Summary
여기에 설명된 AcroSensE 마우스 모델 및 살아있는 세포 이미징 방법은 정자 아크로솜의 세포 내 구획에서 칼슘 역학을 연구하고 막 융합 및 아크로솜 엑소사이토시스로 이어지는 중간 단계를 조절하는 방법을 연구하는 새로운 접근 방식을 제공합니다.
Abstract
정자의 단일 외세포 소포가 원형질막과 융합하는 Acrosome exocytosis(AE)는 수정에 필수적인 복잡한 칼슘 의존적 과정입니다. 그러나 칼슘 신호전달이 AE를 조절하는 방법에 대한 우리의 이해는 아직 불완전합니다. 특히, 아크로솜 내 칼슘 역학과 AE로 이어지는 중간 단계 사이의 상호 작용은 잘 정의되어 있지 않습니다. 여기에서는 아크로솜 칼슘 역학에 대한 공간적, 시간적 통찰력과 막 융합 및 아크로솜 소포의 후속 엑소사이토시스와의 관계를 설명합니다. 이 방법은 엑소사이토시스(Exocytosis)를 위한 아크로솜 표적 센서(AcroSensE)를 발현하는 새로운 형질전환 마우스를 활용합니다. 이 센서는 mCherry와 융합된 유전자 인코딩 칼슘 표지자(GCaMP)를 결합합니다. 이 융합 단백질은 아크로솜 칼슘 역학과 막 융합 현상을 동시에 관찰할 수 있도록 특별히 설계되었습니다. 살아있는 AcroSensE 정자에서 아크로솜 칼슘 역학 및 AE의 실시간 모니터링은 높은 프레임 속도 이미징과 단일 정자를 표적으로 할 수 있는 자극제 전달 시스템의 조합을 사용하여 달성됩니다. 이 프로토콜은 또한 원시 데이터를 정량화하고 분석하는 기본 방법의 몇 가지 예를 제공합니다. AcroSensE 모델은 유전적으로 암호화되어 있기 때문에 다른 마우스 유전자 모델과의 교배 또는 유전자 편집(CRISPR) 기반 방법과 같이 쉽게 사용할 수 있는 유전 도구를 사용하여 과학적 중요성을 높일 수 있습니다. 이 전략을 통해 정자 용량 및 수정에서 추가 신호 전달 경로의 역할을 해결할 수 있습니다. 요약하면, 여기에 설명된 방법은 특정 세포 내 구획(정자 아크로솜)의 칼슘 역학을 연구하고 이러한 역학이 막 융합 및 아크로솜 엑소사이토시스로 이어지는 중간 단계를 조절하는 방법을 연구하는 편리하고 효과적인 도구를 제공합니다.
Introduction
정자는 용량화(capacitation)1라고 불리는 과정을 통해 수정될 수 있는 능력을 획득한다. 이 과정의 한 가지 종점은 정자가 AE를 받을 수 있는 능력을 획득한다는 것입니다. 20년 이상의 데이터는 포유류 정자에서 AE의 복잡한 다단계 모델의 존재를 뒷받침합니다(2,3으로 요약됨). 그러나, 살아있는 정자에서 AE를 연구하는 것은 어려운 일이며, 적절한 분해능으로 이 과정을 모니터링하기 위해 현재 이용 가능한 방법은 번거롭고 여러준비 단계를 필요로 하며4, AE의 마지막 단계의 검출(예: PNA5 사용)로 제한되며, 세포질 칼슘의 변화 측정으로 제한되며(아크로솜 칼슘 역학과 대조적으로), 또는 세포질 칼슘 역학 또는 AE6의 측정으로 제한됩니다.
생리학적 조건에서 실시간 AE 연구의 주요 한계 중 일부를 극복하고 칼슘 역학과 AE 간의 상호 작용을 조사할 수 있도록 고유한 마우스 모델이 생성되었습니다. 이 마우스 모델에서는 유전적으로 인코딩된 Ca2+-센서(GCaMP3)와 mCherry로 구성된 융합 단백질이 발현되고 아크로신 프로모터 및 신호 펩타이드2를 사용하여 아크로솜을 표적화합니다. 표적 이중 GCaMP3-mCherry 센서는 현미경 및 단세포 자극제 전달 시스템을 사용하여 생리학적 조건에서 살아있는 정자의 칼슘 농도와 아크로솜 함량 상태를 동시에 실시간으로 측정할 수 있습니다(그림 1). 아크로솜 매트릭스의 구성 요소인 막 융합 및 AE는 이 단백질이 아크로솜 소포에서 확산됨에 따라 정자에서 광안정성 및 pH에 민감하지 않은 mCherry 형광의 손실을 초래합니다. 이와 관련하여, AE의 타이밍 및 발생을 반영하는 모델의 능력은 아크로솜-표적 GFP 마우스 라인(7,8,9)의 이점과 유사하다.
