठन को प्रकट कर सकता है। फ्यूजन पोर डिटेक्शन ताकना आकार का एक परिणाम है जो AcroSensE प्रोटीन को एक्रोसोम (एक्रोसोम सामग्री के नुकसान के माध्यम से) से बाहर निकलने की अनुमति देने के लिए बहुत छोटा है, जबकि एक झिल्ली "चैनल" प्रदान करता है जो Ca2+ आयनों की आमद को एक्रोसोम लुमेन में सक्षम बनाता है, जिससे GCaMP3 की प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि होती है।
उज्ज्वल, मोनोमेरिक, गैर-कैल्शियम-संवेदनशील फ्लोरोसेंट प्रोटीन mCherry एक्रोसोम के दृश्य का समर्थन करता है, जबकि GCaMP3 सिग्नल बेहोश है (उदाहरण के लिए, सीए2+ बाध्यकारी, चित्रा 2 से पहले), और महत्वपूर्ण बात यह है कि यह इमेजिंग के लिए उपयुक्त एक्रोसोम-बरकरार शुक्राणु कोशिकाओं की पहचान के लिए भी अनुमति देता है।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल अद्वितीय AcroSensE माउस मॉडल के उपयोग और उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ एई और शुक्राणु कैल्शियम गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए प्रयोगात्मक रूप से इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोपी के लिए तरीकों का वर्णन करता है.
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Protocol
सभी पशु प्रक्रियाओं दिशा निर्देशों के तहत प्रदर्शन किया और कॉर्नेल विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित (#2002-0095). 8-10 सप्ताह पुराने AcroSensE चूहों2 वर्तमान अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया. AcroSensE चूहों की उपलब्धता के बारे में जानकारी के लिए अनुरोध संबंधित लेखक को प्रस्तुत किया जा सकता है।
1. शुक्राणु संग्रह और धुलाई
- AcroSensE चूहों से कॉडा एपिडीडिमल शुक्राणु (इस प्रक्रिया पर अधिक विवरण11 में प्रदान किए गए हैं) लीजिए। 37 डिग्री सेल्सियस पर संशोधित व्हिटन के मध्यम (मेगावाट) के 0.5 एमएल युक्त 3.5 सेमी ऊतक-संस्कृति डिश में 15 मिनट तैरने की प्रक्रिया की अनुमति दें। मेगावाट के वाष्पीकरण को कम करने के लिए डिश को कवर किया जाना चाहिए, और झुकाया जाना चाहिए ताकि माध्यम में कॉडा एपिडीडिमाइड्स को कवर करने के लिए पर्याप्त गहराई हो।
नोट: संशोधित व्हिटन के मध्यम (मेगावाट) में 22 एमएम एचईपीईएस, 1.2 एमएम एमजीसीएल2, 100 एमएम एनएसीएल, 4.7 एमएम केसीएल, 1 एमएम पाइरुविक एसिड, 4.8 एमएम लैक्टिक एसिड हेमी-सीए2+ नमक, पीएच 7.35 शामिल हैं। ग्लूकोज (5.5 मिमी), NaHCO3 (10 मिमी), और 2-hydroxypropyl-cyclodextrin (सीडी; 3 मिमी) क्षमता के प्रेरण के लिए आवश्यक के रूप में पूरक ( सामग्री की तालिकादेखें) कर रहे हैं, और सांद्रता विशिष्ट प्रयोगों के लिए संशोधित किया जा सकता है. इसके अलावा, सीडी (जैसे, गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन या उच्च घनत्व वाले लिपोप्रोटीन) के बजाय वैकल्पिक स्टेरोल स्वीकर्ता का उपयोग किया जा सकता है। - ठीक संदंश का प्रयोग, तैरने बाहर संग्रह पकवान से किसी भी epididymal ऊतक को हटा दें. शुक्राणु युक्त माध्यम को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें, और कमरे के तापमान पर झूलते बाल्टी रोटर में 1 मिनट के लिए 100 x ग्राम पर निलंबन को अपकेंद्रित्र करें। एक प्लास्टिक विंदुक का प्रयोग, मेगावाट सतह पर तैरनेवाला किसी भी सकल ऊतक मलबे है कि इस कदम पर गोली मार दी है से शुक्राणु युक्त हटा दें.
