Summary
우리는 미생물이 있든 없든 계통발생학적으로 구별되는 다양한 식물의 성장을 지원하는 유리 기반의 반수경재배 실험 시스템에 대한 프로토콜을 제시합니다. 이 시스템은 다양한 성장 배지와 호환되며 다운스트림 분석을 위한 비파괴 뿌리 삼출물 샘플링을 허용합니다.
Abstract
뿌리 삼출물은 식물-토양 인터페이스를 형성하고 영양 순환에 관여하며 토양 유기체와의 상호 작용을 조절합니다. 뿌리 삼출물은 역동적이며 생물학적, 환경적, 실험적 조건에 의해 형성됩니다. 다양한 다양성과 낮은 농도로 인해 정확한 삼출물 프로파일을 측정하기가 어려우며, 다른 유기체가 존재하는 자연 환경에서는 식물 유래 화합물을 뒤집어 추가 화합물을 스스로 생산합니다. 여기에 소개된 반수경 유리병 실험 시스템은 생물학적, 환경적, 실험적 요인을 제어할 수 있습니다. 그것은 다양한 다른 성장 매체에서 미생물의 유무에 관계없이 최대 몇 달 동안 다양한 계통 발생학적으로 구별되는 식물 종의 성장을 허용합니다. 유리 기반 디자인은 재사용이 가능하므로 고감도 및 낮은 환경 영향을 위해 낮은 대사 산물 배경을 제공합니다. 삼출물은 비파괴적으로 샘플링할 수 있으며 원하는 경우 실험 과정에서 조건을 변경할 수 있습니다. 이 설정은 질량 분석 분석 및 기타 다운스트림 분석 절차와 호환됩니다. 요약하면, 다양한 조건에서 민감한 뿌리 삼출물 분석에 적합한 다용도 성장 시스템을 제시합니다.
Introduction
인구 밀도가 높은 토양 내에서 뿌리권은 탄소가 풍부한 틈새 시장을 제공합니다. 그것은 최대 20%의 동화된 탄소를 배출하여 식물 뿌리에 의해 형성되며 상주 토양 마이크로바이옴 1,2,3,4,5,6과 구별되는 미생물 군집을 품고 있습니다. 연구자들이 뿌리 관련 미생물의 유익한 기능과 그에 수반되는 지속 가능한 농업의 잠재력에 주목함에따라7 종종 뿌리권 효과(rhizosphere effect)라고 불리는 이 관찰은 점점 더 많은 과학적 노력의 초점이 되어 왔다. 그러나 지금까지 뿌리권 효과의 동인으로 제안된 미생물과 식물 간의 화학적 대화는 잘 이해되지 않아 농업에서 신뢰할 수 있는 미생물 솔루션 개발을 위한 기계론적 이해가 제한적입니다 8,9,10.
대사 산물이 토양 입자에 쉽게 흡수되고 미생물 군집에 의해 빠르게 전환되는 토양 환경에서 뿌리 삼출물을 해독하는 것은 특히 모델 식물 애기장대(Arabidopsis thaliana)와 같은 미세한 뿌리 시스템을 가진 식물 종의 경우 간단하지 않습니다 11. 이것이 대부분의 연구에서 뿌리 삼출액이 수경 재배 시스템에서 샘플링되는 이유입니다. 이 소우주에서 식물의 공중 부분은 맞춤형 식물 홀더 또는 메쉬, 한천 및 유리 구슬과 같은 더 낮은 키 재료에 의해 제자리에 고정됩니다. 사용되는 용기는 멀티 웰 플레이트 위의 페트리 접시에서 폭기 필터 12,13,14,15,16,17,18,19가 있거나 없는 다양한 맞춤형 및 상업용 상자에 이르기까지 다양합니다. 시스템에 따라 식물 성장 조건은 크게 다르며 자연 조건을 어느 정도 반영합니다.
여기에서는 실험적으로 조정이 가능하고 재현성이 높은 결과를 생성하는 유리 기반의 반수경 재배 시스템을 제시합니다. 조립 및 사용이 간단하며 일반적으로 사용 가능한 재료를 기반으로 합니다. 이 시스템은 유리 구슬로 채워진 유리병을 기반으로 하며, 유리 제품의 재사용 가능한 특성과 낮은 결합 특성을 활용합니다(그림 1). 비드는 성장하는 식물에 대한 물리적 지지를 제공하고 기계적 임피던스를 시뮬레이션하여 수경 재배 설정과 비교할 때 더 토양과 유사한 뿌리 구조에 기여합니다 19,20,21. 미생물을 접종하면 유리 구슬은 박테리아가 부착할 수 있는 표면을 제공합니다.