이 형질전환 마우스 라인에 사용된 GCaMP3 변이체는 약 400μM의 KD와 10-4-10-3M10의 Ca2+에 대한 동적 범위를 가지며 이 소포에 적합합니다. 우리는 GCaMP3의 이러한 특징의 조합이 원형질막과 외부 아크로솜막(OAM) 사이의 융합 공극 형성을 나타낼 수 있음을 보여주었습니다2. 융합 기공 검출은 공극 크기가 너무 작아서 AcroSensE 단백질이 아크로솜 내강 내강으로 Ca2+ 이온을 유입할 수 있는 막 "채널"을 제공하여 GCaMP3의 형광 강도를 증가시키는 동시에 AcroSensE 단백질이 아크로솜 밖으로 분산될 수 없기 때문입니다.
밝고 단량체이며 칼슘에 민감하지 않은 형광 단백질 mCherry는 GCaMP3 신호가 희미할 때(예: Ca2+ 결합 전, 그림 2) 아크로솜의 시각화를 지원하며, 중요한 것은 이미징에 적합한 아크로솜 온전한 정자 세포를 식별할 수 있다는 것입니다.
다음 프로토콜은 고유한 AcroSensE 마우스 모델의 활용과 높은 공간 및 시간 분해능으로 AE 및 정자 칼슘 역학을 연구하기 위해 실험적으로 사용되는 현미경 검사 방법을 설명합니다.
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Protocol
모든 동물 시술은 가이드라인에 따라 수행되었으며 코넬 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(#2002-0095)의 승인을 받았습니다. 본 연구에는 8-10주령의 AcroSensE 마우스2 를 사용하였다. AcroSensE 마우스의 가용성에 대한 정보 요청은 교신 저자에게 제출할 수 있습니다.
1. 정자 채취 및 세척
- AcroSensE 마우스에서 cauda 부고환 정자를 수집합니다(이 절차에 대한 자세한 내용은11에 제공됨). 37°C에서 0.5mL의 Modified Whitten's 배지(MW)가 들어 있는 3.5cm 조직 배양 접시에서 15분 동안 스윔아웃 절차를 적용합니다. MW의 증발을 줄이기 위해 접시를 덮어야 하며, 배지가 cauda 부고환을 덮을 수 있는 충분한 깊이를 갖도록 기울여야 합니다.
참고: Modified Whitten의 배지(MW)에는 22mM HEPES, 1.2mM MgCl2, 100mM NaCl, 4.7mM KCl, 1mM 피루브산, 4.8mM 젖산 hemi-Ca2+ 염, pH 7.35가 포함됩니다. 포도당(5.5mM),NaHCO3 (10mM) 및 2-하이드록시프로필--사이클로덱스트린(CD, 3mM)은 용량성 유도를 위해 필요에 따라 보충되며( 재료 표 참조) 특정 실험을 위해 농도를 수정할 수 있습니다. 또한, CD 대신에 대체 스테롤 수용체(예를 들어, 소 혈청 알부민 또는 고밀도 지단백질)를 사용할 수 있다. - 미세한 집게를 사용하여 수영 수집 접시에서 부고환 조직을 제거합니다. 정자가 포함된 배지를 15mL 원뿔형 튜브에 옮기고 실온의 스윙 버킷 로터에서 1분 동안 100 x g 의 현탁액을 원심분리합니다. 플라스틱 피펫을 사용하여 이 단계에서 펠릿이 된 총 조직 파편에서 정자가 포함된 MW 상청액을 제거합니다.
- 37°C에서 MW를 첨가하여 정자를 포함하는 MW 상청액을 총 부피 3mL로 만듭니다. 바닥이 둥근 튜브에서 400 x g 에서 8분 동안(실온에서) 원심분리합니다. 느슨하게 펠릿 정자에서 MW의 상청액을 천천히 제거합니다.