- 37 डिग्री सेल्सियस पर मेगावाट जोड़कर 3 एमएल की कुल मात्रा में शुक्राणु युक्त मेगावाट सतह पर तैरनेवाला लाओ। एक गोल तल वाली ट्यूब में 8 मिन (कमरे के तापमान पर) के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। धीरे-धीरे ढीले-गोली वाले शुक्राणु से मेगावाट के सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
- यदि व्यवहार्य है, तो शुक्राणु को "शराबी" दिखने वाली गोली के रूप में दिखाई देना चाहिए। धीरे एक बड़े बोर हस्तांतरण विंदुक के साथ विचूर्णन के माध्यम से या ट्यूब ("उंगली flicking") पर कोमल मैनुअल नल के माध्यम से शुक्राणु resuspend. एक बार समान रूप से निलंबित होने के बाद, उन्हें एक नई गोल-नीचे ट्यूब में स्थानांतरित करें। गतिशीलता को गिनने और आकलन करने के लिए शुक्राणु निलंबन के 10-20 माइक्रोन का उपयोग करें। उपयोग के लिए मेगावाट में शुक्राणु पतला।
नोट: माउस शुक्राणु क्षमता से जुड़े अधिकांश प्रयोगों के लिए, 5-10 मिलियन शुक्राणु / एमएल मेगावाट की अंतिम एकाग्रता का उपयोग किया जाता है। यहां वर्णित इमेजिंग प्रोटोकॉल को शुक्राणु की क्षमता की आवश्यकता नहीं होती है, हालांकि शुक्राणु के लिए शारीरिक रूप से प्रासंगिक एक्रोसोम एक्सोसाइटोसिस से गुजरने की क्षमता हासिल करना आवश्यक है। शुक्राणु को कैपेसिट किए बिना कैल्शियम आयनोफोर जैसे अभिकर्मकों के माध्यम से प्रेरित पैथोलॉजिकल एक्सोसाइटोसिस या एक्सोसाइटोसिस का अध्ययन किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, कोई भी विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में गैर-कैपेसिटेटेड कोशिकाओं में एक्रोसोमल कैल्शियम में संभावित परिवर्तनों का पता लगा सकता है। - संग्रह से 3-5 घंटे के भीतर शुक्राणु का उपयोग करें, प्रयोगात्मक परीक्षणों के बीच संभव और सुसंगत के रूप में समय रखते हुए।
- मेगावाट माध्यम का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस पर संग्रह और धोने के सभी चरणों को करें, झिल्ली क्षति को कम करने के तरीकों को नियोजित करें। इसमें बड़े-बोर प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट या बड़े-छिद्र पिपेट युक्तियों का उपयोग शामिल है, जिन्हें प्रक्रिया के सभी चरणों के दौरान उपयोग के लिए अनुशंसित किया जाता है।
2. इमेजिंग के लिए कवरस्लिप व्यंजन के पॉली-डी-लाइसिन-कोटिंग
नोट: पॉली डी लाइसिन (पीडीएल) व्यंजन प्रत्येक प्रयोग से पहले ताजा तैयार किया जाना चाहिए.
- एक कवरस्लिप डिश के केंद्र में पीडीएल (0.5 मिलीग्राम/एमएल, सामग्री की तालिकादेखें) की 0.5 माइक्रोन बूंद वितरित करें।
- एक 10 माइक्रोन स्नातक की उपाधि प्राप्त टिप का प्रयोग, coverslip (crisscross पैटर्न के रूप में चित्रा 1 बी में दिखाया गया है) भर पीडीएल छोटी बूंद धब्बा.
- 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सूखने की अनुमति दें। उपयोग होने तक पीडीएल-लेपित व्यंजन को कवर और 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
3. केशिका खींच, पफिंग के लिए लोड हो रहा है
- बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाओं (ओडी, 2 मिमी, आईडी, 1.56 मिमी, सामग्री की तालिकादेखें) को निम्नानुसार सेटिंग्स का उपयोग करके खींचो- गर्मी: 330, खींचो: 250, वेग: 250, और समय: 70। इस चरण को उपयोग में विशिष्ट पुलर के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
- प्रत्येक प्रयोग से पहले, उत्तेजक समाधान युक्त 3-5x उत्तेजक की एकाग्रता के साथ एक एकल केशिका लोड (पफिंग पर समाधान के तेजी से प्रसार के लिए खाते के लिए). भरने से पहले, अंत से लगभग 1-2 मिमी पर केशिका टिप खोलने के लिए ठीक चिमटी का उपयोग करें. यह एक ∼5 माइक्रोन उद्घाटन व्यास का उत्पादन करना चाहिए। हीट पॉलिशिंग की आवश्यकता नहीं है।
- एक पतली प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग, धीरे-धीरे केशिका में उत्तेजक समाधान इंजेक्षन जब तक इसकी लंबाई के तीन-चौथाई भरा है.
- केशिका के कोमल झिलमिलाहट द्वारा भरने के दौरान गठित किसी भी हवाई बुलबुले निकालें।
- माइक्रोमैनिपुलेटर पर माउंट भरा केशिका ( सामग्री की तालिकादेखें)।
4. पफिंग के लिए उत्तेजना के वितरण की तैयारी
नोट: उपयोगकर्ता की चोट के जोखिम को कम करने के लिए, पफिंग प्रक्रिया के संचालन के दौरान सुरक्षा चश्मे पहने जाने चाहिए।
- 5 साई पर 10 एस पल्स प्रदान करने के लिए एकल सेल वितरण प्रणाली सेटिंग्स सेट करें.