유리병은 멸균 상태를 유지하기 위해 닫을 수 있으며 시스템은 충분한 헤드 공간과 공기 순환을 허용하도록 설계되어 습기가 많은 환경을 피합니다. 항아리는 다양한 식물 종의 장기간 성장에 적합하며 다양한 크기의 항아리를 사용하여 확장 및 축소할 수 있습니다. 여기에서는 C3 및 C4 풀, 쌍떡잎식물 및 콩과 식물을 포함하는 6가지 식물 종에 대한 응용 프로그램을 보여줍니다. 그 중에는 모델 종 A. thaliana (쌍떡잎식물), Brachypodium distachyon (C3 외떡잎식물), Medicago truncatula (콩과 식물)와 Solanum lycopisicum (토마토, 쌍떡잎식물), Triticum aestivum (밀, C3 외떡잎식물) 및 수수 이색 (수수, C4 외떡잎식물)과 같은 작물 종이 있습니다. 제시된 프로토콜에는 시스템의 실험 설정, 6가지 식물 종의 종자 살균 및 발아, 항아리에 묘목 이식, 다양한 성장 배지, 미생물 접종, 뿌리 삼출물 샘플링 및 분석을 위한 삼출액 처리가 포함됩니다.
Protocol
1. 묘목의 준비 : 종자의 표면 살균
알림: 종자의 표면 살균 및 모든 후속 단계는 달리 명시되지 않는 한 멸균 조건에서 수행해야 합니다. 1.1 내지 1.4 단계는 A. thaliana 종자의 표면 멸균에 특이적이다. 다른 식물 종은 튜브 크기(종자 수 및 종자 크기에 따라 다름), 용액 내 시간 및 살균 용액에 대한 대안적인 변형이 있습니다(표 1).
- 미세 원심 분리기 튜브 (최대 20mg의 씨앗)에 씨앗을 넣고 씨앗을 70 % 에탄올로 덮습니다.
주의 : 에탄올은 가연성입니다. 화기 근처에서 사용하지 마십시오. - 닫힌 마이크로 원심분리기 튜브를 셰이커로 15분 동안 옮기고 씨앗이 부드럽게 교반되도록 회전을 설정합니다.
- 피펫으로 70% 에탄올을 조심스럽게 제거하고 100% 에탄올로 교체합니다. 1.2단계를 반복합니다.
- 100% 에탄올을 제거하고 멸균 공기 흐름에서 마이크로 원심분리기 튜브 뚜껑을 열어 두어 씨앗을 건조시킵니다.
- 씨앗이 마르면 튜브를 튕기거나 멸균 집게를 사용하여 0.7% 식물 한천이 있는 0.5x Murashige 및 Skoog(MS) 배지에 고르게 펴 바릅니다. 한천 플레이트를 닫고 1.25cm 미세 기공 테이프로 밀봉합니다.
- 플레이트를 성장 챔버의 선반에 수평으로 놓습니다(16시간 밝음/8시간 어두움, 22°C 낮/18°C 밤, 150-160μmol m-2 s-1).
2. 묘목 준비 : 발아 된 종자를 신선한 판으로 옮깁니다.
알림: 다음 단계는 A. thaliana 에만 해당되며 다른 종에는 필요하지 않습니다.
- 발아 후 묘목을 상단에서 약 3cm 떨어진 곳에 선형으로 배치하여 5-6 개의 묘목을 0.5x MS 배지가 있는 새로운 0.7% 식물 한천 플레이트로 옮깁니다( 그림 2D의 로제트 위치 참조).
- 1.25cm 미세 기공 테이프로 한천 플레이트를 밀봉하고 발아 후 15-18일에 묘목을 항아리로 옮길 준비가 될 때까지 성장 챔버(그림 2D)에서 수직으로 자랍니다(표 2).
3. 수경 재배 시스템 준비 : 항아리 설정
- 깨끗한 5mm 유리 구슬 150mL를 각 깨끗한 용기에 넣고 뚜껑을 닫습니다(그림 1A).
참고: 이 프로토콜에서 5mm 유리 구슬은 대부분의 종22에 적합하지만 원하는 경우 비드 크기를 조정할 수 있습니다. - 뚜껑과 용기 간 접합부와 오토클레이브(121°C에서 20분)를 덮을 수 있도록 밀폐된 용기 위에 충분한 알루미늄 호일을 놓습니다(그림 1B).
- 식물을 옮길 준비가 될 때까지 준비된 항아리를 덮어 두십시오(표 2).
4. 수경 재배 시스템의 준비 : 묘목 추가
- 묘목을 항아리로 옮길 준비가 되면(표 2) 멸균 벤치에서 항아리의 알루미늄 호일과 뚜껑을 제거합니다.
- 항아리에 박테리아를 접종해야 하는 경우 4.3단계로 이동하기 전에 다음 단계를 수행하십시오. 그렇지 않으면 4.2단계를 건너뜁니다.
- 멸균 접종 루프를 사용하여 한천 플레이트의 순수 박테리아 배양액에서 단일 콜로니를 선택하고 750μL의 멸균 10mMMgCl2에 현탁시킵니다. 용액이 탁해질 때까지 반복합니다.
- 선택 사항: 현탁액을 750μL의 멸균 10mMMgCl2 로 3배 세척하여 1,000× g 및 실 온에서 5분 원심분리한 후 상층액을 제거하고 750μL의 10mMMgCl2에서 펠릿을 재현탁합니다.