- 생존 가능하다면 정자는 "푹신푹신한" 모양의 알갱이로 나타나야 합니다. 대구경 이송 피펫을 사용한 분쇄 또는 튜브의 부드러운 수동 탭("손가락 튕기기")을 통해 정자를 부드럽게 재현탁시킵니다. 균등하게 다시 부유되면 새 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다. 10-20 μL의 정자 현탁액을 사용하여 운동성을 계산하고 평가합니다. 사용하기 위해 MW에서 정자를 희석하십시오.
참고: 마우스 정자 용량과 관련된 대부분의 실험에서는 5-1,000만 정자/mL MW의 최종 농도가 사용됩니다. 여기에 설명된 이미징 프로토콜은 정자의 용량화를 필요로 하지 않지만, 정자가 생리학적으로 관련된 아크로솜 엑소사이토시스(acrosome exocytosis)를 겪을 수 있는 능력을 획득하는 것이 필요하다. 정자를 용량화하지 않고 칼슘 이온단과 같은 시약을 통해 유도된 병리학적 엑소사이토시스 또는 엑소사이토시스를 연구할 수 있습니다. 또한 다양한 자극에 대한 반응으로 비용량 세포에서 아크로솜 칼슘의 잠재적인 변화를 탐구할 수 있습니다. - 채취 후 3-5시간 이내에 정자를 사용하여 실험 시험 기간 동안 시간을 최대한 짧게 유지하고 일관성을 유지하십시오.
- MW 배지를 사용하여 37°C에서 수집 및 세척의 모든 단계를 수행하고 멤브레인 손상을 최소화하는 방법을 사용합니다. 여기에는 대구경 플라스틱 이송 피펫 또는 대형 오리피스 피펫 팁의 사용이 포함되며, 이는 절차의 모든 단계에서 사용하는 것이 좋습니다.
2. 화상 진찰을 위한 coverslip 접시의 많은 D lysine 코팅
알림: 폴리-D-라이신(PDL) 접시는 각 실험 전에 신선하게 준비해야 합니다.
- 커버슬립 접시 중앙에 0.5μL의 PDL 방울(0.5mg/mL, 재료 표 참조)을 분주합니다.
- 10μL 눈금 팁을 사용하여 커버슬립( 그림 1B 참조)에 PDL 방울을 도포합니다.
- 37°C에서 10분 동안 건조시킵니다. PDL 코팅 접시를 덮고 사용할 때까지 37°C에서 보관하십시오.
3. 모세관 당기기, 내뿜기를 위한 적재
- 열: 2mm, ID, 1.56mm, 재료 표 참조)를 열: 330, 당기기: 250, 속도: 250, 시간: 70 설정을 사용하여 당깁니다. 이 단계는 사용 중인 특정 풀러에 맞게 최적화되어야 합니다.
- 각 실험 전에 자극제 농도의 3-5배를 포함하는 자극 용액을 단일 모세관에 로드합니다(퍼핑 시 용액의 빠른 확산을 설명하기 위해). 채우기 전에 미세한 핀셋을 사용하여 끝에서 약 1-2mm 떨어진 모세관 끝을 부러뜨립니다. 이것은 ∼5 μm의 개구부 직경을 생성해야 합니다. 열 연마가 필요하지 않습니다.
- 얇은 플라스틱 전사 피펫을 사용하여 길이의 3/4이 찰 때까지 자극 용액을 모세관에 천천히 주입합니다.
- 모세관을 부드럽게 튕겨 채우는 동안 형성된 기포를 제거합니다.
- 미세 조작기에 채워진 모세관을 장착합니다( 재료 표 참조).
4. 퍼핑을 위한 자극 전달 준비
알림: 사용자 부상의 위험을 최소화하려면 퍼핑 절차 작동 중에 보안경을 착용해야 합니다.
- 5psi에서 10초 펄스를 제공하도록 단일 셀 전달 시스템 설정을 지정합니다.
- 붕규산 모세관을 single-cell delivery system 피펫 홀더에 연결합니다. 씰이 단단히 조여졌는지 확인하십시오.
- 모세관 팁을 관찰하는 동안 2psi에서 20초의 짧은 퍼프를 적용하여 용액이 팁 끝을 통해 실제로 분배되도록 합니다(팁 끝에 작은 방울이 분명해야 함).