- बोरोसिलिकेट केशिका को एकल-कोशिका वितरण प्रणाली पिपेट धारक से कनेक्ट करें। सुनिश्चित करें कि सील तंग हैं।
- केशिका टिप का अवलोकन करते समय, यह सुनिश्चित करने के लिए 20 साई पर 2 एस का एक छोटा कश लागू करें कि समाधान वास्तव में टिप के अंत के माध्यम से तिरस्कृत है (टिप के अंत में एक छोटी बूंद स्पष्ट होनी चाहिए)।
5. माइक्रोस्कोपी और छवि अधिग्रहण
नोट: सूक्ष्मदर्शी के कई ब्रांड उपलब्ध हैं और उनका उपयोग किया जा सकता है; हालांकि, 3 फ्रेम/एस की न्यूनतम फ्रेम दर वांछनीय है। तापमान और पर्यावरण नियंत्रण के संबंध में, कृपया ध्यान दें कि डिश में माध्यम के वास्तविक तापमान की पुष्टि की जानी चाहिए, उदाहरण के लिए, गैर-संपर्क अवरक्त थर्मामीटर का उपयोग करना।
- एक पॉली-डी-लाइसिन-लेपित 35 मिमी कवरस्लिप डिश के केंद्र में पतला शुक्राणु के 80 माइक्रोन जोड़ें। माउस शुक्राणु क्षमता से जुड़े अधिकांश प्रयोगों के लिए, 5-10 मिलियन शुक्राणु / एमएल की अंतिम एकाग्रता का उपयोग किया जाता है।
- धीरे-धीरे शुक्राणु में जोड़ें 3 एमएल गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) मेगावाट बेस मीडिया 10 एमएम सीएसीएल2 के साथ पूरक।
नोट: सेलुलर प्रक्रियाओं को धीमा करने के लिए कमरे के तापमान पर प्रयोग कर सकते हैं, लेकिन यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि क्योंकि कैपेसिटेशन लिपिड एक्सचेंजों और सूक्ष्म और मैक्रो-डोमेन की तरलता द्वारा मध्यस्थता की जाती है, किसी को यह ध्यान रखना चाहिए कि शारीरिक रूप से प्रासंगिक कैपेसिटेशन और एक्रोसोम एक्सोसाइटोसिस तापमान-निर्भर प्रक्रियाएं हैं। - माइक्रोस्कोप पर शुक्राणु के साथ पकवान माउंट करें (37 डिग्री सेल्सियस तक पूर्व-गर्म)।
- GCaMP3 को 488 एनएम लेजर लाइन का उपयोग करके उत्तेजित करें और 505-550 एनएम बैंडपास (बीपी) फिल्टर के साथ देखें। एक 555 एनएम लेजर लाइन का उपयोग कर mCherry उत्साहित और एक 575-615 एनएम बीपी फिल्टर के साथ देखें.
- एक माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करना (मैनिपुलेटर को एयर-टेबल से जोड़ने की सिफारिश की जाती है, जिस पर माइक्रोस्कोप स्थापित किया गया था), केशिका की नोक को लगभग 100 माइक्रोन को किनारे पर और 5-10 माइक्रोन को ब्याज के सेल के विमान के ऊपर रखें।
नोट: उत्तेजक समाधान केशिका और सेल के बीच की मात्रा में होने वाली तेजी से प्रसार की भरपाई के लिए सामान्य एकाग्रता 3-5x पर किए जाते हैं। - खुर्दबीन पर इमेजिंग अनुक्रम शुरू करो.
- उच्च फ्रेम दर पर छवि शुक्राणु कोशिकाएं, अधिमानतः >10 फ्रेम / यहां, एक गुंजयमान स्कैनर का उपयोग किया गया था जो 33 एमएस / फ्रेम पर इमेजिंग को सक्षम बनाता है।
- माइक्रोस्कोप पर छवि अधिग्रहण शुरू करने के दस सेकंड बाद, उत्तेजक के 10 एस पफ शुरू करने के लिए एकल सेल वितरण प्रणाली को सक्रिय करें।
- 10-15 मिनट की अवधि के लिए छवि कोशिकाओं.