- 선택 사항: 여러 다른 박테리아 종을 접종하는 경우 진행하기 전에 4.2.1-4.2.2단계에서 준비한 단일 균주의 현탁액을 동일한 비율로 혼합합니다.
- 파장 600nm(OD600)에서 0.5x MS 배지(pH 5.7 - 5.9, KOH로 조정) 또는 선택한 다른 성장 배지에서 0.2-0.4로 광학 밀도를 조정합니다(4.3단계 참조). OD600 을 다시 측정하여 용액이 올바르게 희석되었는지 확인하십시오.
주의: KOH는 부식성입니다. 장갑과 실험실 가운을 착용하십시오. - 현탁액을 동일한 배지에서 OD600 0.002-0.004로 더 희석합니다(1:100 희석).
참고 : 최종 세포 밀도는 사용 된 박테리아 균주에 따라 다르지만 경험상이 접종물은 약 3-6 × 105 세포 mL-1에 해당합니다. - 병당 최종 희석액 35mL를 추가합니다. 대조군 항아리에 35mL의 멸균 성장 배지를 추가합니다. 뿌리를 마르지 않도록 식물을 옮기기 전에 비드를 저어 0.5x MS 배지로 고르게 코팅합니다. 4.4단계로 진행합니다.
- 각 용기에 0.5x MS 배지 35mL를 추가합니다(pH 5.7 - 5.9, KOH로 조정). 뿌리를 마르지 않도록 식물을 옮기기 전에 비드를 저어 0.5x MS 배지로 고르게 코팅합니다.
참고: 성장 배지는 예를 들어 영양소 제거, 염분 스트레스를 유도하기 위한 삼투질 첨가 또는 다른 pH 값 또는 성장 배지의 사용에 의해 수정될 수 있습니다. 주의: KOH는 부식성입니다. 장갑과 실험실 가운을 착용하십시오. - 3-5 A. thaliana 식물을 유리 구슬 사이에 뿌리 시스템을 배치하여 항아리에 넣습니다.
참고: 항아리당 식물의 수는 다른 종에 따라 다릅니다(표 2). - 멸균 집게나 숟가락으로 비드를 움직여 뿌리를 덮고 잎을 배지에서 들어 올립니다(그림 1C).
알림: 뿌리가 부러지고 식물에 스트레스를 주지 않도록 식물과 구슬을 조심스럽게 움직입니다. - 용기 상단에 2cm 미세 기공 테이프 1.25 스트립을 추가하고 뚜껑을 부드럽게 위에 놓습니다(그림 1D-F).
알림: 공기 교환을 방해하지 않도록 뚜껑을 아래로 누르지 마십시오. - 뚜껑과 용기 사이의 틈을 2.5cm 미세 기공 테이프로 덮어 공기 교환을 허용하면서 멸균 상태를 유지하고 용기를 성장 챔버에 넣습니다(그림 1G,H).
- 생물학적 질문과 예상되는 변동성에 따라 실험 조건당 4-8개의 항아리를 설정합니다.
- 실험 시스템의 대사 산물 배경을 설명하기 위해 생물학적 음성 대조군(예: 식물이 없는 항아리)을 포함해야 합니다. 음성 대조군에 대해 실험적 처리(예: 사중주)와 동일한 반복실험 횟수를 설정합니다.
- 성장 기간을 연장하려면 매주 성장 배지를 교체하십시오: 나머지 성장 배지를 25mL 용량 피펫으로 제거하고 35mL의 새 배지를 추가합니다.
5. 뿌리 삼출물의 수집
- 식물이 원하는 나이에 도달하면 멸균 벤치에서 2.5cm 미세 기공 테이프와 뚜껑을 제거합니다.
참고 : 성장 조건의 A. thaliana 의 경우 발아 후 21 일은 개화가 시작되기 전에 성숙한 식물 무성 단계를 나타냅니다. 식물 발달 단계는 식물 종에 따라 다르며 성장시기는 식물 종에 따라 다릅니다. 이 시기는 연구 질문에 따라 수정될 수 있습니다. - 무균 테스트를 위해 20μL의 성장 배지를 분취하고 LB 한천 플레이트에 피펫을 채취합니다.
- 접종된 항아리의 경우, 콜로니 형성 단위(CFU) 계수에 사용하기 위해 100μL의 성장 배지를 분취합니다(예: 희석 시리즈23).
참고: 경험상 박테리아 밀도는 성장 배지의 10 5-10 8 살아있는 세포 mL-1 이내입니다.
- 접종된 항아리의 경우, 콜로니 형성 단위(CFU) 계수에 사용하기 위해 100μL의 성장 배지를 분취합니다(예: 희석 시리즈23).
- 뿌리가 손상되지 않도록 25mL 부피 피펫으로 가능한 한 많은 성장 배지를 제거합니다.
