Summary
В этом исследовании представлен простой в использовании, полный и простой набор методов для маркировки и анализа клубочков из почек мышей, очищенных с помощью CUBIC. Такие данные, как количество и объем клубочков, могут быть легко и надежно получены с помощью флуоресцеина изотиоцианата (FITC)-декстрана, флуоресцентной микроскопии со световым листом (LSFM) или обычной конфокальной микроскопии и программного обеспечения, такого как Imaris.
Abstract
Клубочки являются основными единицами в почках; Следовательно, изучение клубочков имеет решающее значение для понимания функции почек и патологии. Биологическая визуализация предоставляет интуитивно понятную информацию; Таким образом, большое значение имеет маркировка и наблюдение за клубочками. Однако используемые в настоящее время методы наблюдения клубочков требуют сложных операций, и результаты могут потерять детали меток или трехмерную (3D) информацию. Технология очистки тканей с четкой, беспрепятственной визуализацией мозга и вычислительным анализом (CUBIC) широко используется в почечных исследованиях, обеспечивая более точное обнаружение и большую глубину обнаружения. Мы обнаружили, что клубочки мышей могут быть быстро и эффективно помечены путем инъекции в хвостовую вену среднемолекулярного FITC-декстрана с последующим методом очистки CUBIC. Очищенная почка мыши может быть отсканирована с помощью светового микроскопа (или конфокального микроскопа при разрезе), чтобы получить трехмерные изображения всех клубочков во всей почке. Обработанные с помощью соответствующего программного обеспечения, сигналы клубочков могут быть легко оцифрованы и дополнительно проанализированы для измерения количества, объема и частоты клубочков.
Introduction
Количество и объем клубочков очень важны для диагностики и лечения различных заболеваний почек 1,2,3,4,5. Золотым стандартом оценки числа клубочков является комбинация физического диссектора и фракционатора. Однако этот метод требует специальных реагентов и оборудования, что делает его медленным и дорогим 6,7,8,9. Биопсия дает много информации, но очевидно, что этот метод подходит только для приблизительных оценок10,11. Технологии медицинской визуализации, в том числе магнитно-резонансная томография (МРТ), компьютерная томография (КТ) и рентгенография, также широко используются при выявлении клубочков 12,13,14,15, но такие технологии требуют громоздких инструментов. Новые методы, такие как масс-спектрометр16 с матричной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI) или метод толстых и тонких срезов17, также используются для обнаружения клубочков, хотя они остаются утомительными и трудоемкими.
С помощью технологий прозрачности можно наблюдать более глубокие глубины и получать более богатую и полную информацию из толстых тканей или даже целых органов 18,19,20,21,22,23. Поэтому технологии прозрачности широко используются в исследованиях почек24. Также участвуют наблюдение и обнаружение клубочков в очищенных почках. Однако в этих опубликованных статьях либо лишь вскользь упоминалось о обнаружении клубочков25, либо использовались труднодостижимые методы маркировки, такие как трансгенные животные26, самостоятельно производимые красители13 или инкубация высококонцентрированных антител27 для маркировки клубочков. Кроме того, несмотря на то, что в исследованиях анализировались клубочки в очищенных почках, анализы всегда были ограничены13 или основывались на алгоритмах анализа, установленных самими авторами26.
Ранее мы продемонстрировали более удобный способ маркировки клубочков в почках мышей28. Используя Imaris, мы обнаружили, что количество, частота и объем клубочков могут быть быстро получены. Таким образом, здесь мы представляем более доступный, полный и упрощенный набор методов для маркировки и анализа клубочков почек мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
В исследовании использовали взрослых мышей C57BL/6 (6-недельный возраст, 25-30 г). Все процедуры были выполнены в соответствии с местными правилами благополучия животных и экспериментальной этики. Исследование было одобрено Комитетом по этике биомедицинских исследований Западно-Китайской больницы Сычуаньского университета.
1. Маркировка клубочков и подготовка тканей
- Маркировка клубочков
- Растворите FITC-декстран (10 мг) в 1x фосфатно-солевом буфере (PBS) в соотношении 1:1 (1 мг: 1 мл) для приготовления рабочего зондового раствора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий раствор можно хранить при температуре 4 °C в течение 1 месяца. - Поместите мышь C57 в фиксатор вен хвоста мыши. Смочите марлю горячей водой, оберните марлей среднюю часть мышиного хвоста и прогревайте хвост в течение 1 минуты.