- एकल सेल वितरण प्रणाली का उपयोग करना, चित्रा 1 बी में प्रदान किए गए स्थानों के अनुसार एक ही डिश से कई कोशिकाओं की छवि।
नोट: माइक्रोस्कोप के तहत अनुपचारित / गैर-उत्तेजित शुक्राणु ज्यादातर लाल दिखाई देना चाहिए, जिसमें हरे रंग का संकेत कम तीव्रता होती है। शुक्राणु सिर को कवरस्लिप से जोड़ा जाना चाहिए, और जीवित शुक्राणु को उनकी चलती पूंछ से पहचाना जा सकता है। एई से गुजरने वाले शुक्राणु में, जीसीएएमपी 3 ग्रीन सिग्नल शुरू में बढ़ जाएगा, और एई पूरा होने पर एमचेरी रेड सिग्नल और जीसीएएमपी 3 ग्रीन सिग्नल दोनों गायब हो जाएंगे, जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है। mCherry प्रतिदीप्ति की कमी उस समय का एक अधिक विशिष्ट संकेतक प्रदान करती है जब AE शुरू होता है क्योंकि Ca2+ सांद्रता में परिवर्तन लगातार GCaMP3 प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन का कारण बनेगा।
6. छवि और डेटा विश्लेषण
नोट: ऑफ़लाइन छवि विश्लेषण ImageJ ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग कर आयोजित किया जाता है. पहले, एई की ओर जाने वाली प्रक्रिया में कई मध्यवर्ती चरणों की सूचना दी गई थी, जिसमें एक्रोसोमल कैल्शियम वृद्धि (एसीआर), और पूर्ण झिल्ली संलयन शामिल थे। उत्तरार्द्ध mCherry प्रतिदीप्ति के नुकसान की ओर जाता है और इसलिए पूर्ण AE का प्रतिनिधित्व करता है। कुछ कोशिकाओं में, एक्सोसाइटोसिस के अध्ययन में एम्परोमेट्रिक दृष्टिकोण का उपयोग करते समय प्री-स्पाइक फुट इवेंट्स (पीएसएफ) के समान संकेत देखे जाते हैं (अधिक जानकारी के लिए, कृपया2 देखें)। ACR, AE और इसके मध्यवर्ती चरणों की मात्रा निर्धारित करने के लिए AcroSensE कच्चे डेटा का विश्लेषण करने के लिए कई वैकल्पिक तरीके उपलब्ध हैं। निम्नलिखित कुछ बुनियादी विश्लेषणात्मक तरीकों का वर्णन करता है।
- विशिष्ट माइक्रोस्कोप सिस्टम फ़ाइल एक्सटेंशन के आधार पर, GCaMP3 और mCherry चैनलों के लिए अलग-अलग विंडो उत्पन्न करने के लिए स्प्लिट चैनल टूल (छवि > रंग > स्प्लिट चैनल) का उपयोग करें।
- "सिंक्रोनाइज़ विंडो" टूल (विंडोज को सिंक्रनाइज़ > > टूल का विश्लेषण करें) का उपयोग करके अलग-अलग विंडो को सिंक्रनाइज़ करें।
- एक्रोसोम क्षेत्र(चित्रा 3ए,बी)को शामिल करने के लिए लाल चैनल में शुक्राणु सिर के आसपास ब्याज (आरओआई) का एक क्षेत्र चुनें। सिंक्रोनाइज़ टूल उसी क्षेत्र के चयन को हरे चैनल पर स्वचालित रूप से लागू करने की अनुमति देता है, जिसमें शुक्राणु अभी भी दिखाई देने के लिए बहुत मंद हैं।
- "जेड प्रोफाइलर" प्लगइन चुनें (प्लगइन्स > स्टैक > जेड प्रोफाइलर) या "टाइम सीरीज़ एनालाइज़र" (प्लगइन्स > स्टैक > टाइम सीरीज़ एनालाइज़र) दो चैनलों में से प्रत्येक के लिए फ्रेम/समय के एक समारोह के रूप में प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन की साजिश रचने के लिए।
- प्लॉटिंग और आगे के विश्लेषण के लिए डेटा को स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर (जैसे, Microsoft Excel) में कॉपी करें।
नोट: एक बार डेटा एक स्प्रेडशीट के लिए कॉपी कर रहे हैं, कई मापदंडों विश्लेषण के लिए निकाला जा सकता है, निम्नलिखित सहित, चित्रा 4 में सचित्र के रूप में.- फ्यूजन पोर (FP) प्रारंभ समय: टाइमपॉइंट 0 से उस समयबिंदु तक के समय को मापें जहां GCaMP3 सिग्नल बढ़ना शुरू होता है। यह पैरामीटर उत्तेजना और शुक्राणु एसीआर प्रतिक्रिया के बीच देरी को इंगित करता है।
- AE प्रारंभ समय: टाइमपॉइंट 0 से उस टाइमपॉइंट तक के समय को मापें जहां mCherry सिग्नल क्षय होने लगता है। यह पैरामीटर उत्तेजना और शुक्राणु एई प्रतिक्रिया के बीच देरी को इंगित करता है। इस पैरामीटर भी FP गठन और एई प्रतिक्रिया के बीच देरी की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- पीक एफपी आयाम: GCaMP3 संकेत वृद्धि के शिखर के लिए आधार से प्रतिदीप्ति संकेत को मापने. यह पैरामीटर एसीआर प्रतिक्रिया में कुल वृद्धि को इंगित करता है।
- mCherry के नुकसान की दर: mCherry संकेत हानि के खंड पर एक रैखिक या एक घातीय फिट द्वारा इस पैरामीटर का निर्धारण ( चित्रा 4B में "ढलान" द्वारा संकेत के रूप में).