- 잎이 젖지 않도록 용기 벽을 따라 피펫팅하여 50mL의 수집 배지(예: 20mM 아세트산 암모늄, HCl로 조정된 pH 5.7-5.9)를 추가합니다. 뚜껑으로 항아리를 닫고 원하는 삼출액 수집 시간 동안 멸균 상태에서 배양합니다. 시간에 민감한 실험의 경우 2시간이 좋은 수집 기간입니다.
주의 : HCl은 부식성입니다. 장갑과 실험실 가운을 착용하십시오. 뿌리 삼출액 수집 시간을 늘리려면 뚜껑을 테이프로 다시 감싸고 항아리를 성장실로 옮깁니다. - 2시간 후 원하는 양의 수집 배지를 튜브에 제거합니다(예: 농축 삼출물을 사용하는 분석 또는 분석의 경우 50mL 또는 직접 사용의 경우 2mL). 수집된 뿌리 삼출액은 추가 처리 또는 분석이 있을 때까지 -80°C에서 보관합니다.
- 접종된 항아리로 작업할 때는 수집된 삼출물을 5,000× g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리하고 분석을 위해 상층액만 사용합니다. 또는 0.22 μm 또는 0.45 μm 필터로 삼출물을 필터 멸균합니다.
- 실험이 시계열의 일부인 경우 항아리에서 나머지 수집 배지를 모두 제거하고 35mL의 0.5x MS 배지를 추가합니다. 항아리를 성장실로 되돌리기 전에 뚜껑과 2.5cm 테이프를 교체하십시오.
- 뿌리를 측정하고 한 병에 모든 식물의 신선한 무게를 싹 쏘아 나중에 식물 무게로 뿌리 삼출물을 정규화합니다.
알림: 원하는 경우 식물 조직을 추가로 샘플링할 수 있습니다.
6. 질량 분석법을 위한 뿌리 삼출물 처리
- 분석 방법에 따라 뿌리 삼출물을 동결 건조하여 농축하고 수집 배지를 제거합니다(액체가 없을 때까지 0.37mbar에서 -80°C). 분석할 준비가 될 때까지 -80°C에서 보관하십시오.
참고: 여기에 제시된 데이터는 정밀 질량 사중극자 ToF(Time-of-Flight) 기기에 대한 유동 주입 TOF-MS 분석을 통해 생성되었습니다. - 분석 기기에 주입하기 전에 동결 건조된 삼출물을 재구성하거나 처리되지 않은 뿌리 삼출물을 뿌리 신선 중량에 따라 수집 배지로 희석합니다.
알림: 수집 매체는 질량 분석기와 호환되도록 선택되었습니다. 그러나 분석 방법에 따라 주입 전에 탈염 단계가 필요할 수 있습니다.
Representative Results
여기에 소개된 실험 시스템을 통해 뿌리 삼출 프로파일을 변경하는 실험 및 환경 요인을 제어할 수 있습니다. A. thaliana의 성장을 서로 다른 조명 조건, 식물 나이 및 식물 밀도를 두 개의 다른 실험실에서 비교했습니다(그림 3). 실험실에서 식물은 건강해 보였다(그림 3A,B). 낮이 짧은 조건(10시간 조명 대 16시간 조명, 그림 3)은 긴 낮 조건에 비해 더 높은 뿌리 질량을 초래했습니다(그림 3C,D). 마찬가지로, 긴 낮 조건에서 자란 모든 식물의 총 뿌리 질량은 짧은 낮보다 작았습니다(그림 3C). 전반적으로, 항아리 내부 및 항아리 간 성장의 변동성은 실험실 전반에 걸쳐 낮았습니다.
유리병 시스템은 다양한 식물 종 및 발달 단계와 호환됩니다. 뿌리 삼출액 분석의 종점은 일반적으로 21일이며, 실험 조건에서 많은 식물 종은 번식 단계로 전환되기 전에 성숙한 식물 단계에 있습니다(그림 4A-E). 식물은 뿌리 시스템에 눈에 띄는 손상 없이 실험 시스템에서 쉽게 제거할 수 있습니다. 따라서 조직 중량을 결정하거나 다운스트림 분석을 위해 조직을 사용하는 것은 간단합니다. 가장 높은 싹 무게는 밀에서 발견되었으며 수수와 토마토가 그 뒤를 이었습니다. 가장 높은 뿌리 무게는 수수에서 발견되었으며, 밀과 M. truncatula가 그 뒤를 이었습니다. 뿌리 : 싹 비율은 종마다 다릅니다. 전반적으로, 조직 무게는 100 mg에서 800 mg 사이 다양했다.
뿌리 삼출액 수집을 허용하는 실험 시스템의 핵심 측면은 정의된 환경에서 식물-미생물 상호 작용을 연구하기 위해 미생물을 사용한 통제된 접종입니다. 제시된 실험 시스템은 반복적인 조작(그림 5의 '대조군' 조건 참조)으로도 멸균 상태를 유지할 수 있으며, 박테리아를 추가하고 장기간 유지할 수 있습니다. 33일 된 A. thaliana 식물에 OD600 0.004의 공생 박테리아 혼합물을 접종했을 때 박테리아는 실험의 전체 기간인 12일 동안 지속되었습니다(그림 5). 콜로니 형성 단위는 성장 배지에서 100배 증가했으며 뿌리도 콜로니화했습니다(그림 5C). 접종된 식물의 표현형은 멸균 식물의 표현형과 구별할 수 없었다(그림 5A,B).
