Summary
We presenteren een geautomatiseerde methode voor het karakteriseren van de effectieve elastische modulus van een oculaire lens met behulp van een compressietest.
Abstract
De biomechanische eigenschappen van de oculaire lens zijn essentieel voor zijn functie als optisch element met variabel vermogen. Deze eigenschappen veranderen dramatisch met de leeftijd in de menselijke lens, wat resulteert in een verlies van dichtbij zien, presbyopie genaamd. De mechanismen van deze veranderingen blijven echter onbekend. Lenscompressie biedt een relatief eenvoudige methode om de biomechanische stijfheid van de lens in kwalitatieve zin te beoordelen en kan, in combinatie met geschikte analytische technieken, helpen bij het kwantificeren van biomechanische eigenschappen. Tot nu toe zijn er verschillende lenscompressietests uitgevoerd, zowel handmatig als geautomatiseerd, maar deze methoden passen inconsistent belangrijke aspecten van biomechanische tests toe, zoals preconditionering, belastingssnelheden en tijd tussen metingen. Dit artikel beschrijft een volledig geautomatiseerde lenscompressietest waarbij een gemotoriseerde tafel wordt gesynchroniseerd met een camera om de kracht, verplaatsing en vorm van de lens vast te leggen via een voorgeprogrammeerd laadprotocol. Op basis van deze gegevens kan vervolgens een karakteristieke elasticiteitsmodulus worden berekend. Hoewel hier gedemonstreerd met behulp van varkenslenzen, is de aanpak geschikt voor de compressie van lenzen van elke soort.
Introduction
De lens is het transparante en flexibele orgaan in het oog waarmee het op verschillende afstanden kan scherpstellen door het brekingsvermogen te veranderen. Dit vermogen staat bekend als accommodatie. Het brekingsvermogen verandert door de samentrekking en ontspanning van de ciliaire spier. Wanneer de ciliaire spier samentrekt, wordt de lens dikker en beweegt naar voren, waardoor het brekingsvermogen toeneemt 1,2. Door de toename van het brekingsvermogen kan de lens scherpstellen op objecten in de buurt. Naarmate mensen ouder worden, wordt de lens stijver en gaat dit vermogen om zich aan te passen geleidelijk verloren; Deze aandoening staat bekend als presbyopie. Het mechanisme van verstijving blijft onbekend, althans gedeeltelijk vanwege de moeilijkheden die gepaard gaan met de biomechanische karakterisering van de lens.
Er zijn verschillende methoden gebruikt om de stijfheid en biomechanische eigenschappen van brillenglazen te schatten. Deze omvatten lensrotatie 3,4,5, akoestische methoden 6,7,8, optische methoden zoals Brillouin-microscopie9, inkeping10,11 en compressie12,13. Compressie is de meest toegankelijke experimentele techniek omdat het kan worden uitgevoerd met eenvoudige instrumentatie (bijv. glazen dekglaasjes14,15) of een enkele gemotoriseerde trap. We hebben eerder laten zien hoe de biomechanische eigenschappen van de lens rigoureus kunnen worden geschat op basis van een compressietest16. Dit proces is technisch uitdagend en vereist gespecialiseerde software die niet gemakkelijk toegankelijk is voor lensonderzoekers die geïnteresseerd zijn in relatieve stijfheidsmetingen. Daarom richten we ons in de huidige studie op toegankelijke methoden voor het schatten van de elastische modulus van de lens, rekening houdend met de lensgrootte. De elasticiteitsmodulus is een intrinsieke materiaaleigenschap die verband houdt met de vervormbaarheid: een hoge elasticiteitsmodulus komt overeen met een stijver materiaal.
De test zelf is een parallelle plaatcompressietest en kan daarom worden uitgevoerd op geschikte commerciële mechanische testsystemen. Hier werd een op maat gemaakt instrument geconstrueerd dat bestond uit een motor, lineaire trap, bewegingscontroller, loadcel en versterker. Deze werden bestuurd met behulp van aangepaste software die ook tijd, positie en belasting met regelmatige tussenpozen registreerde. De lenzen van het varken zijn niet geschikt, maar zijn gemakkelijk toegankelijk en goedkoop17. De volgende methode is ontwikkeld om de ooglens stapsgewijs samen te drukken en de elastische modulus te kwantificeren. Deze methode kan gemakkelijk worden gerepliceerd en zal nuttig zijn bij het bestuderen van lensstijfheid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Varkensogen werden verkregen van een plaatselijk slachthuis. Er waren geen goedkeuringen van ethische commissies vereist.