नोट: वैकल्पिक रूप से, विभिन्न समय बिंदुओं पर अवशिष्ट (आर) सिग्नल विधि द्वारा क्षय दर निर्धारित करें (उदाहरण के लिए, R60: mCherry सिग्नल की आधार रेखा से 60% के अवशिष्ट संकेत के लिए सेकंड में अवधि का समय)। इस पैरामीटर का उपयोग उस दर को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है जिस पर एई पर एक्रोसोमल सामग्री बिखरी हुई है। - mCherry हानि के लिए संकेत कमी: आधारभूत mCherry प्रतिदीप्ति तीव्रता और AE निम्नलिखित संकेत के बीच आयाम में अंतर का निर्धारण. यह पैरामीटर एई पर बिखरी हुई एक्रोसोमल सामग्री की कुल मात्रा को इंगित करता है।
- कच्चे डेटा के रूप में लाल और हरे दोनों चैनलों के लिए प्रतिदीप्ति (एफ) में परिवर्तन प्लॉट करें, या प्रारंभिक प्रतिदीप्ति (एफ0) द्वारा उन्हें सामान्य करें और उन्हें ΔF/F0 के रूप में व्यक्त करें। उत्तरार्द्ध एक ही भूखंड पर लाल और हरे दोनों में परिवर्तनों का बेहतर दृश्य प्रदान करता है (उदाहरण के लिए, चित्रा 3 डी और चित्रा 3 एच देखें)।
नोट: अंत में, विभिन्न मापा मापदंडों एक्रोसोमल कैल्शियम एकाग्रता और एई में परिवर्तन के बीच संबंध निर्धारित करने के लिए विभिन्न स्थितियों के बीच तुलना की जा सकती है। विभिन्न प्रयोगात्मक हालत तुलना के उदाहरण के लिए, संदर्भ2 देखें.
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Representative Results
चित्रा 2 शुक्राणु की सफल उत्तेजना के बाद अपेक्षित प्रतिदीप्ति परिवर्तनों के अनुक्रम को दिखाते हुए एक सरलीकृत चित्रण प्रदान करता है। चित्रा 2 के शीर्ष पैनल GCaMP3 प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन दिखाता है, जहां संकेत शुरू में मंद है (आधारभूत एक्रोसोमल कैल्शियम सांद्रता GCaMP3 केडी से कम हैं), और संलयन छिद्रों के माध्यम से कैल्शियम आयनों के प्रवेश पर, चमक में प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है। अंत में, एई पर, प्रसार और बाह्य अंतरिक्ष में सेंसर के नुकसान के कारण सिग्नल का नुकसान होता है। चित्रा 2 के नीचे पैनल mCherry प्रतिदीप्ति तीव्रता, जहां प्रारंभिक संकेत उज्ज्वल है, और केवल एई और एक्रोसोमल मैट्रिक्स के अन्य सामग्री के साथ सेंसर के प्रसार पर परिवर्तन दिखाता है, वहाँ लाल संकेत की एक मंदता है.
चित्रा 3 गैंग्लियोसाइड जीएम 1 के 125 माइक्रोन के साथ उत्तेजित दो जीवित शुक्राणुओं में ऊपर सचित्र चरणों के लिए वास्तविक मापा डेटा प्रदान करता है (जीएम 1 शुक्राणु12 में एई को कैसे नियंत्रित करता है, इस बारे में अधिक जानकारी के लिए), देखने के एक ही क्षेत्र में कब्जा कर लिया। चित्रा 3 ए, बी, और चित्रा 3 ई, एफ समय बिंदु 0 (उत्तेजना से पहले) पर दो शुक्राणुओं में मापा लाल और हरे रंग के संकेतों को दिखाते हैं, जहां शुरू में, एमचेरी सिग्नल उज्ज्वल है, और जीसीएएमपी 3 मंद है। चित्रा 3 सी, चित्रा 3 जी, और चित्रा 3 डी, चित्रा 3 एच प्रयोग की पूरी अवधि के लिए जेड प्रोफाइलर विश्लेषण प्रदान करते हैं (कच्चे डेटा या एफ /, क्रमशः)। सम्मिलित पैनल उस समय विंडो का ज़ूम-इन दृश्य प्रदान करते हैं जहाँ ACR और AE होते हैं।
क्योंकि शुक्राणु दोनों अत्यधिक विषम हैं और विभिन्न हैंडलिंग प्रक्रियाओं के कारण झिल्ली क्षति के प्रति बहुत संवेदनशील हैं, चित्रा 5 दो प्रकार के नकारात्मक परिणामों के उदाहरण प्रदान करता है। चित्रा 5 ए, सी देखने के एक क्षेत्र के भीतर कब्जा कर लिया कई शुक्राणु दिखाने. पीली रूपरेखा दो शुक्राणु कोशिकाओं को उजागर करती है जो समय बिंदु 3 (उत्तेजना से पहले) पर एक उच्च GCaMP0 संकेत प्रदर्शित करती हैं। वर्तमान प्रयोगों में, ऐसी कोशिकाओं से बचा गया था, क्योंकि वे इंगित करते हैं कि एक्रोसोमल पुटिका पहले से ही कुछ झिल्ली संलयन प्रक्रिया से गुजर रही है या उन्होंने कुछ झिल्ली क्षति का अनुभव किया है जो कैल्शियम को रिसाव करने की अनुमति देता है। चित्रा 5A में शुक्राणु तीर ( चित्रा 5A, सी में सर्कल आरओआई) द्वारा इंगित एक प्रारंभिक mCherry संकेत लेकिन लाल या हरे रंग के चैनलों में कोई प्रतिक्रिया नहीं दर्शाता है (चित्रा 5B, D, क्रमशः, Z-Profiler विश्लेषण विंडो दिखा रहा है जैसा कि ImageJ द्वारा प्रदान किया गया है) 125 माइक्रोन GM1 के साथ उत्तेजना के बाद। हालांकि शुक्राणु की एक उप-जनसंख्या, जैसे कि इस उदाहरण में प्रदान की गई, उत्तेजना के लिए कोई प्रतिक्रिया नहीं दिखाती है, इन्हें अंतिम विश्लेषण में शामिल किया जाता है और प्रतिशत प्रतिक्रिया डेटा विश्लेषण2 (चित्रा 3) में गणना की जाती है।