제시된 실험 시스템은 많은 실험 조건에서 삼출액 수집을 허용합니다. 여기에서는 암모늄 아세테이트 또는 동일한 식물의 물에서 연속적으로 수집된 A. thaliana Col-0의 삼출 프로파일을 제시합니다(그림 6A). 삼출액은 분석될 때까지 -80°C에서 보관하고, 루트 웨이트로 정규화하고, 질량 분석법으로 분석하였다. 식물을 함유한 항아리의 샘플은 실험 대조군(식물이 없는 항아리)에 대해 여과하였다. 2,163개의 대사 산물 중 436개(20.16%)가 배경 위의 신호를 보였으며 분석을 위해 유지되었습니다. 이 중 416개 또는 95%의 화합물이 실험 조건 간에 뚜렷한 풍부도를 보였습니다. 그러나, 26의 대사 산물은 화합물의 아무 종류나 기인할 수 없고 이렇게 정의되지 않는다. 대부분의 대사 산물(406개 또는 98%)은 수분 수집 삼출물에 더 풍부했습니다. 삼출물이 처음에는 암모늄 아세테이트에서, 나중에는 물에 연속적으로 수집되면 대사 신호가 시간이 지남에 따라 희석될 수 있기 때문에 삼출액 프로파일에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나, 두 번째 시점으로 수집된 물에서 거의 독점적으로 더 높은 삼출 신호는 이 가설을 지지하지 않는다: 순수한 물에서의 삼출물 수집은 식물에 삼투압 충격을 일으킬 가능성이 높으며, 이는 성장 용액에 대한 수집 용매 등몰에 비해 대사 산물 풍부도를 증가시킨다(20mM 암모늄 아세테이트는 0.5x MS 배지에 등몰이다). 두 가지 성장 조건에서 확인된 화합물의 화학적 분류를 조사한 결과, 대부분의 화합물은 유기산 및 유도체(28.6%)이고 유기 산소 화합물(18%), 유기헤테로고리화합물(14.2%), 지질(13.2%)이 그 뒤를 이었습니다. 대사 산물의 작은 부분 집합만이 페닐프로판노이드와 폴리케타이드(8.7%) 및 벤제노이드(6%)에 속합니다. 유기 질소 화합물, 뉴클레오시드, 유기황 화합물, 알칼로이드, 리그난 및 관련 화합물은 분류된 화합물의 2%에서 0.5% 사이를 나타냅니다(그림 6B). 여기에 기술된 대사산물의 분포는 다른 유형의 뿌리 삼출물 수집 시스템(24)을 사용하여 이미 발표된 데이터에 대응한다.
그림 1: 유리병 설정. (A) 유리 구슬이 담긴 항아리. (B) 고압멸균할 준비가 된 유리 구슬이 있는 항아리. (C) 항아리에 담긴 묘목(상단 보기). (D) 1.25cm 미세 기공 테이프가 있는 항아리(상단 보기)에 있는 묘목. (E) 1.25cm 미세 기공 테이프가 있는 항아리에 담긴 묘목(측면 보기). (F) 1.25cm 미세 기공 테이프와 뚜껑이 있는 항아리에 담긴 묘목(측면 보기). (G) 1.25cm 미세 기공 테이프, 뚜껑 및 2.5cm 미세 기공 테이프가 있는 항아리(측면 보기)에 묘목이 있는 항아리 설정을 완료합니다. (H) 항아리 설정을 완료합니다(상단 보기). (I) 생후 21일이고 수확 준비가 된 식물(상단 보기). 항아리 크기: 높이 147mm x 직경 100mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 성장 챔버에서 0.5x Murashige 및 Skoog 중간 한천 플레이트의 표면 멸균 묘목. (A) 애기장대(Arabidopsis thaliana , 6일령), (B) Brachypodium distachyon (6일령), (C) Medicago truncatula( 6일령), (D ) A. thaliana (18일령). 한천 플레이트 크기 120mm x 120mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 애기장대(Arabidopsis thaliana) Col-0 식물은 낮이 짧고 긴 조명 조건에서 항아리에서 자랐습니다. (A) 낮이 짧은 조건(10시간 빛/14시간 어두움, 220μmol m-2 s-1 광도, 낮 21°C/밤 18°C)에서 자란 33일 된 식물 3개가 담긴 항아리 및 (B) 긴 낮 조건(16시간 빛/8시간 어두움, 150-160 μmol m-2 s-1 광도, 주간 22°C/야간 18°C). 한 병의 (C) 모든 식물과 단일 식물의 (D)의 뿌리 무게. **는 t-검정의 유의성 값(p < 0.05)을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 멸균 유리병 시스템 설정에서 21일째에 계통발생학적으로 구별되는 5종. (A) 모델 외떡잎식물 Brachypodium distachyon, (B) 모델 콩과 식물 Medicago truncatula, (C) 쌍떡잎식물 Solanum lycopersicum (토마토), (D) 쌍떡잎식물 수수 이색, (E) 외떡잎식물 Triticum aestivum (밀). (F) 유리병에서 자란 종의 뿌리와 새싹의 신선한 무게. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: Arabidopsis thaliana Col-0(33일령)은 짧은 낮 조건에서 성장했습니다. (A) 멸균 설정에서 또는 (B) 공생 박테리아 컨소시엄과 함께 12일 동안 접종. (C) 성장 기질(왼쪽)과 뿌리(오른쪽)의 멸균(대조군) 및 접종된 항아리를 위한 콜로니 형성 단위. N = 멸균 제어 조건의 경우 4 병, 접종 조건의 경우 n = 8 병. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 생후 21일 된 A. thaliana Col-0에 대한 뚜렷한 뿌리 삼출물 프로파일. 삼출액은 멸균된 20mM 암모늄 아세테이트(pH 5.7)에서 2시간 동안 수집한 후 멸균 여과된 탈이온수에서 2시간 동안 수집했습니다. 대사 산물은 직접 주입을 사용하여 질량 분석법으로 검출되었습니다. (A) 배경 수준 이상에서 검출된 436개의 대사 산물에 대한 주성분 분석(식물이 있는 항아리와 식물이 없는 항아리의 비교). PC: 분산의 양이 설명된 주성분입니다. 파란색: 수분 포집 삼출물, 노란색: 암모늄 아세테이트 포집 삼출물. (B) 수퍼 클래스 (https://cfb.fiehnlab.ucdavis.edu/)에 따라 채색된 실험 조건 (Tukey test)간에 유의하게 다른 416 개의 대사 산물의 파이 차트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 종 | 종자 준비 | 70% 에탄올의 시간(분) | 차아염소산나트륨(NaClO)의 농도(v/v % 표백제) | 표백 시간(분) | ||
| 애기장대(Arabidopsis thaliana) | 15 | 없음; 100% 에탄올 | 15 | |||
| Brachypodium distachyon* | 데허스크 | 0.5 | 6 | 5 | ||
| 메디카고 트룬카툴라*a | 30 | 6 | 30 | |||
| 솔라눔 리코페르시쿰* | 0.5 | 6 | 5 | |||
| 수수 바이컬러* | 데허스크 | 0.5 | 6 | 30 | ||
| Triticum aestivum* | 데허스크 | 0.5 | 12 | 20 | ||
표 1: 여러 종에 대한 표면 종자 살균 방법. * 에탄올과 표백제 사이 그리고 마지막에 여과 된 탈 이온수로 4-5 배 세척; 표백제 후 3-6시간 동안 배양하고 30분마다 여과된 탈이온수로 교체합니다.
| 종 | 항아리에 일 | 식물 수 |
| Brachypodium distachyon | 4 대 5 | 3 |
| 수수 바이컬러 | 4 대 5 | 3 |
| 트리티쿰 아에스티붐 | 4 대 5 | 2 |
| Medicago truncatula | 5 대 6 | 3 |
| 솔라눔 리코페르시쿰 | 7에서 8 | 3 |
| 애기장대(Arabidopsis thaliana) | 17 | 3 대 5 |
표 2: 항아리로 옮기는 묘목의 나이(일수) 및 다양한 식물 종에 대한 항아리당 식물 수.
Discussion
여기에 제시된 실험 시스템은 유리병과 유리구슬을 기반으로 하므로 다양한 맥락에서 뿌리 삼출을 연구할 수 있는 간단하고 유지 보수가 적으며 다재다능한 반수경 재배 시스템을 제공합니다. 이는 상이한 식물 종(25)의 삼출물 프로파일, 상이한 성장 조건25에 대한 삼출물의 반응, 삼출물22에 대한 토양 물리화학적 특성의 영향을 조사하는 연구에 사용되어 왔다. 이 시스템은 몇 주에서 몇 달에 이르는 연장된 성장 기간 동안 여기에서 테스트한 모든 식물 종에 적합합니다. 멸균 상태를 유지하는 것은 분석된 2주 성장 기간 동안 지속되는 박테리아 접종과 마찬가지로 간단합니다. 따라서 실험 시스템은 멸균 조건에서 뿌리 삼출물의 제어된 수집을 허용할 뿐만 아니라 식물-미생물 상호 작용을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 또한, 다양한 영양소 수준에 대한 대사 반응을 연구하기 위해 식물 성장 배지를 변경할 수 있으며, 조명 조건을 조정하거나 다양한 크기의 항아리를 사용하여 성장 기간을 조정할 수 있습니다.