1. Lensdissectie (Figuur 1)
- Verwijder al het omringende weefsel uit de varkensogen en overtollig vlees uit de sclera, totdat alleen de oogzenuw overblijft. Gebruik een gebogen pincet en een kleine dissectieschaar om dit proces te voltooien. Gebruik de zenuw als anker om het oog vast te houden tijdens dissectie.
- Maak met een scalpel een korte omtreksnede bij de limbus en vervolgens een andere bij de evenaar.
NOTITIE: Deze stap wordt in deze volgorde uitgevoerd om beschadiging van de lens en de capsule te voorkomen. - Steek een microschaar in de snee bij de limbus en verwijder het hoornvlies door het hoornvlies op te tillen met een fijne tang met stompe punt terwijl u rond de omtrek van het hoornvlies knipt.
- Verwijder de iris door deze op te tillen met een stompe pincet en knip weg met een microschaar.
- Steek een dissectieschaar in de equatoriale snede en knip vervolgens in de omtrek rond de hele evenaar totdat de sclera in tweeën is gedeeld.
- Zodra de snede is voltooid, verwijdert u het achterste deel van de sclera. Verwijder het glasvocht voorzichtig met een pincet en laat minimale restanten achter om beschadiging van de lens te voorkomen. Snijd indien nodig het glasvocht coronaal door zodat het achterste deel zich kan terugtrekken van de lens en het voorste segment.
- Maak een meridionale snede door de sclera van anterieur naar posterieur met behulp van een microschaar.
- Begin bij de nieuwe meridionale snede door de sclera en gebruik een microschaar om de zonules weg te knippen van de lens. Gebruik het gewicht van de lens of de rand van de dissectieschotel om de zonules voorzichtig uit te rekken wanneer u de lens en de sclera iets uit elkaar trekt, zodat de microschaar tussen de lens en het corpus ciliare, door de zonules en rond de omtrek van de lens kan snijden. Dit isoleert de lens zonder het lenskapsel te beschadigen als het correct wordt gedaan.
- Verwijder desgewenst de capsule met een pincet om de capsule op de evenaar te doorboren en trek de capsule vervolgens weg met een pincet.
- Plaats de lens in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Inspecteer de lens visueel op eventuele schade voorafgaand aan mechanische tests.
2. Lenscompressie met/zonder lenscapsule (Afbeelding 2)
OPMERKING: Alle stappen hier, met uitzondering van de stappen 2.1 en 2.4, zijn computergestuurd.
- Verkrijg of bouw een parallel plaatcompressieapparaat met een loadcel met een krachtcapaciteit van 50 gram en de mogelijkheid om de verplaatsing in de orde van grootte van 1 μm te meten.
- Programmeer de gemotoriseerde tafel en laad de cel om het hieronder beschreven laadregime uit te voeren (bijv. Aanvullend bestand 1).
- Vul bijna een vierkante doos van 1 5/8 inch x 1 5/8 inch met PBS en plaats deze op het compressieplatform.
- Laat de bovenste plaat in contact met de onderste plaat zakken om de ondergrens van de beweging en de absolute spleethoogte te bepalen.
- Verhoog de bovenste plaat met ~15 mm.
- Centreer de lens in de doos en zorg ervoor dat het equatoriale vlak horizontaal is.
- Laat de bovenste plaat dicht bij, maar niet in contact met, het bovenoppervlak van de lens zakken.
- Start een beweging om de bovenste plaat in contact te brengen met de lens, met behulp van force feedback met een contactdrempel van 3 mN.
- Begin met het registreren van de gegevens na het bepalen van het contact, de registratietijd, de positie van de bovenste plaat ten opzichte van de onderste plaat en de kracht bij 500 Hz.
- Pas een preconditioneringsbelasting toe waarbij de lens drie keer wordt samengedrukt met 2,5% van de oorspronkelijke hoogte, vervolgens drie keer 5% en vervolgens drie keer 7,5% met een snelheid van 1%/s.
- Houd de positie van de bovenste plaat constant gedurende 1 minuut na het voorconditioneren.
- Pas een compressie van 15% toe met een snelheid van 1%/s, gevolgd door lossen met dezelfde snelheid.
- Ga door met de ontlaadbeweging totdat de bovenste plaat nog eens 2% van de onbelaste lensdikte van de bodemplaat heeft afgelegd om ervoor te zorgen dat de lens van de bovenste plaat is losgemaakt.