चित्रा 1: इंस्ट्रूमेंटेशन और प्रयोगात्मक सेटअप। (ए)37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेशन कक्ष में रखा एक पीडीएल-लेपित कवरस्लिप डिश पर लाइव शुक्राणु कोशिकाएं। एक बोरोसिलिकेट केशिका, खींचा और एक एकल कोशिका वितरण प्रणाली से जुड़ा हुआ है, प्रत्यक्ष उत्तेजक प्रसव के लिए इमेजिंग क्षेत्र के केंद्र में शुक्राणु कोशिका के पास स्थित है। दोनों हरे (GCaMP3) और लाल (mCherry) चैनलों लगातार निगरानी और उत्तेजना के दौरान एक उच्च फ्रेम दर (जैसे, 10 फ्रेम / एस) पर दर्ज कर रहे हैं. (बी)कवर-स्लाइड डिश पर पीडीएल जमाव पैटर्न का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (सी) पकवान पर विशिष्ट क्षेत्रों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व जहां शुक्राणु को एक ही डिश में पूर्व कश से गैर-विशिष्ट उत्तेजना को कम करने के लिए केशिका का उपयोग करके उत्तेजित किया जा सकता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: प्रतिदीप्ति संकेत और तीव्रता में परिवर्तन। शीर्ष पैनल: GCaMP3 सिग्नल में वृद्धि एक्रोसोम में कैल्शियम की आमद को दर्शाती है, इसके बाद AcroSensE फ्यूजन प्रोटीन के प्रसार के कारण सिग्नल हानि होती है। निचला पैनल: mCherry संकेत प्रारंभिक झिल्ली संलयन के दौरान स्थिर रहता है, AcroSensE प्रसार और एक्रोसोमल एक्सोसाइटोसिस (AE) पर बाद में मंद होने के साथ। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: प्रतिनिधि डेटा और प्रतिदीप्ति के निशान। दो शुक्राणु कोशिकाओं वाले एक क्षेत्र को चित्रित किया गया था। हरे / लाल चैनल प्रतिदीप्ति ImageJ का उपयोग कर ऑफ़लाइन मात्रा निर्धारित की गई थी और एक्सेल में साजिश रची (चरण 6 में वर्णित के रूप में). (ए-डी) समय के साथ सेल #1 के लिए लाल (ए) और हरे (बी) चैनल प्रतिदीप्ति तीव्रता की मात्रा का ठहराव, चयनित आरओआई के लिए गणना की जाती है, और फिर कच्चे डेटा (सी) के रूप में प्रस्तुत किया जाता है या प्रारंभिक संकेत (डी, एफ / एफ0) के लिए सामान्यीकृत किया जाता है। इन्सर्ट इन (डी) 25-125 एस से समय सीमा का ज़ूम-इन दृश्य प्रदान करता है (ईएच) लाल (ई) और हरे (एफ) चैनल प्रतिदीप्ति तीव्रता का परिमाणीकरण समय के साथ सेल # 2 के लिए, चयनित आरओआई के लिए गणना की जाती है, और फिर कच्चे डेटा (जी) के रूप में प्रस्तुत किया जाता है या प्रारंभिक संकेत (एच, एफ/एफ0) के लिए सामान्यीकृत किया जाता है। इन्सर्ट इन (एच) 25-125 एस से समय सीमा का ज़ूम-इन दृश्य प्रदान करता है। स्केल बार = 5 माइक्रोन। सभी x-अक्ष सेकंड (सेकंडों) में समय का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: डेटा विश्लेषण और परिमाणीकरण पैरामीटर। (ए) एक ठेठ GCaMP3 प्रतिदीप्ति तीव्रता ट्रेस का चित्रण, प्रारंभ समय (सेकंड), आयाम (प्रतिदीप्ति तीव्रता), और अवधि (सेकंड) सहित मात्रात्मक मापदंडों को प्रदर्शित करता है। (बी)एक ठेठ mCherry प्रतिदीप्ति तीव्रता ट्रेस का चित्रण, प्रारंभ समय (सेकंड), अवधि (सेकंड), ढलान (एफ / एस), R60 (प्रतिदीप्ति तीव्रता), और आयाम (प्रतिदीप्ति तीव्रता) सहित मात्रात्मक मापदंडों को प्रदर्शित करना। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: नकारात्मक परिणाम। (ए, सी) mCherry (लाल) और GCaMP3 (हरा) चैनल कई शुक्राणु कोशिकाओं को देखने के एक ही क्षेत्र में कब्जा कर दिखा रहा है। (ए) में तीर शुरू में mCherry प्रतिदीप्ति का प्रदर्शन एक शुक्राणु कोशिका को इंगित करता है, लेकिन 125 माइक्रोन GM1 उत्तेजना के जवाब में कोई बाद में प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन नहीं होता है, जैसा कि Z-Profiler उत्पन्न निशान (B) (mCherry) और (D) (GCaMP3) में देखा गया है। पीले आयत के भीतर कोशिकाओं उत्तेजना से पहले, समय बिंदु 0 पर ऊंचा GCaMP3 प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रदर्शन. स्केल बार = 5 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