- Протрите хвост мыши 75% этиловым спиртом до тех пор, пока не станут видны левая и правая хвостовые вены.
- Наберите 100 мкл рабочего зондового раствора инсулиновым шприцем объемом 1 мл и медленно введите раствор в хвостовую вену мыши.
- После инъекции дайте раствору зонда циркулировать в течение 30 минут. Позвольте мышам свободно перемещаться в клетках.
- После достижения достаточного кровообращения мышей глубоко обезболивают внутрибрюшинным введением пентобарбитала натрия (1%, 60-80 мкг/кг).
- Растворите FITC-декстран (10 мг) в 1x фосфатно-солевом буфере (PBS) в соотношении 1:1 (1 мг: 1 мл) для приготовления рабочего зондового раствора.
- Забор и фиксация почки
- Прикрепите мышей под наркозом к анатомической пластине в положении лежа на спине. Закрепите их лапы медицинским скотчем.
- После подготовки кожи усыпляют мышей смертельной дозой пентобарбитала натрия (1%, 10 мг/кг).
- Сделайте разрез по средней линии живота, чтобы обнажить брюшную полость.
- Вскрыть почки и удалить их скальпелем и ножницами в вытяжном шкафу. Осторожно удалите почечную оболочку.
- Соберите почки и зафиксируйте их в 4% параформальдегиде (PFA) при температуре 4 °C на ночь.
- Промывают образцы ПБС три раза по 1 ч каждый при встряхивании при комнатной температуре (RT).
- Подготовьте почку к микроскопии.
- Нарежьте почку для конфокальной микроскопии: Нарежьте почку на ломтики толщиной 1 мм, используя матрицу мозга (сталь 1 мм, 40-75 г), чтобы стандартизировать толщину среза. Переложите ломтики в 4% PFA и продолжайте фиксацию при 4 °C в течение ночи.
- Целая почка для светолистовой микроскопии: Фиксируют почки в 4% PFA при 4 °C в течение 48 ч.
2. Клиринг
- Приготовление реагента
- Приготовьте реагент CUBIC-L, смешав 10% (масс./масс.) N-бутилдиэтаноламин, 10% (масс./массу) Triton X-100 и 80% ddH2O.
- Приготовьте реагент CUBIC-R, смешав 45% (масс./масс.) антипирина, 30% (масс./массу) никотинамида, 0,5% (об./об.) N-бутилдиэтаноламин и 24,5% ddH2O. Убедитесь, что раствор имеет рН 9,6-9,8 и показатель преломления (RI) 1,522.
ПРИМЕЧАНИЕ: CUBIC-L используется для расщепления, а CUBIC-R используется для согласования показателя преломления.
- Процедура клиринга
- Соберите образцы почек в центрифужную пробирку объемом 50 мл, а затем очистите их в CUBIC-L при встряхивании при 60 об/мин при 37 °C. Заменяйте CUBIC-L каждые 4 ч (для срезов почек) или каждые 24 ч (для всей почки) до достижения удовлетворительной оптической прозрачности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс занимает 1 день для срезов почки и 5 дней для целой почки. - Промывают образцы три раза в ПБС с легким встряхиванием при РТ в течение 1 ч каждый.
- Нанесите CUBIC-R на образцы, встряхивая образцы при 37 °C, 60 об/мин в течение 6 ч.
- Наблюдайте за очищенными образцами непосредственно или храните их в черных пробирках, наполненных CUBIC-R в RT, в течение 1 недели.
- Соберите образцы почек в центрифужную пробирку объемом 50 мл, а затем очистите их в CUBIC-L при встряхивании при 60 об/мин при 37 °C. Заменяйте CUBIC-L каждые 4 ч (для срезов почек) или каждые 24 ч (для всей почки) до достижения удовлетворительной оптической прозрачности.
3. Получение изображения
- Конфокальная визуализация
ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализируйте срезанные образцы почек с помощью конфокальной микроскопии (линзы: объектив Plan Apo λ 4×/0,2 N1 или объектив Plan Apo VC 10×/0,45 DIC N1). Получение больших изображений (например, 6052 мкм x 6052 мкм для среза почки) с помощью z-стеков.- Включите конфокальный микроскоп в следующей последовательности: мощность лазера, переключатель управления конфокальным микроскопом, компьютер, микроскоп и конфокальное оборудование. После запуска самодиагностики включите конфокальное программное обеспечение.