3. Schatting van de lensmodulus
- Schat de dikte van de lens op basis van de opening van het instrument op het contactpunt. U kunt ook beeldanalyse gebruiken om de dikte te meten van een foto die vóór het testen is gemaakt.
- Bereken de elasticiteitsmodulus E met behulp van het Hertz-model voor compressie van een bol tussen evenwijdige platen (vergelijking [1]; Aanvullend dossier 2).
(1)
Waarbij R de kromtestraal op het contactpunt is (verondersteld gelijk te zijn aan de helft van de lensdikte); F is de compressiekracht die door de loadcel wordt gerapporteerd;
is de Poisson-verhouding (verondersteld gelijk aan 0,5 overeen te komen met een onsamendrukbaar materiaal); en u is de neerwaartse benadering van de bovenste trap vanaf het contactpunt. Merk op dat de elasticiteitsmodulus en de Poisson-verhouding materiaaleigenschappen zijn die respectievelijk de intrinsieke stijfheid van de lens en de relatieve samendrukbaarheid van de lens aangeven.
OPMERKING: Deze methode negeert elke rol van het lenskapsel, maar houdt bij benadering rekening met de grootte van de lens, waardoor vergelijking tussen soorten mogelijk is.
(1)
is de Poisson-verhouding (verondersteld gelijk aan 0,5 overeen te komen met een onsamendrukbaar materiaal); en u is de neerwaartse benadering van de bovenste trap vanaf het contactpunt. Merk op dat de elasticiteitsmodulus en de Poisson-verhouding materiaaleigenschappen zijn die respectievelijk de intrinsieke stijfheid van de lens en de relatieve samendrukbaarheid van de lens aangeven.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zes varkenslenzen werden gecomprimeerd, eerst met de capsule intact en vervolgens na zorgvuldige verwijdering van de capsule. De diktewaarden waren 7,65 ± 0,43 mm voor ingekapselde lenzen en 6,69 ± 0,29 mm voor gedecapsuleerde lenzen (gemiddelde ± standaarddeviatie). Een typische laadgeschiedenis wordt weergegeven in figuur 3. De resulterende kracht-verplaatsingscurven werden goed gepast door het Hertz-model (d.w.z. ze hadden een kracht die evenredig was met de verplaatsing die werd verhoogd tot de macht 1,5; Figuur 4). Dit gold voor zowel de ingekapselde als de gedecapsuleerde lenzen.
Lenzen werden eerst samengedrukt met 15% van hun onbelaste dikte met een intacte capsule, daarna na verwijdering van de capsule. Van axiale compressie met 15% van de oorspronkelijke dikte is eerder aangetoond dat het geen schade aan de lenshechtingen veroorzaakt18. Decapsulatie resulteerde in een significante afname van de effectieve elastische modulus (n = 6; p = 0,0138; Figuur 5).
Figuur 1: Dissectietechniek. (A) De extraoculaire weefsels worden verwijderd. (B) Er wordt een omtreksnede gemaakt bij de limbus. (C) Ter hoogte van de evenaar wordt een omtreksnede gemaakt. (D) Het hoornvlies wordt verwijderd. (E) De iris wordt verwijderd. (F) Het oog wordt bij de evenaar in tweeën gesneden, vervolgens (G) wordt het glasvocht verwijderd, waardoor (H) een ringvormige ring overblijft met de lens, het corpus ciliare en de zonules die nog steeds aan de sclera vastzitten. (I) Er wordt een meridionale snede gemaakt door de sclera om (J) toegang te geven tot de zonules, (K) die worden weggesneden en (L) de ingekapselde lens overlaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Apparatuur voor het testen van compressie. (A) Schema en (B) foto van het lenscompressieapparaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Toegepaste laadgeschiedenis voor een ingekapselde varkenslens. Boven: Verplaatsingsgeschiedenis. Onder: Forceer geschiedenis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Typische kracht-verplaatsingsgegevens uitgerust met het Hertz-model. Links: Gegevens voor een ingekapselde varkenslens. Rechts: Compressiegegevens voor dezelfde lens na decapsulatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Doos- en snorhaardiagram van ingekapselde en gedecapsuleerde effectieve elastische moduli van varkenslenzen. De effectieve modulus van de ingekapselde lenzen was significant hoger dan die van de gedecapsuleerde lenzen (p = 0,013), wat aangeeft dat de aanwezigheid van de capsule de effectieve stijfheid van de lens aanzienlijk kan veranderen. Gegevens zijn voor zes lenzen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand 1: MATLAB-applicatie om het lenscompressieapparaat te bedienen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2: MATLAB-functie om de elastische modulus te schatten op basis van kracht-compressiegegevens. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lenscompressie is een veelzijdige methode voor het schatten van de stijfheid van de lens. De hierboven beschreven procedures maken het mogelijk om lenzen van verschillende soorten en verschillende maten te vergelijken. Alle vervormingen worden genormaliseerd ten opzichte van de lensgrootte en de berekening van de elastische modulus houdt ongeveer rekening met de lensgrootte. De effectieve modulus is aanzienlijk hoger dan de eerder gerapporteerde modulus voor de varkenslens 4,7,11,19, althans gedeeltelijk als gevolg van het gebruik van dikte in plaats van de kromtestraal: de polaire kromtestralen van de varkenslens zijn aanzienlijk groter dan de helft van de dikte 20.