5. 현미경 검사 및 이미지 획득
알림: 여러 브랜드의 현미경을 사용할 수 있으며 사용할 수 있습니다. 그러나 최소 프레임 속도는 3프레임/초가 바람직합니다. 온도 및 환경 제어와 관련하여 접시에 있는 매체의 실제 온도를 확인해야 합니다.ample, 비접촉식 적외선 온도계를 사용합니다.
- 80μL의 희석된 정자를 폴리-D-라이신으로 코팅된 35mm 커버슬립 접시의 중앙에 추가합니다. 마우스 정자 용량화와 관련된 대부분의 실험에는 5-1,000만 정자/mL의 최종 농도가 사용됩니다.
- 10mM CaCl2 가 보충 된 따뜻한 (37 ° C) MW 기본 배지 3mL를 정자에 천천히 첨가합니다.
참고: 세포 과정을 늦추기 위해 실온에서 실험을 수행할 수 있지만, 용량 수용은 지질 교환과 미시 및 거시 영역의 유동성에 의해 매개되기 때문에 생리학적으로 관련된 정전 용량 및 아크로솜 엑소사이토시스는 온도에 따라 달라지는 과정이라는 점을 명심해야 합니다. - 현미경에 정자가 있는 접시를 장착합니다(37°C로 예열).
- 488nm 레이저 라인을 사용하여 GCaMP3를 자극하고 505-550nm 대역통과(BP) 필터로 볼 수 있습니다. 555nm 레이저 라인을 사용하여 mCherry를 자극하고 575-615nm BP 필터로 봅니다.
- 마이크로 매니퓰레이터(매니퓰레이터를 현미경이 설치된 에어 테이블에 부착하는 것이 좋습니다.)를 사용하여 모세관 끝을 측면으로 약 100μm, 관심 세포의 평면에서 5-10μm 위에 위치시킵니다.
참고: 자극 용액은 모세관과 세포 사이의 부피에서 발생하는 빠른 확산을 보상하기 위해 정상 농도의 3-5배로 만들어집니다. - 현미경에서 이미징 시퀀스를 시작합니다.
- 높은 프레임 속도, 바람직하게는 >10 frames/s로 정자 세포를 이미지화합니다. 여기서는 33ms/프레임으로 이미징을 가능하게 하는 공진 스캐너가 사용되었습니다.
- 현미경에서 이미지 획득을 시작한 지 10초 후에 단세포 전달 시스템을 활성화하여 10초 동안 각성제를 퍼프합니다.
- 10-15분 동안 이미지 셀.
- single-cell delivery system을 사용하여 그림 1B에 제공된 위치에 따라 단일 접시에서 여러 세포를 이미지화합니다.
알림: 현미경으로 치료되지 않은/자극되지 않은 정자는 녹색 신호의 강도가 낮고 대부분 빨간색으로 나타나야 합니다. 정자 머리는 커버슬립에 부착해야 하며, 살아있는 정자는 움직이는 꼬리로 식별할 수 있습니다. AE를 거친 정자에서 GCaMP3 녹색 신호는 처음에 증가하고, 그림 2와 같이 AE가 완료되면 mCherry 적색 신호와 GCaMP3 녹색 신호가 모두 사라집니다. mCherry 형광의 감소는 Ca2+ 농도의 변화가 GCaMP3 형광 강도의 지속적인 변화를 유발하기 때문에 AE가 시작되는 시간에 대한 보다 구체적인 지표를 제공합니다.
6. 이미지 및 데이터 분석
참고: 오프라인 이미지 분석은 ImageJ를 사용하여 수행됩니다( 재료 표 참조). 이전에는 AE로 이어지는 과정에서 아크로솜 칼슘 상승(ACR) 및 전체 막 융합을 포함한 몇 가지 중간 단계가 보고되었습니다. 후자는 mCherry 형광의 손실로 이어지므로 전체 AE를 나타냅니다. 일부 세포에서는 엑소사이토시스(exocytosis) 연구에서 전류 측정 접근법을 사용할 때 PSF(pre-spike foot events)와 유사한 신호가 관찰됩니다(자세한 내용은2 참조). ACR, AE 및 중간 단계를 정량화하기 위해 AcroSensE 원시 데이터를 분석하기 위해 몇 가지 선택적 방법을 사용할 수 있습니다. 다음은 몇 가지 기본 분석 방법에 대한 설명입니다.