- Выберите подходящий объектив. Извлеките образец из реагента CUBIC-R, поместите его в конфокальную чашку и накройте крышкой, чтобы предотвратить высыхание реагента CUBIC-R.
- Переместите образец в середину поля зрения и отрегулируйте фокальную плоскость до тех пор, пока он не окажется в фокусе.
- Примените 3D-реконструкцию (шаг 3.1.4.1) и реконструкцию большого изображения (шаги 3.1.4.2-3.1.4.3).
- 3D-реконструкция (конфокальная): переключение плоскости масштабирования в одном направлении до тех пор, пока флуоресценция не будет видна; Эта позиция определяется как вершина. Затем переключите плоскость зума в противоположном направлении, пока флуоресценция не исчезнет; Это положение определяется как дно. Нажмите кнопку «Выполнить » в правом нижнем углу диалогового окна, чтобы начать сканирование.
- Реконструкция большого изображения (конфокальная): переместите поле зрения в середину образца и установите текущее положение в качестве центра. Выберите поле зрения 2 x 2.
- В многофункциональном интерфейсе ND выберите стек Z для реконструкции больших изображений и задайте различные параметры на панели. Затем нажмите кнопку Run butto n, чтобы начать сканирование.
- Визуализация световой листовой флуоресцентной микроскопии (LSFM)
ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализируйте почки целиком с помощью светолистового флуоресцентного микроскопа (объектив: объектив EC Plan-Neofluar 5x/0,16 (средний n = 1,529)).- Прикрепление образца (LSFM):
- Приклейте прозрачную почку к адаптеру для фиксации образца и подождите, пока почка прочно закрепится.
- Замочите почку в контейнере для образцов и вставьте контейнер для образцов в систему микроскопа. Закройте люк.
- Наблюдение и сканирование (LSFM):
- В интерфейсе Locate (Местоположение ) переместите образец в подходящую позицию для наблюдения. Переключитесь на интерфейс Acquisition , установите оптический путь, выберите лазер 488 нм, LBF 405/488/561/640, блок фильтра оптического расщепления SBS LP 490, выберите Camera 2 и измените псевдоцвет на зеленый.
- Введите значение Смещение по оси Z влево/вправо , записанное ранее в подменю Канал . Выберите наименьший зум (0,36) и настройте его для максимальной четкости.
- Найдите границу X\Y и диапазон Z всего органа. Отрегулируйте интенсивность лазера и время экспозиции (желательно менее 10 мс) и нажмите кнопку «Выполнить », чтобы начать.
- Если ткань слишком большая, объедините два или более изображений с помощью сшивания изображений. Откройте отснятый файл с помощью программного обеспечения для микроскопии (в данном случае ZEISS ZEN 3.7). Выберите Метод обработки > > Сшивание > параметр Метод > Применить для завершения сшивания изображений.
- Прикрепление образца (LSFM):
4. Обработка и количественная оценка данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Обработайте стеки изображений с помощью программного обеспечения Imaris (анализ изображений), используя функцию Surface для маркировки клубочков и выполнения анализа.
- Граф клубочков
- Импортируйте большие изображения (конфокальная микроскопия) или сшитые изображения (световая микроскопия) в программное обеспечение для анализа изображений.
- Откройте файлы в программном обеспечении для анализа изображений. Нажмите кнопку "Поверхность ", чтобы создать новое покрытие. Следуйте инструкциям в левой нижней части экрана.
- Нажмите кнопку «Далее » (кнопка со стрелкой вправо), ничего не отмечая.
- Поставьте галочку напротив опции Сглаживание и введите соответствующее число (например, 14.5) для управления детализацией Покрытия. Выберите «Вычитание фона » в поле «Пороговое значение » и заполните поле приблизительным средним диаметром клубочков. Нажмите кнопку Далее .
- При необходимости отрегулируйте и нажмите кнопку «Далее ». Выберите нужный диапазон и нажмите кнопку Далее , чтобы создать Покрытие.
- Нажмите кнопку «Фильтр», затем кнопку «Добавить», чтобы добавить «Сферичность» для фильтрации несферических объектов. Нажмите кнопку "Дублировать", чтобы скопировать это новое покрытие.
- Нажмите кнопку «Статистика », затем нажмите кнопку «Общие »; программное обеспечение представит количество клубочков в виде общего количества поверхностей.