De eenvoudige analyse (d.w.z. het gebruik van het Hertz-model) die hier wordt gepresenteerd, heeft een aantal belangrijke beperkingen. Ten eerste houdt het geen rekening met de aanwezigheid van het lenskapsel. Het is aangetoond dat de aanwezigheid van de capsule de biomechanische eigenschappen van de lens aanzienlijk kan veranderen16,21. Daarom kan deze methode het beste worden toegepast op gedecapsuleerde lenzen. Dit is vooral belangrijk bij het vergelijken van soorten in gevallen waarin de capsule aanzienlijk verschillende diktes of biomechanische eigenschappen kan hebben. Deze methode gaat er ook van uit dat de lens mechanisch homogeen is; Wij en anderen hebben eerder aangetoond dat dit over het algemeen niet het geval is voor varkens- of menselijke lenzen 4,5,6,10,11,22. Het is dus het beste om de berekende elasticiteitsmoduluswaarde te beschouwen als een effectieve modulus, die vermoedelijk gerelateerd is aan het volumegemiddelde van de ruimtelijk variërende modulus binnen de lens. Het Hertz-model gaat ervan uit dat de lens lineair elastisch is, terwijl bekend is dat het visco-elastisch is; De eenvoudige analyse die hier wordt voorgesteld, is dus niet in staat om informatie te geven over de visco-elasticiteit van de lens. Eerder werk heeft ook aangetoond dat de methode en de duur van het bewaren van lenzen voorafgaand aan het testen de lenseigenschappen kunnen veranderen4; Alle varkenslenzen werden daarom direct na dissectie bij aankomst in het lab getest.
Het verschil in de kracht-verplaatsingsmetingen is te wijten aan ruis van de load cell versterker: het verwijderen van de capsule maakt de krachtmetingen aanzienlijk lager, en daardoor is de signaal-ruisverhouding lager. De aannames die worden gebruikt bij het afleiden van het Hertz-model zijn onder meer dat de bol een homogeen materiaal is; Daarom is de effectieve elastische modulus op de een of andere manier het gemiddelde van de vervormbaarheid van de lens en het kapsel wanneer het kapsel aanwezig is. Dit maakt vergelijkingen tussen soorten en leeftijden bijzonder moeilijk, omdat een varkenslens een capsule heeft van ~60 μm dik, terwijl een muis- of menselijke lens een capsule heeft in het bereik van 5-15 μm dik. De elasticiteitsmodulus van het kapsel kan ook variëren met soort en leeftijd, hoewel deze afhankelijkheden onbekend zijn. Dus hoewel het mogelijk is om een minder luidruchtige pasvorm met de capsule te krijgen, wordt de vergelijking inherent verward door de aanwezigheid van de capsule - dit is de reden waarom we aanbevelen de test zonder de capsule uit te voeren.