- 특정 현미경 시스템 파일 확장자에 따라 분할 채널 도구(Image > Colors > Split Channels)를 사용하여 GCaMP3 및 mCherry 채널에 대한 개별 창을 생성합니다.
- "창 동기화" 도구(Analyze > Tools > Synchronize Windows)를 사용하여 개별 창을 동기화합니다.
- 적색 채널에서 정자 머리 주변의 관심 영역(ROI)을 선택하여 아크로솜 영역을 포함합니다(그림 3A,B). 동기화 도구를 사용하면 정자가 여전히 너무 어두워서 보이지 않는 녹색 채널에 동일한 영역 선택을 자동으로 적용할 수 있습니다.
- "Z Profiler" 플러그인(Plugins > Stacks > Z Profiler) 또는 "Time Series Analyzer"(Plugins > Stacks > Time Series Analyzer)를 선택하여 두 채널 각각에 대한 프레임/시간의 함수로 형광 강도의 변화를 플로팅합니다.
- 플로팅 및 추가 분석을 위해 데이터를 스프레드시트 소프트웨어(예: Microsoft Excel)에 복사합니다.
참고: 데이터가 스프레드시트에 복사되면 그림 4와 같이 다음을 포함하여 분석을 위해 여러 매개변수를 추출할 수 있습니다.- Fusion Pore(FP) 시작 시간: 0 시점부터 GCaMP3 신호가 상승하기 시작하는 시점까지의 시간을 측정합니다. 이 매개변수는 자극과 정자 ACR 반응 사이의 지연을 나타냅니다.
- AE 시작 시간: 0번 시점부터 mCherry 신호가 감쇠하기 시작하는 시점까지의 시간을 측정합니다. 이 매개변수는 자극과 정자 AE 반응 사이의 지연을 나타냅니다. 이 매개변수는 FP 형성과 AE 응답 사이의 지연을 계산하는 데에도 사용할 수 있습니다.
- 피크 FP 진폭: GCaMP3 신호 상승의 베이스에서 피크까지의 형광 신호를 측정합니다. 이 매개 변수는 ACR 응답의 총 증가를 나타냅니다.
- mCherry 손실률: mCherry 신호 손실 섹션에 대한 선형 또는 지수 피팅으로 이 매개변수를 결정합니다( 그림 4B의 "기울기"로 표시됨).
알림: 또는 다양한 시점에서 잔차(R) 신호 방법으로 감쇠율을 결정합니다(예: R60: mCherry 신호의 기준선에서 60%의 잔류 신호까지의 지속 시간(초)). 이 파라미터는 아크로솜 함량이 AE에 분산되는 속도를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. - mCherry 손실에 대한 신호 감소: 기준선 mCherry 형광 강도와 AE 이후의 신호 간의 진폭 차이를 결정합니다. 이 매개변수는 AE에 분산된 아크로솜 함량의 총량을 나타냅니다.
- 적색 채널과 녹색 채널 모두에 대한 형광(F)의 변화를 원시 데이터로 플로팅하거나, 초기 형광(F0)으로 정규화하고 ΔF/F0으로 표현할 수 있습니다. 후자는 단일 플롯에서 빨간색과 녹색의 변화를 더 잘 시각화합니다(예: 그림 3D 및 그림 3H 참조).
참고: 마지막으로, 서로 다른 조건 간에 서로 다른 측정된 매개변수를 비교하여 아크로솜 칼슘 농도와 AE의 변화 사이의 관계를 결정할 수 있습니다. 다양한 실험 조건 비교의 예는 참조2를 참조하십시오.
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Representative Results
그림 2 는 정자의 성공적인 자극 후 예상되는 형광 변화의 시퀀스를 보여주는 단순화된 그림을 제공합니다. 그림 2 의 상단 패널은 GCaMP3 형광 강도의 변화를 보여주는데, 이 경우 신호는 초기에 희미하고(기준선 아크로솜 칼슘 농도는 GCaMP3 KD보다 낮음) 융합 기공을 통해 칼슘 이온이 유입되면 형광의 밝기가 증가합니다. 마지막으로, AE에서는 확산으로 인한 신호 손실과 세포외 공간으로의 센서 손실이 있습니다. 그림 2 의 하단 패널은 mCherry 형광 강도의 변화를 보여주는데, 초기 신호는 밝고 AE와 센서의 확산 시에만 아크로솜 매트릭스의 다른 내용물과 함께 적색 신호가 어두워집니다.