- Объем клубочков
- Создайте поверхность клубочков, как указано выше.
- Когда Покрытие будет готово, нажмите кнопку Выделения , чтобы выбрать целевые объекты и представить объем каждого объекта. Нажмите кнопку «Сохранить » и экспортируйте статистику в электронную таблицу для дальнейшего анализа.
- Объем среза или целой почки
- Импортируйте большие изображения (конфокальная микроскопия) или сшитые изображения (световая микроскопия) в программное обеспечение для анализа изображений.
- Откройте файлы в программном обеспечении для анализа изображений. Нажмите кнопку "Поверхность ", чтобы создать новое покрытие. Следуйте инструкциям в левой нижней части экрана.
- Нажмите кнопку «Далее » (кнопка со стрелкой вправо) без галочки.
- Поставьте галочку напротив опции Сглаживание и введите соответствующее число (например, 50) для управления детализацией Покрытия. Выберите Абсолютная интенсивность в пороговом значении. Нажмите кнопку Далее .
- Отрегулируйте Поверхность до тех пор, пока она не покроет всю ткань, и нажмите кнопку Далее . Нажмите кнопку "Далее " для создания покрытия.
- Нажмите кнопку Выделение , чтобы выбрать Поверхность всей ткани и представить объем ткани. Нажмите кнопку Сохранить , чтобы экспортировать статистику в электронную таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Это исследование представляет собой простой и эффективный метод маркировки и анализа клубочков в почках мышей.
Клубочки (кровеносные сосуды) могут быть хорошо помечены внутрисосудистым введением FITC-Dextran. После процесса очищения почка становилась прозрачной (рис. 1А), и клубочки можно было четко наблюдать с помощью световой микроскопии (рис. 1В) или конфокальной микроскопии (рис. 1С). Конфокальная микроскопия имеет ограниченную глубину сканирования, поэтому почки следует разрезать на ломтики толщиной примерно 1 мм. Если используется световой микроскоп, то можно отсканировать всю почку напрямую.
По четким сигналам легко было посчитать количество клубочков. На самом деле, маркировка была настолько эффективной, что клубочки можно было сосчитать невооруженным глазом. Объем клубочков также можно измерить напрямую. Конечно, такое программное обеспечение, как Imaris, значительно ускорило этот процесс. С помощью функции Surface можно выбрать все клубочки в почечном срезе (рис. 2), во всей почке (рис. 3) или в полоске (рис. 4), а также получить количество и объем клубочков непосредственно (рис. 2C, рис. 3C, рис. 4C). Также можно измерить объем выбранной области (рис. 2B, рис. 3B, рис. 4B), таким образом, можно рассчитать объемное соотношение и частоту клубочков в определенном участке или во всей почке (рис. 2D, рис. 3D, рис. 4D). Область почки может быть выбрана для выполнения расчетов в определенных областях. Мы представили полоску, похожую на биопсию. Количество, объем и частоту клубочков в полоске также можно легко определить (рис. 4).
Как показано на рисунках, результаты, представленные в этом исследовании, следующие (N = число, F = частота, V = объем, V(a) = средний объем, V(t) = общий объем):
Nклубочков в срезе = 1128, Nклубочков в целой почке = 14006, Fклубочков в срезе = 65 намм3, Fклубочков в цельной почке = 105 намм3, Vклубочков в срезе/Vсрезе = 2,24%, Vклубочков в цельной почке/Vпочки = 5,54%, V(a)клубочков в срезе = 373654 мкм3, V(a)клубочков в цельной почке = 521627 мкм3, V(t)клубочки в срезе = 421481724мкм3, V(t)клубочки в цельной почке = 7305386256 мкм3 (рис. 2D, рис. 3D).
Nклубочков в полосе = 63, Fклубочков в полосе = 72 намм3, Vклубочков в полосе/Vполосы = 2,23%, V(a)клубочков в полосе = 307698 мкм3, V(t)клубочков в полосе = 19384977 мкм3 (рис. 4D).