Ten slotte werd de effectieve modulus berekend in de veronderstelling dat de kromtestraal de helft van de dikte van de lens was. Dit geldt alleen voor een sferische lens; De varkenslens is aanzienlijk asferisch en dus zijn de effectieve moduluswaarden aanzienlijk hoger dan wanneer in plaats daarvan de kromtestraal zou worden gebruikt. Deze laatste veronderstelling kan worden ondervangen door de kromtestralen te meten, hoewel dit gecompliceerd kan zijn voor het onderste oppervlak dat altijd vlak is door contact met de onderste plaat. Het is ook minder belangrijk voor meer sferische lenzen zoals muizenlenzen. Nog beter is het gebruik van inverse eindige-elementenanalyse om de mechanische eigenschappen van de lens vast te stellen16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Ondersteund door National Institutes of Health-subsidie R01 EY035278 (MR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Medium Point General Purpose Forceps | Fisherbrand | 16-100-110 | |
| Galil COM Libraries | Galil Motion Control | ||
| High Precision Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-164 | |
| Linear Stage | McMaster-Carr | 6734K4 0.125" | |
| Load Cell | FUTEK | LSB200-FSH03869 | |
| Load Cell Amplifier | FUTEK | IAA300-FSH03931 | |
| MATLAB | The Mathworks, Inc. | ||
| Microprobe | Surgical Design | 22-079-740 | |
| Miniature Self Opening Precision Scissors | Excelta | 63042-004 | |
| Motion Controller | Galil Motion Control | DMC-31012 | |
| Motor | Galil Motion Control | BLM-N23-50-1000-B | |
| Straight Hemastats | Fine Science | NC9247203 | stainless steel, 14cm |
References
- Gullstrand, A. Helmholtz's treatise on physiological optics. translated edn. The Optical Society of America. , Rochester, N.Y. (1924).
- Helmholtz, H. Uber die akkommodation des auges. Arch Ophthalmol. 1, 1-74 (1855).
- Burd, H. J., Wilde, G. S., Judge, S. J. An improved spinning lens test to determine the stiffness of the human lens. Exp Eye Res. 92 (1), 28-39 (2011).
- Reilly, M. A., Martius, P., Kumar, S., Burd, H. J., Stachs, O. The mechanical response of the porcine lens to a spinning test. Z Med Phys. 26 (2), 127-135 (2016).
- Fisher, R. F. The elastic constants of the human lens. J Physiol. 212 (1), 147-180 (1971).
- Erpelding, T. N., Hollman, K. W., O'Donnell, M. Spatially mapping the elastic properties of the lens using bubble-based acoustic radiation force. IEEE Ultrasonics Symp. 1, 613-616 (2005).
- Erpelding, T. N., Hollman, K. W., O'Donnell, M. Mapping age-related elasticity changes in porcine lenses using bubble-based acoustic radiation force. Exp Eye Res. 84 (2), 332-341 (2007).
- Yoon, S., Aglyamov, S., Karpiouk, A., Emelianov, S. A high pulse repetition frequency ultrasound system for the ex vivo measurement of mechanical properties of crystalline lenses with laser-induced microbubbles interrogated by acoustic radiation force. Phys Med Biol. 57 (15), 4871-4884 (2012).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy. Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
- Weeber, H. A., Gabriele, E., Wolfgang, P.
- Reilly, M. A., Ravi, N. Microindentation of the young porcine ocular lens. J Biomech Eng. 131 (4), 044502 (2009).
- Gu, S., et al. Connexin 50 and AQP0 are essential in maintaining organization and integrity of lens fibers. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (12), 4021-4032 (2019).
- Sharma, P. K., Busscher, H. J., Terwee, T., Koopmans, S. A., van Kooten, T. G. A comparative study on the viscoelastic properties of human and animal lenses. Exp Eye Res. 93 (5), 681-688 (2011).
- Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses. J Vis Exp. (111), e53986 (2016).
- Baradia, H., Negin, N., Adrian, G.
- Reilly, M. A., Cleaver, A. Inverse elastographic method for analyzing the ocular lens compression test. J Innov Opt Health Sci. 10 (06), 1742009 (2017).
- Hahn, J., et al. Measurement of ex vivo porcine lens shape during simulated accommodation, before and after fs-laser treatment. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (9), 5332-5343 (2015).
- Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure. Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).
- Yoon, S., Aglyamov, S., Karpiouk, A., Emelianov, S. The mechanical properties of ex vivo bovine and porcine crystalline lenses: age-related changes and location-dependent variations. Ultrasound Med Biol. 39 (6), 1120-1127 (2013).
- Reilly, M. A., Hamilton, P., Gavin, P., Nathan, R. Comparison of the behavior of natural and refilled porcine lenses in a robotic lens stretcher. Exp Eye Res. 88 (3), 483-494 (2009).
- Mekonnen, T., et al. The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086 (2023).
- Wilde, G. S., Burd, H. J., Judge, S. J. Shear modulus data for the human lens determined from a spinning lens test. Exp Eye Res. 97 (1), 36-48 (2012).