그림 3 은 125μM의 강글리오시드 GM1(GM1이 정자12에서 AE를 조절하는 방법에 대한 자세한 내용)으로 자극된 두 개의 살아있는 정자에서 단일 시야에서 캡처된 단계에 대한 실제 측정 데이터를 제공합니다. 그림 3A, B 및 그림 3E, F 는 시점 0(자극 전)에서 두 정자에서 측정된 적색 및 녹색 신호를 보여주며, 처음에는 mCherry 신호가 밝고 GCaMP3는 어둡습니다. 그림 3C, 그림 3G 및 그림 3D, 그림 3H 는 실험의 전체 기간 동안 Z 프로파일러 분석을 제공합니다(원시 데이터 또는 F/F0, 각각). 삽입 패널은 ACR 및 AE가 발생하는 시간 창을 확대하여 볼 수 있습니다.
정자는 매우 이질적이고 다양한 취급 절차로 인해 막 손상에 매우 민감하기 때문에 그림 5는 두 가지 유형의 음성 결과의 예를 제공합니다. 그림 5A,C는 하나의 시야 내에서 캡처된 여러 정자를 보여줍니다. 노란색 윤곽선은 시점 0(자극 전)에서 높은 GCaMP3 신호를 나타내는 두 개의 정자 세포를 강조합니다. 본 실험에서 이러한 세포는 아크로솜 소포가 이미 막 융합 과정을 거치고 있거나 칼슘이 누출될 수 있는 막 손상을 경험했음을 나타내기 때문에 피했습니다. 화살표로 표시된 그림 5A의 정자(그림 5A,C의 원 ROI)는 125μM GM1로 자극한 후 초기 mCherry 신호를 보여주지만 빨간색 또는 녹색 채널(각각 그림 5B, D, ImageJ에서 제공하는 Z-Profiler 분석 창 표시)에서는 반응이 없음을 보여줍니다. 이 예에서 제공된 것과 같은 정자의 하위 집단은 자극에 대한 반응을 보이지 않지만 최종 분석에 포함되며 백분율 반응 데이터 분석2에서 계산됩니다(그림 3).
그림 1: 기기 및 실험 설정. (A) 37°C의 배양 챔버에 놓인 PDL 코팅 커버슬립 접시에 담긴 살아있는 정자 세포. 단세포 전달 시스템에 당겨져 부착된 붕규산 모세관은 직접 자극제 전달을 위해 이미징 영역 중앙의 정자 세포 근처에 위치합니다. 녹색(GCaMP3) 및 적색(mCherry) 채널은 자극 중에 높은 프레임 속도(예: 10프레임/초)로 지속적으로 모니터링되고 기록됩니다. (B) 커버 슬라이드 접시에 대한 PDL 증착 패턴의 개략도 표현. (C) 동일한 접시에서 이전 퍼프로 인한 비특이적 자극을 최소화하기 위해 모세관을 사용하여 정자를 자극할 수 있는 접시의 특정 영역의 개략도 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 형광 신호 및 강도의 변화. 상단 패널: GCaMP3 신호의 증가는 아크로솜으로의 칼슘 유입을 의미하며, AcroSensE 융합 단백질의 확산으로 인한 신호 손실이 뒤따릅니다. 하단 패널: mCherry 신호는 초기 멤브레인 융합 중에 안정적으로 유지되며, AcroSensE 확산 및 아크로솜 엑소사이토시스(AE) 시 후속 디밍이 발생합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 대표 데이터 및 형광 흔적. 2개의 정자 세포를 포함하는 필드를 이미지화하였다. 녹색/적색 채널 형광은 ImageJ를 사용하여 오프라인으로 정량화하고 Excel에서 표시했습니다(6단계 참조). (서기-인도) 시간 경과에 따른 셀 #1에 대한 적색(A) 및 녹색(B) 채널 형광 강도의 정량화, 선택한 ROI에 대해 계산된 후 원시 데이터(C)로 표시되거나 초기 신호(D, F/F0)로 정규화됨. (D)의 인서트는 25-125초의 시간 프레임을 확대하여 볼 수 있습니다. (E-H) 시간 경과에 따른 셀 #2에 대한 적색(E) 및 녹색(F) 채널 형광 강도의 정량화, 선택한 ROI에 대해 계산된 후 원시 데이터(G)로 표시되거나 초기 신호(H, F/F0)로 정규화됨. (H)의 인서트는 25-125초의 시간 프레임을 확대하여 볼 수 있습니다. 눈금 막대 = 5μm. 