수경재배 또는 반수경재배 조건에서 뿌리 삼출물을 연구하는 것은 주로 저농도 대사산물의 향상된 분해능 때문에 현장에서 표준으로 남아 있다11. 많은 수경재배 접근법은 페트리 접시, 멀티웰 플레이트 또는 기타 작은 용기에 의존하여 무균 및 높은 처리량을 허용하지만 실험을 고습 환경에서 자란 작은 식물 또는 묘목으로 제한합니다 17,18,26,27. 제시된 유리병 설정에서는 비교적 큰 유리병에 의해 충분한 헤드 공간이 제공되어 성장 기간을 연장할 수 있습니다. 미세 기공 테이프 스트라이프는 멸균 상태를 유지하면서 공기 교환을 보호합니다. 따라서 보리와 옥수수와 같은 키가 큰 외떡잎식물도 유리병 설정에서 여러 주 동안 자랄 수 있습니다. A. thaliana와 클로버와 같은 작은 식물은 식물 및 생식 단계를 포함하여 발아 후 4-5 주 동안 연구 할 수 있습니다.
더 큰 식물에도 대체 수경 재배 설정을 사용할 수 있지만 식물 지지대를 위해 메쉬, 폼 보드 및 생착 바구니로 만든 맞춤형 상자와 입구가 필요한 경우가 많습니다 15,28,29,30. 또한 이러한 장치는 일반적으로 멸균 상태로 설정되어 있지 않거나 미생물 및/또는 화학적 오염이 없도록 하기 위해 까다로운 설정 및 유지 관리 절차가 필요합니다. 제시된 실험 시스템에서 무균 상태의 설정 및 유지는 간단합니다. 또한 항아리와 구슬에 유리를 사용하면 플라스틱에서 침출되는 오염 물질의 존재를 줄이고 쉽게 세척하고 재사용할 수 있으므로 자원을 절약할 수 있습니다.
유리 구슬은 이전에 토양 입자를 모방하기 위해 적용되었습니다. 이들은 삼출 트랩(31) 또는 다른 반수경재배 시스템(semihydroponic system)19과 같은 뿌리 삼출물 샘플링 장치에서 자연적인 뿌리 발달을 유도한다. 유리병 설정은 이러한 발전을 이용하고 비드를 미생물의 집락화 표면으로 도입합니다. 토양에서 식물 뿌리 주변의 마이크로바이옴은 공기나 물로 채워진 조밀한 입자와 공간이 있는 반고체 환경에서 진화합니다. 유리병 설정에는 성장 배지의 활성 폭기가 포함되어 있지 않아 하부 액상에 최적의 산소 수준이 포함되지 않을 가능성이 높지만, 더 큰 비드 부피와 더 작은 성장 배지 부피의 조합은 미생물이 산소 조건에서 자랄 수 있는 습하지만 폭기된 상부를 만듭니다. 다른 사람들은 수경재배 성장 시스템들에서 공기 공급을 유지하기 위해 성장 용기들(26,28)을 흔들거나 공기 펌프들(19,29)에 결합된 튜빙들을 사용할 것을 제안하였다. 그러나 이러한 시스템은 멸균되지 않도록 설정되어 있거나 멸균 상태를 유지하기 위해 특수 재료와 지속적인 감시가 필요합니다. 또한 흔들리는 경우 새싹이 성장 용액에 잠기거나 뿌리 시스템이 손상되지 않도록 각별한 주의를 기울여야 합니다. 그럼에도 불구하고, 원하는 경우, 제시된 실험 설정은 폭기를 위한 추가 재료로 조정될 수 있습니다.
신진대사를 조사하는 모든 식물-미생물 상호 작용 연구에서 고려해야 할 중요한 측면은 미생물이 식물 유래 화합물을 분해하고 스스로 대사 산물을 생성한다는 것입니다. 특수 멸균 실험 설정 없이는 식물 및 미생물 유래 대사 산물을 구별할 수 없습니다. 미생물 활동을 억제하고 식물 유래 화합물을 풍부하게 하기 위해, Oburger et al.은 박테리아 분해를 억제하기 위해 뿌리 삼출물 샘플링 용액을 화학적으로 멸균할 것을 제안했다32. 화학적 억제제의 효과는 제시된 실험 시스템에서 억제제와 함께 또는 억제제와 함께 처리되거나 처리되지 않은 멸균 식물과 비멸균 식물의 삼출 프로파일을 비교하여 연구될 수 있습니다.