Рисунок 1: Прозрачность почечной ткани и клубочки, меченные FITC-декстраном. (А) Почки до и после лечения прозрачностью. (B) Изображение целой почки, отсканированное с помощью LSFM. (C) Изображение среза почки, отсканированное с помощью конфокального микроскопа (слева: 4x, справа: 10x). масштабная линейка = 300 мкм (4x, конфокальный); масштабная линейка = 100 мкм (10x, конфокальная).; масштабная линейка = 700 мкм (5x, зум 0,36, LSFM). Клубочки были помечены FITC-декстраном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Функция Surface, применяемая к конфокальному сканируемому срезу почки. (А) Создается поверхность среза и все клубочки. Розовый = клубочки, синий = внешняя поверхность почечного среза, зеленый = первоначальная метка сосудов (клубочков и некоторых крупных сосудов). Масштабная линейка = 300 мкм. (B) Когда выбрана поверхность среза (слева) или клубочки (справа) (выбранные объекты станут желтыми), данные могут быть получены напрямую (пунктирная рамка выделена там, где показаны данные). (С) Количество, объем каждого отдельного клубочка и объем всего клубочков могут быть получены непосредственно, так же как и объем среза. (D) Экспортированные данные могут быть дополнительно проанализированы с целью расчета, например, среднего объема клубочков и объемного отношения клубочков и выбранной площади. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Функция Surface, применяемая к LSFM, сканируемой целой почкой. (А) Создается поверхность всей почки и всех клубочков. Розовый = клубочки, синий = поверхность всей почки, зеленый = первоначальная метка сосудов (клубочков и некоторых крупных сосудов). Масштабная линейка = 1000 мкм. (B) Когда выбрана поверхность почки (слева) или клубочка (справа) (выбранные объекты станут желтыми), данные могут быть получены напрямую (пунктирная рамка выделена там, где показаны данные). В) Количество, объем каждого клубочка и количество клубочков могут быть получены непосредственно, так же как и объем почки. (D) Экспортированные данные могут быть дополнительно проанализированы для того, чтобы можно было произвести расчет, например, средний объем клубочков и объемное соотношение клубочков и всей почки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Функция Surface, примененная к выбранной полоске почки. (A) Поверхность полосы и все клубочки созданы. Розовый = клубочки, синий = внешняя поверхность почечной полосы, зеленый = первоначальная метка сосудов (клубочков и некоторых крупных сосудов). Масштабная линейка = 150 мкм. (B) Когда выбрана поверхность полосы (слева) или клубочки (справа) (выбранные объекты станут желтыми), данные могут быть получены напрямую (пунктирная рамка выделена там, где отображаются данные). (С) Количество, объем каждого отдельного клубочка и объем всего клубочков могут быть получены непосредственно, так же как и объем полосы. (D) Экспортированные данные могут быть дополнительно проанализированы с целью расчета, например, среднего объема клубочков и объемного отношения клубочков и выбранной площади. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Тканевые очистительные технологии можно разделить на 3 или 4 группы 29,30,31. Очищение тканей на основе органических растворителей (например, DISCO и PEGASOS), очищение тканей на водной основе (например, CUBIC) и очистка тканей с внедрением гидрогеля (например, CLARITY) были применены при очищении почек 25,26,28,32. CUBIC, как мы показали, работает лучше всего, когда клубочки (сосуды) помечены FITC-Dextran. Кроме того, CUBIC имеет относительно более удобный процесс работы и требует не больше, чем обычные микроскопические линзы27, так как обработанные образцы не нужно замачивать в органических реагентах33. Тем не менее, различные методы очистки и методы маркировки судов имеют свои преимущества и недостатки; Исследователям, возможно, придется поэкспериментировать с различными подходами, чтобы удовлетворить свои конкретные потребности.
Предыдущие исследования показали, что клубочки могут быть помечены в очищенных почках, когда кровеносные сосуды в почках были помечены 13,25,26,28. Тщательное объяснение этого явления все еще нуждается в дальнейшем исследовании, но можно сделать вывод, что хороший метод маркировки для сосудистой системы также эффективно маркирует клубочки. Основываясь на результатах экспериментов, мы рекомендуем внутрисосудистое введение FITC-Dextran со средней молекулярной массой (например, 150 кДа). Однако, поскольку маркировка зависит от кровообращения, этот метод может не пометить клубочки, когда у них отсутствует кровообращение.
LSFM позволяет проводить крупномасштабное наблюдение за тканями, что делает его более подходящим для обнаружения клубочков всей почки. Тем не менее, световые микроскопы могут быть доступны не в каждой лаборатории. Таким образом, мы предоставляем альтернативный набор протоколов с использованием обычных конфокальных микроскопов. Несмотря на то, что почка должна быть разрезана на несколько частей, получение таких данных, как количество и объем клубочков во всей почке, вполне осуществимо. Кроме того, конфокальная микроскопия обеспечивает меньший объем данных, что более удобно для обработки данных.