모든 x축은 시간(초)을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 데이터 분석 및 정량화 파라미터. (A) 시작 시간(초), 진폭(형광 강도) 및 지속 시간(초)을 포함한 정량화 가능한 매개변수를 표시하는 일반적인 GCaMP3 형광 강도 추적의 그림. (B) 시작 시간(초), 지속 시간(초), 기울기(F/s), R60(형광 강도) 및 진폭(형광 강도)을 포함한 정량화 가능한 매개변수를 표시하는 일반적인 mCherry 형광 강도 추적의 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 부정적인 결과. (A,C) mCherry(빨간색) 및 GCaMP3(녹색) 채널은 단일 시야에서 캡처된 여러 정자 세포를 보여줍니다. (A)의 화살표는 (B)(mCherry) 및 (D)(GCaMP3)에 제공된 Z-Profiler 생성 트레이스에서 관찰된 바와 같이 처음에는 mCherry 형광을 나타내지만 125μM GM1 자극에 대한 반응으로 후속 형광 강도 변화가 없는 정자 세포를 나타냅니다. 노란색 사각형 내의 세포는 자극 전 시점 0에서 상승된 GCaMP3 형광 강도를 나타냅니다. 눈금 막대 = 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서는 아크로솜 칼슘 역학과 AE로 이어지는 중간 단계 간의 상호 작용에 대한 실시간 단일 세포 모니터링 및 분석을 위해 새로 생성된 AcroSensE 마우스 모델을 활용하기 위한 현미경 기반 방법을 설명합니다. 다른 마우스 유전자 모델과의 교배 또는 유전자 편집과 같이 쉽게 사용할 수 있는 유전적 접근법과 함께 이 모델 및 방법은 용량, AE 및 수정과 관련된 정자 신호 경로에 참여하는 다양한 구성 요소 및 경로의 역할을 연구할 수 있는 강력한 시스템을 제공합니다.
중요 단계
모든 정자 처리 단계에서 대구경 플라스틱 이송 피펫 또는 대형 오리피스 피펫 팁을 사용하고 37°C에서 채취 및 세척의 모든 단계를 수행하여 막 손상을 최소화하는 것이 중요합니다. 유사하게, 스윙 버켓 로터는 마이크로 원심분리기 튜브의 측벽과 상호작용하는 셀로 인한 멤브레인 손상을 피하기 위해 고정각 로터보다 바람직하다. Z-위치 드리프트 보정을 사용할 수 있는 경우 이미징 간격 동안 이미징된 정자가 초점면에서 벗어나는 것을 방지하기 위해 z-위치 보정 하드웨어/소프트웨어를 적용하는 것이 좋습니다.
수정 및 문제 해결
여기에 기술된 프로토콜은 지질-매개 신호전달 2,3의 연구에 최적화되었으며, 용량화된 정자와 비용량화된 정자 모두에 적용될 수 있다. 정자 용량 수용을 위한 다른 방법은 사용될 수 있습니다; 예를 들어, 알부민 또는 사이클로덱스트린은 스테롤 수용체 역할을 할 수 있습니다. 또한, 다양한 에너지 기판 또는 중탄산염을 첨가하거나 생략할 수 있다. 그러나 중탄산염은 공기에 노출되면 수성 매질에 형성되므로 진정으로 '중탄산염이 없는' 조건을 테스트하려면 매체 제조/준비/취급 및 실험 수행의 모든 단계에서 질소 환경을 신중하게 사용해야 합니다. 위의 프로토콜에는 실험 용액에 첨가된 10mM 칼슘을 사용하는 것이 포함됩니다. 그러나 칼슘 이온은 칼슘에 민감한 실험 응용 분야를 위해 생략하거나 킬레이트화(예: EGTA) 또는 더 낮은 농도로 추가할 수 있습니다. 칼슘 농도를 낮추거나 생략하면 AE2에서 예상되는 GCaMP3 신호가 감소합니다. 또한 이 프로토콜에는 실험 설계 및 목표에 더 잘 맞는 다른 매체(여기에 사용된 MW와 비교)를 사용할 수 있습니다. 제공된 프로토콜은 단일 세포 이미징의 사용 및 자극제의 단일 세포 전달을 설명합니다. 그러나 단순화된 변형은 퍼핑을 통하지 않고 전체 접시에 자극 시약을 추가하는 것과 같은 대량 자극에 의해 얻을 수 있습니다. 또한 형광 기능이 있는 형광계 또는 플레이트 리더를 사용하여 AcroSensE 모델을 사용하여 전체 모집단 실험도 가능합니다.