यहां, एक माइक्रोस्कोपी-आधारित विधि को वास्तविक समय, एकल-सेल निगरानी और एक्रोसोमल कैल्शियम गतिशीलता और एई के लिए अग्रणी मध्यवर्ती चरणों के बीच परस्पर क्रिया के विश्लेषण के लिए नव उत्पन्न AcroSensE माउस मॉडल का उपयोग करने के लिए वर्णित किया गया है। आसानी से उपलब्ध आनुवंशिक दृष्टिकोणों के साथ, जैसे कि अन्य माउस आनुवंशिक मॉडल या जीन संपादन के साथ क्रॉसब्रेडिंग, यह मॉडल और विधि विभिन्न घटकों और मार्गों की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली प्रदान करती है जो क्षमता, एई और निषेचन से संबंधित शुक्राणु सिग्नलिंग मार्गों में भाग लेते हैं।
महत्वपूर्ण कदम
यह बड़े बोर प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट या बड़े छिद्र विंदुक सुझावों का उपयोग करने के लिए और झिल्ली क्षति को कम करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संग्रह और धोने के सभी चरणों प्रदर्शन करने के लिए सभी शुक्राणु हैंडलिंग चरणों में महत्वपूर्ण है. इसी तरह, एक झूलते बाल्टी रोटर सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब की साइड दीवार के साथ बातचीत कोशिकाओं के कारण झिल्ली क्षति से बचने के लिए एक निश्चित कोण रोटर के लिए बेहतर है. यदि जेड-स्थिति बहाव सुधार उपलब्ध है, तो इमेजिंग अंतराल के दौरान फोकल विमान से बाहर इमेज किए गए शुक्राणु के बहाव से बचने के लिए जेड-स्थिति सुधार हार्डवेयर/सॉफ्टवेयर लागू करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है।
संशोधन और समस्या निवारण
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल लिपिड मध्यस्थता 2,3 के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया गया था और दोनों capacitated और गैर capacitated शुक्राणु के लिए लागू किया जा सकता है. शुक्राणु क्षमता के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग किया जा सकता है; उदाहरण के लिए, या तो एल्ब्यूमिन या साइक्लोडेक्सट्रिन स्टेरोल स्वीकर्ता के रूप में काम कर सकते हैं। इसके अलावा, विभिन्न ऊर्जा सब्सट्रेट या बाइकार्बोनेट को जोड़ा या छोड़ा जा सकता है। हालांकि, ध्यान दें कि बाइकार्बोनेट हवा के संपर्क से जलीय मीडिया में बनेगा, इसलिए वास्तव में 'बाइकार्बोनेट-मुक्त' स्थितियों के परीक्षण के लिए माध्यम बनाने / तैयार करने / संभालने और प्रयोग करने के सभी चरणों में नाइट्रोजन वातावरण के सावधानीपूर्वक उपयोग की आवश्यकता होगी। उपरोक्त प्रोटोकॉल में प्रयोगात्मक समाधान में जोड़ा गया 10 मिमी कैल्शियम का उपयोग करना शामिल है; हालांकि, कैल्शियम आयनों को छोड़ा जा सकता है, chelated (जैसे, EGTA), या कैल्शियम के प्रति संवेदनशील प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों के लिए कम सांद्रता में जोड़ा. कृपया ध्यान दें कि कैल्शियम सांद्रता को कम करने या छोड़ने से एई3 पर अपेक्षित GCaMP2 सिग्नल कम हो जाएगा। इसके अलावा, एक इस प्रोटोकॉल (बनाम मेगावाट यहाँ इस्तेमाल किया) के लिए अन्य मीडिया का उपयोग कर सकते हैं कि बेहतर उनके प्रयोगात्मक डिजाइन और उद्देश्यों फिट. प्रदान किया गया प्रोटोकॉल एकल-कोशिका इमेजिंग और उत्तेजक के एकल-कोशिका वितरण के उपयोग का वर्णन करता है; हालांकि, थोक उत्तेजना द्वारा एक सरलीकृत भिन्नता प्राप्य है, जैसे कि उत्तेजक अभिकर्मक को पूरे पकवान में जोड़कर और पफिंग के माध्यम से नहीं। इसके अलावा, प्रतिदीप्ति क्षमता वाले फ्लोरीमीटर या प्लेट रीडर के उपयोग के माध्यम से AcroSensE मॉडल का उपयोग करके पूरी-जनसंख्या प्रयोग भी संभव हैं।
सीमाओं
