Qualitative und quantitative Analyse der Siderophorproduktion aus Pseudomonas aeruginosa

Milan Rathod; Hiral Patel; Devarshi Gajjar

doi:10.3791/65980

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Methodenartikel

Qualitative und quantitative Analyse der Siderophorproduktion aus Pseudomonas aeruginosa

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DOI:

10.3791/65980

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15. März 2024

Milan Rathod¹ , Hiral Patel¹ , Devarshi Gajjar¹

¹Department of Microbiology and Biotechnology Centre, Faculty of Science, The Maharaja Sayajirao University of Baroda

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet sowohl qualitative als auch quantitative Analysen von Gesamtsiderophoren, Pyoverdin und Pyochelin aus Pseudomonas aeruginosa.

Zusammenfassung

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) ist dafür bekannt, dass er eine Vielzahl von Virulenzfaktoren produziert, um Infektionen im Wirt zu etablieren. Ein solcher Mechanismus ist das Abfangen von Eisen durch Siderophorproduktion. P. aeruginosa produziert zwei verschiedene Siderophore: Pyochelin, das eine geringere Eisenchelat-Affinität aufweist, und Pyoverdin, das eine höhere Eisenchelat-Affinität aufweist. Dieser Bericht zeigt, dass Pyoverdin direkt aus bakteriellen Überständen quantifiziert werden kann, während Pyochelin vor der Quantifizierung aus Überständen extrahiert werden muss.

Die primäre Methode zur qualitativen Analyse der Siderophorproduktion ist der Chrom-Azurolsulfonat-Agarplatten-Assay (CAS). In diesem Assay führt die Freisetzung des CAS-Farbstoffs aus dem^Fe3+-Farbstoffkomplex zu einem Farbwechsel von Blau zu Orange, was auf eine Siderophorproduktion hinweist. Für die Quantifizierung der gesamten Siderophore wurden bakterielle Überstände zu gleichen Teilen mit CAS-Farbstoff in einer Mikrotiterplatte gemischt, gefolgt von einer spektrophotometrischen Analyse bei 630 nm. Pyoverdin wurde direkt aus dem bakteriellen Überstand quantifiziert, indem es zu gleichen Teilen mit 50 mM Tris-HCl gemischt wurde, gefolgt von einer spektrophotometrischen Analyse. Ein Peak bei 380 nm bestätigte das Vorhandensein von Pyoverdin. Was Pyochelin betrifft, so war eine direkte Quantifizierung aus dem bakteriellen Überstand nicht möglich, so dass es zuerst extrahiert werden musste. Die anschließende spektrophotometrische Analyse ergab das Vorhandensein von Pyochelin mit einem Peak bei 313 nm.

Einleitung

Organismen benötigen Eisen, um verschiedene lebenswichtige Funktionen zu erfüllen, wie z. B. den Elektronentransport und die DNA-Replikation¹. Es ist bekannt, dass Pseudomonas aeruginosa, ein gramnegativer opportunistischer Erreger, eine Vielzahl von Virulenzfaktoren besitzt, um eine Infektion im Wirt zu etablieren, von denen ein Mechanismus die Siderophorbildung^{ist 2}. Unter eisenabbauenden Bedingungen setzt P. aeruginosa spezialisierte Moleküle frei, die als Siderophore bezeichnet werden und Eisen aus der Umgebung abschrecken. Siderophore chelatieren Eisen extrazellulär, und der resultierende Eisen-Sid....