제한
여기에 제공된 방법은 AcroSensE 마우스 콜로니의 가용성, 유지 관리 및 사용이 필요합니다. 이 방법은 또한 비용이 많이 들고 숙련된 인력이 필요한 고급 이미징 시스템의 가용성에 따라 달라집니다. 일부 실험 응용 분야의 경우, 사용 가능한 많은 합성 칼슘 표지자가 GCaMP3와 유사한 파장을 가지고 있기 때문에 AcroSensE 정자에서 세포질 칼슘을 동시에 측정할 수 없다는 한계가 있을 수 있습니다. 이 프로토콜의 범위를 벗어나지만, 집단 수준 실험의 잠재적 한계에는 AE 후 mCherry 신호 판독 및 데드/투과화된 세포에서 오는 배지 또는 GCaMP3 신호의 분산이 포함될 수 있습니다. 이러한 방법을 최적화하기 위해 z-focusing을 사용하여 분비된 mCherry의 배경 소음을 최소화하거나 가짜 처리된 대조군을 활용하여 죽은 정자 또는 투과된 정자에서 기준선 GCaMP 정량을 보장할 수 있습니다.
기존/대체 방법과 비교한 방법의 중요성
지난 20년 동안, 아크로솜 표적 GFP 형질전환 마우스(acrosome-targeted GFP transgenic mice)7, 아크로솜(acrosome)에 로딩된 칼슘 염료(예: Fluo-412) 또는 합성 염료 FM-6413과 같은 엑소사이토시스(exocytosis) 특이적 지표를 사용하는 등 살아있는 정자에서 AE 역학의 실시간 연구를 위한 여러 가지 방법에 대한 보고가 있었습니다. 그러나 이러한 방법과 비교하여 AcroSensE 모델은 염료 로딩 또는 기타 잠재적으로 막을 교란하는 절차가 필요하지 않은 최소한으로 처리된 정자를 사용할 수 있는 편리함을 제공합니다. 중요한 것은 아크로솜 칼슘 역학, 막 융합 및 기공 형성뿐만 아니라 AE 및 그에 따른 아크로솜 함량의 방출을 모니터링할 수 있는 이중 지표를 발현하는 정자를 갖는 것이 큰 이점이 있다는 것입니다.
특정 연구 분야에서 이 방법의 중요성과 잠재적 적용
아래의 실험적 응용 사례는 단일 세포 또는 집단 분석으로 수행할 수 있으며, 후자는 고처리량 분석이 필요할 때 상당한 이점이 있습니다. 다양한 마우스 모델에서의 AE 역학 연구는 AcroSensE 마우스 모델과의 교배를 통해 수행될 수 있으며, 여기에는 (1) 다양한 칼슘 채널 또는 칼슘 채널 서브유닛의 null 또는 돌연변이 형태(예: α1E- 및 CatSper-null 모델과의 교배); (2) 막 융합을 매개하는 null 또는 돌연변이 형태의 단백질(예: SNAREs). 또한 다양한 신호 전달 경로와 관련된 다양한 약리학적 제제가 아크로솜 칼슘 및 AE 역학을 어떻게 조절하는지 조사하기 위한 연구를 수행할 수 있습니다. 또한 온도, pH, 다양한 이온 또는 소분자의 존재 또는 농도를 포함하여 환경 변화가 AE에 미치는 영향에 대한 연구를 수행할 수 있습니다.
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Disclosures
이 연구와 관련하여 보고할 이해 상충이 있는 저자는 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금 R01-HD093827 및 R03-HD090304(A.J.T)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x oil objective | Olympus Japan | UPlanApo, | |
| 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin | Sigma | C0926 | |
| 35 mm coverslip dish, 1.5 thickness | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL round-bottomed tube | Falcon | 352054 | |
| Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Confocal microscope | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Graduated tip | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Lactic acid | Sigma | G5889 | |
| Live-Cell Microscope Incubation Systems | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Plastic transfer pipette | FisherBrand | 13-711-6M | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| Single cell delivery system | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
References
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