यहाँ उपलब्ध कराई विधि उपलब्धता, रखरखाव, और एक AcroSensE माउस कॉलोनी के उपयोग की आवश्यकता है. विधि एक उन्नत इमेजिंग सिस्टम की उपलब्धता पर भी निर्भर करती है, जो महंगी है और प्रशिक्षित कर्मियों की आवश्यकता होती है। कुछ प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों के लिए, एक संभावित सीमा AcroSensE शुक्राणु में साइटोसोलिक कैल्शियम को समवर्ती रूप से मापने में असमर्थता की चिंता करती है, क्योंकि कई उपलब्ध सिंथेटिक कैल्शियम संकेतक GCaMP3 के समान तरंग दैर्ध्य के हैं। हालांकि इस प्रोटोकॉल के दायरे से परे, जनसंख्या स्तर के प्रयोगों की संभावित सीमाओं में एई के बाद एमचेरी सिग्नल को पढ़ना और माध्यम में फैलाव या मृत/पारगम्य कोशिकाओं से आने वाले जीसीएएमपी 3 सिग्नल शामिल हो सकते हैं। इस तरह के तरीकों को अनुकूलित करने के लिए, कोई स्रावित mCherry से पृष्ठभूमि शोर को कम करने के लिए z-फ़ोकसिंग को नियोजित करने का पता लगा सकता है, और/या मृत या पारगम्य शुक्राणु से आधारभूत GCaMP मात्रा का ठहराव सुनिश्चित करने के लिए शम-उपचारित नियंत्रणों का उपयोग कर सकता है।
मौजूदा/वैकल्पिक तरीकों के संबंध में विधि का महत्व
पिछले दो दशकों में, जीवित शुक्राणु में एई गतिशीलता के वास्तविक समय के अध्ययन के लिए कई तरीकों की रिपोर्ट की गई है, जिसमें एक्रोसोम-लक्षित जीएफपी ट्रांसजेनिक चूहों7, एक्रोसोम में लोड किए गए कैल्शियम रंजक (जैसे, फ्लूओ -412), या सिंथेटिक डाई एफएम -6413 जैसे एक्सोसाइटोसिस-विशिष्ट संकेतकों का उपयोग करना। हालांकि, इन विधियों की तुलना में, AcroSensE मॉडल न्यूनतम उपचारित शुक्राणु का उपयोग करने की सुविधा प्रदान करता है जिसके लिए किसी भी डाई लोडिंग या अन्य संभावित झिल्ली-परेशान प्रक्रियाओं की आवश्यकता नहीं होती है। महत्वपूर्ण रूप से, शुक्राणु होने का एक बड़ा फायदा है जो एक दोहरे संकेतक को व्यक्त करता है जो एक्रोसोमल कैल्शियम गतिशीलता, झिल्ली संलयन और ताकना गठन के साथ-साथ एई और एक्रोसोमल सामग्री के परिणामस्वरूप रिलीज की निगरानी कर सकता है।
विशिष्ट अनुसंधान क्षेत्रों में विधि के महत्व और संभावित अनुप्रयोग
ध्यान दें कि नीचे दिए गए प्रयोगात्मक अनुप्रयोग उदाहरणों को एकल-कोशिका या जनसंख्या परख के रूप में किया जा सकता है, बाद वाले के साथ उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण वांछित होने पर महत्वपूर्ण लाभ होते हैं। विभिन्न माउस मॉडल में एई गतिशीलता का अध्ययन AcroSensE माउस मॉडल के साथ क्रॉसब्रीडिंग के माध्यम से आयोजित किया जा सकता है, जिसमें (1) विभिन्न कैल्शियम चैनलों या कैल्शियम चैनल सबयूनिट्स के शून्य या उत्परिवर्तित रूप (जैसे, α1E- और CatSper-null मॉडल के साथ क्रॉसिंग); (2) प्रोटीन के शून्य या उत्परिवर्तित रूप जो झिल्ली संलयन (जैसे, SNAREs) की मध्यस्थता करते हैं। इसके अतिरिक्त, अध्ययन यह जांचने के लिए आयोजित किया जा सकता है कि विभिन्न सिग्नलिंग मार्गों से संबंधित विभिन्न औषधीय एजेंट एक्रोसोमल कैल्शियम और एई गतिशीलता को कैसे नियंत्रित करते हैं। इसके अलावा, अनुसंधान किया जा सकता है कि पर्यावरणीय परिवर्तन एई को कैसे प्रभावित करते हैं, जिसमें तापमान, पीएच, और विभिन्न आयनों या छोटे अणुओं की उपस्थिति या एकाग्रता शामिल है।
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Disclosures
इस काम से संबंधित रिपोर्ट करने के लिए किसी भी लेखक के पास हितों का टकराव नहीं है।
Acknowledgments
इस काम स्वास्थ्य अनुदान R01-HD093827 और R03-HD090304 (एजेटी) के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x oil objective | Olympus Japan | UPlanApo, | |
| 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin | Sigma | C0926 | |
| 35 mm coverslip dish, 1.5 thickness | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL round-bottomed tube | Falcon | 352054 | |
| Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Confocal microscope | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Graduated tip | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Lactic acid | Sigma | G5889 | |
| Live-Cell Microscope Incubation Systems | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Plastic transfer pipette | FisherBrand | 13-711-6M | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| Single cell delivery system | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
References
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