Imaris обеспечивает прямой вывод данных. Тем не менее, следует позаботиться о том, чтобы аналоговый сигнал точно соответствовал оригиналу. Кроме того, программное обеспечение может долго обрабатывать большие файлы, что может раздражать. До тех пор, пока клубочки могут быть четко обозначены и визуализированы, существует более чем одно уникальное решение для анализа данных. Исследователи из разных лабораторий могли работать со своим привычным программным обеспечением и языками программирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантами Национального фонда естественных наук Китая (82204951) и Сычуаньской научно-технической программы (2020JDRC0102).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | Biosharp | 7007171800 | Fixation reaagen |
| 502 Glue | Deli | 7146 | For fixing the kidney to the sample fixing adapter |
| Antipyrine | Aladdin | A110660 | Clearing reagent |
| Brain Matrix | RWD Life Science | 1mm 40-75 | Tissue slicing |
| Confocal microscopy | Nikon | A1plus | Image acquisition |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S | Labeling reagent |
| Light sheet fluorescence microscopy | Zeiss | Light sheet 7 | Image acquisition |
| Mice | Ensiweier | Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) | |
| N-Butyldiethanolamine | Aladdin | B299095 | Clearing reagent |
| Nicotinamide | Aladdin | N105042 | Clearing reagent |
| Pentobarbital Natriumsalz | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Tail vein fixator | JINUOTAI | JNT-FS35 | Fix the mouse for vail injection |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Clearing reagent |
References
- Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
- Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatric Nephrology. 26 (9), 1529-1533 (2011).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
- Rasch, R. Prevention of diabetic glomerulopathy in streptozotocin diabetic rats by insulin treatment. Kidney size and glomerular volume. Diabetologia. 16 (2), 125-128 (1979).
- Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2011).
- Bertram, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29, 575-580 (2014).
- Bertram, J. F., Soosaipillai, M. C., Ricardo, S. D., Ryan, G. B. Total numbers of glomeruli and individual glomerular cell types in the normal rat kidney. Cell and Tissue Research. 270 (1), 37-45 (1992).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Bertram, J. F. Analyzing renal glomeruli with the new stereology. International Review of Cytology. 161, 111-172 (1995).
- Lødrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
- Lane, P. H., Steffes, M. W., Mauer, S. M. Estimation of glomerular volume: a comparison of four methods. Kidney International. 41 (4), 1085-1089 (1992).
- Baldelomar, E. J., Charlton, J. R., deRonde, K. A., Bennett, K. M. In vivo measurements of kidney glomerular number and size in healthy and Os(/+) mice using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 317 (4), F865-F873 (2019).
- Huang, J., et al. A cationic near infrared fluorescent agent and ethyl-cinnamate tissue clearing protocol for vascular staining and imaging. Scientific Reports. 9 (1), 521 (2019).
- Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
- Basgen, J. M., Steffes, M. W., Stillman, A. E., Mauer, S. M. Estimating glomerular number in situ using magnetic resonance imaging and biopsy. Kidney International. 45 (6), 1668-1672 (1994).
- Prentice, B. M., Caprioli, R. M., Vuiblet, V.
- Sanden, S. K., Wiggins, J. E., Goyal, M., Riggs, L. K., Wiggins, R. C. Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms' tumor-1 protein used as a podocyte nuclear marker. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (10), 2484-2493 (2003).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Lloyd-Lewis, B., et al. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 18 (1), 127 (2016).
- Ren, Z., et al. CUBIC-plus: An optimized method for rapid tissue clearing and decolorization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 568, 116-123 (2021).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
- Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
- Zhu, J., et al. Optimal combinations of fluorescent vessel labeling and tissue clearing methods for three-dimensional visualization of vasculature. Neurophotonics. 9 (4), 045008 (2022).
- Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Bai, L., et al. A simple and effective vascular network labeling method for transparent tissues of mice. Journal of Biophotonics. 16 (7), e202300042 (2023).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. J. I. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. Iscience. 238 (2), 489-507 (2021).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Du, H., Hou, P., Zhang, W., Li, Q. Advances in CLARITY-based tissue clearing and imaging. Experimental and Therapeutic. 16 (3), 1567-1576 (2018).
- Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 89, e51382 (2014).