제시된 유리병 설정의 주요 한계는 성장 조건이 토양에 비해 매우 인공적으로 유지된다는 것입니다. 토양 재배 식물로부터의 삼출물은 종종 침투 시스템(13)으로부터 수집되는데, 여기서 용매 유관은 성장 용기의 기저부에 수집되거나, 또는 식물이 처음에 토양에서 성장한 후 수경재배 조건으로 옮겨지는 토양-수경 하이브리드 시스템(16,33)으로부터 수집된다. 유리병 설정과 달리 이러한 절차는 일반적으로 파괴적이며 변화하는 성장 환경에서 시간이 지남에 따라 여러 수집을 허용하지 않습니다. 또한, 침투 시스템에서는 토양 배경이 삼출물과 함께 샘플링되는 반면, 토양-수경 하이브리드 시스템에서는 삼출액 수집을 위해 수경 재배 조건으로 전환하여 높은 토양 대사 배경의 문제를 피할 수 있습니다. 상처 입은 뿌리를 통한 대사 산물 누출을 줄이기 위해 회복 시간이 시행되었지만11 식물 이동은 매우 파괴적이고 상처가 지속될 가능성이 높으며 식물 대사는 수경 재배 조건으로의 이동에 반응하여 변화할 수 있습니다. 더욱이, 많은 경우에, 삼투압 충격은 적절한 성장 용액(16,33) 대신에 식물을 물로 이동시킴으로써 유도된다. 제시된 프로토콜에서 성장 용액은 삼투압 균형을 유지하기 위해 등몰 용액과 교환되며, 여전히 짧고 정의된 시간 범위 내에서 삼출물을 포착할 수 있습니다. 성장 용액의 변화는 많은 발표된 연구에서 일반적인 관행이며 뿌리 상처 없이 수경 재배 설정에서 쉽게 달성할 수 있습니다 12,16,26,34. 다목적성으로 인해 제시된 실험 시스템은 예를 들어 고체 토양 입자의 존재 여부에 관계없이 멸균 또는 비멸균 토양 추출물을 성장 용액으로 사용하여 보다 자연적인 조건을 모방하도록 쉽게 조정할 수 있습니다. 자연 조건으로의 점진적인 변화는 다양한 물리화학적 토양 특성과 미생물 존재가 식물 대사 및 생리학에 미치는 영향을 연구할 수 있도록 합니다. 과학계가 다양한 환경에서의 삼출물에 대해 잘 이해하기 전에, 토양 기반 시스템과 수경재배 시스템을 병행하여 사용하는 것이 바람직한데, 두 설정 모두 장단점이 있기 때문이다13.
결론적으로, 제시된 반수경법, 유리 기반 실험 설정은 응용 분야의 높은 다양성과 결합된 단순성으로 인해 두드러집니다. 이는 멸균 상태에서 또는 미생물 및 식물-미생물 상호 작용과 함께 삼출물을 수집하고 연구할 수 있는 접근 가능하고 저렴한 방법을 제시합니다.
Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
스위스 취리히 연방공과대학(ETH Zürich)의 Nicola Zamboni 교수와 Uwe Sauer 교수가 직접 주입으로 뿌리 삼출 프로파일을 측정한 데 대해 감사드리며, 바젤 대학의 Klaus Schläppi 교수에게 A . thaliana 공생 박테리아에 대해 감사드립니다. 또한, 스위스 국립과학재단(PR00P3_185831 to J.S., S.M., A.S., E.M.S. 지원) 및 PSC-Syngenta 펠로우십 프로그램(C.J. 지원, Klaus Schläppi 교수 및 J.S. 지원)을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar powder for bacteriology | VWR | 20767.298 | |
| Aluminum foil | FORA GmbH | ||
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 32301-1KG | ACS reagent, Eur >- 98% |
| Autoclave VX-150 | Systec | 1150 | |
| Balance | Sartorius | QUINTIX64-1S | |
| Centrifuge | Hermle Labortechnik GmbH | 305.00 V05 | |
| Cuvettes | Greiner Bio-One | 613101 | |
| Difco LB Broth, Lennox | BD | 240210 | |
| Ethanol | Reuss-Chemie AG | RC-A15-A-005L | |
| Filtered deionized water | Merck Millipore | Milli-Q IQ7000 | |
| Glass beads | Carl Roth | HH56.1 | 5 mm |
| Hydrochloric acid | Merk | 1.00317.1000 | |
| Inoculation loop | Karl Hammacher GmbH | HWO_070-21 | |
| Jars | Weck | 105741 | 850 mL |
| Lyophilizer | Christ | Alpha 2-4 LSCplus | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Carl Roth | 2189.1 | |
| Matrix Orbital thermoshaker | IKA | 10006248 | |
| Microcentrifuge tube | Sarstedt AG & Co. KG | 72.695.500 | SafeSeal reaction tube, 2 mL, PP |
| Micropore tape | 3M | 1530-0 | 1.25 cm x 9.1 m |
| Micropore tape | 3M | 1530-1 | 2.5 cm x 9.1 m |
| Murashige & Skoog Medium (MS) | Duchefa Biochemie | M0221.0050 | |
| Growth chamber | Percival | SE41-TLCU4 | 16 hour light/8 dark. 22 °C day/18 night |
| Phyto agar | Duchefa Biochemie | P1003.1000 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 8.14353.0100 | |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | |
| Sodium hypochlorite solution, 12% Cl | Carl Roth | 9062.4 | |
| Square petri dish | Greiner Bio-One | 688102 | 120x120x17 mm, with vents |
| Stericup Quick release | Millipore | S2GPU05RE | 0.22 µm PES, 500 mL |
| Sterile bench | FASTER S.r.l. | FlowFast H 18 |
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