Bu protokol, Pseudomonas aeruginosa'dan toplam sideroforlar, pyoverdin ve pyochelin'in hem kalitatif hem de kantitatif analizlerini sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Pseudomonas aeruginosa'dan Siderofor Üretiminin Kalitatif ve Kantitatif Analizi
Bu makalede
Özet
Özet
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), konakçıda enfeksiyon oluşturmak için çok çeşitli virülans faktörleri üretmesiyle bilinir. Böyle bir mekanizma, siderofor üretimi yoluyla demirin temizlenmesidir. P. aeruginosa iki farklı siderofor üretir: daha düşük demir şelatlama afinitesine sahip pyochelin ve daha yüksek demir şelatlama afinitesine sahip pyoverdine. Bu rapor, pyoverdin'in bakteriyel süpernatantlardan doğrudan ölçülebildiğini, piyochelin'in ise nicelemeden önce süpernatantlardan ekstrakte edilmesi gerektiğini göstermektedir.
Siderofor üretimini kalitatif olarak analiz etmek için birincil yöntem, Krom Azurol Sülfonat (CAS) agar plakası testidir. Bu tahlilde, Fe3+-Boya kompleksinden CAS boyasının salınması, maviden turuncuya bir renk değişimine yol açarak siderofor üretimini gösterir. Toplam sideroforların miktar tayini için, bakteriyel süpernatantlar bir mikrotitre plakasında CAS boyası ile eşit oranlarda karıştırıldı, ardından 630 nm'de spektrofotometrik analiz yapıldı. Pyoverdine, 50 mM Tris-HCl ile eşit oranlarda karıştırılarak bakteri süpernatantından doğrudan ölçüldü ve ardından spektrofotometrik analiz yapıldı. 380 nm'de bir zirve, pyoverdine'in varlığını doğruladı. Pyochelin'e gelince, bakteriyel süpernatanttan doğrudan miktar tayini mümkün değildi, bu yüzden önce ekstrakte edilmesi gerekiyordu. Daha sonraki spektrofotometrik analiz, 313 nm'de bir tepe noktası ile piyochelin varlığını ortaya çıkardı.
Giriş
Organizmalar, elektron taşınması ve DNA replikasyonu gibi çeşitli hayati işlevleri yerine getirmek için demire ihtiyaç duyar1. Gram-negatif fırsatçı bir patojen olan Pseudomonas aeruginosa'nın, konakçıda enfeksiyon oluşturmak için çeşitli virülans faktörlerine sahip olduğu bilinmektedir, bunlardan biri siderofor oluşumudur2. Demir tüketen koşullar sırasında, P. aeruginosa , çevredeki demiri söndüren siderofor adı verilen özel molekülleri serbest bırakır. Sideroforlar demiri hücre dışı olarak şelatlar ve ortaya çıkan ferrik-siderofor kompleksi aktif olarak hücre3'e geri taşınır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
P. aeruginosa'nın tüm bakteri izolatları, Hindistan'ın Vadodara ve Jaipur kentindeki tıbbi mikrobiyoloji laboratuvarlarından elde edilmiştir. Seçilen tüm klinik izolatlar Biyogüvenlik Kabini'nde (BSL2) ele alındı ve deneyler sırasında bakteri izolatları kullanılırken azami özen gösterildi. Tüm reaktiflerin/çözeltilerin ticari detayları Malzeme Tablosunda verilmiştir.
1. Krom Azurol Sülfonat (CAS) boya ve agar ortamının hazırlanması
- Aşağıdaki bileşimle CAS boyasını (100 mL) hazırlayın:
- 60 mg CAS'ı 50 mL damıtılmış suda çözün (Çözelti 1).
- 2.7 mg FeCl3·6H2O'yu 10mL 10 ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Klinik izolatlardan sideroforların miktar tayini yapılmadan önce, siderofor üretimini sağlamak için siderofor üretimi için kalitatif bir tarama yapıldı. Klinik izolatlardan sideroforların kalitatif tespiti, CAS agar plakaları üzerinde çizgi oluşturan bakterilerle gözlenmiştir. Çalışma için MR1, TL7, J3 ve PAO1 (referans suş) olmak üzere üç klinik izolat seçildi. Her üç klinik izolat ve PAO1, mavi agar yüzeyindeki bakteri üremesinin etrafındaki berrak turuncu bir halenin pozitif siderofor .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, araştırmacıların toplam sideroforları ve P. aeruginosa'nın iki farklı sideroforunu, yani pyoverdine ve pyochelin'i, bakteriyel hücresiz süpernatanttan ölçmelerini sağlar. CAS agar plakaları tahlilinde, CAS boyası ve Fe3+ iyonları bir kompleks oluşturur. Bakteriler sideroforlar ürettiğinde, CAS-Fe3+ kompleksinden Fe3+ iyonlarını söndürürler ve bakteri büyümesi etrafında bir renk değişikliğine yol açarlar. Bu değişiklik, bakteri üremesi14,15
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Yazarlar, DBT - Biyoteknoloji Öğretim Programı, DBT - BUILDER Programı ve FIST'ten fon aldığını kabul eder. MR teşekkür bursu SHODH'dan alındı. HP, CSIR'den alınan burs sayesinde teşekkür etti.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Agar Agar, Tip I | HIMEDIA | GRM666 | |
| 8-Hidroksikinolin | Loba Chemie | 4151 | |
| Kaamino Asit | SRL Kimyasalları | 68806 | |
| Setiltrimetil Amonyum Bromür (CTAB) | HIMEDIA | RM4867-100G | |
| Kloroform | Merck | 1070242521 | |
| Krom azurol sülfonat | HIMEDIA | RM336-10G | |
| Sitrik asit | Merck | 100241 | |
| Dekstroz monohidrat | Merck | 108342 | |
| Diklorometan | Merck | 107020 | |
| Ferrik klorür hekzahidrat | HIMEDIA | GRM6353 | |
| Cam Şişeler | Borosil | 5100021 | |
| Cam Test tüpleri | Borosil | 9820U05 | |
| Hidroklorik asit | SDFCL | 20125 | |
| King'in orta B tabanı | HIMEDIA | M1544-500G | |
| M9 Minimal Orta Tuzlar | HIMEDIA | G013-500G | |
| Magnezyum Sülfat | Qualigens | 10034 | |
| MultiskanGO UV Spektrofotometre | Thermo Scientific | 51119200 | |
| Pepton Tip I, Bakteriyolojik | HIMEDIA | RM667-500G | |
| BORULAR serbest asit | MP Biyomedikal | 190257 | |
| Potasyum dihidrojen fosfat | Merck | 1048731000 | |
| Proteoz pepton | HIMEDIA | RM005-500G | |
| Shimadzu UV-Vis Spektrofotometre | Shimadzu | 2072310058 | |
| Sigma Laborzentrifuge | Sigma-Aldrich | 3-18K | |
| Sodyum klorür | Qualigens | 15915 |
Kaynaklar
- Wang, J., Pontopolous, K. Regulation of iron cellulatar metabolism. Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).
- Schalk, I., Perraud, Q. Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron. Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022). ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
