Summary
Vi presenterer en protokoll for et glassbasert, semihydroponisk eksperimentelt system som støtter veksten av en rekke fylogenetisk distinkte planter med eller uten mikrober. Systemet er kompatibelt med forskjellige vekstmedier og tillater ikke-destruktiv rotekssudatprøvetaking for nedstrømsanalyse.
Abstract
Rotekssudater former plante-jordgrensesnittet, er involvert i næringssyklus og modulerer interaksjoner med jordorganismer. Rotekssudater er dynamiske og formet av biologiske, miljømessige og eksperimentelle forhold. På grunn av deres brede mangfold og lave konsentrasjoner er nøyaktige ekssudatprofiler utfordrende å bestemme, enda mer i naturlige miljøer der andre organismer er til stede, snu planteavledede forbindelser og produsere ytterligere forbindelser selv. Det semihydroponiske glassburkeksperimentelle systemet introdusert her tillater kontroll over biologiske, miljømessige og eksperimentelle faktorer. Det tillater vekst av ulike fylogenetisk distinkte plantearter i opptil flere måneder med eller uten mikrober, i en rekke forskjellige vekstmedier. Den glassbaserte designen gir en lav metabolittbakgrunn for høy følsomhet og lav miljøpåvirkning, da den kan gjenbrukes. Ekssudater kan prøves ikke-destruktivt, og forholdene kan endres i løpet av et eksperiment hvis ønskelig. Oppsettet er kompatibelt med massespektrometrianalyse og andre nedstrøms analytiske prosedyrer. Oppsummert presenterer vi et allsidig vekstsystem egnet for sensitiv rotekssudatanalyse under en rekke forhold.
Introduction
Innenfor tett befolket jord presenterer rhizosfæren en karbonrik nisje. Den er formet av planterøtter via ekssudasjon av opptil 20% av assimilert karbon og har mikrobielle samfunn som er forskjellige fra det bosatte jordmikrobiomet 1,2,3,4,5,6. Som forskere utnytter de fordelaktige funksjonene til rotassosierte mikrober og potensialet for bærekraftig landbruk som følger med det7, har denne observasjonen, ofte betegnet som rhizosfæreffekten, vært fokus for økende vitenskapelig innsats. Men så langt er den kjemiske dialogen mellom mikroorganismer og planter, som foreslås å være driveren av rhizosfæreeffekten, fortsatt dårlig forstått, og derfor er den mekanistiske forståelsen for utvikling av pålitelige mikrobielle løsninger i landbruket begrenset 8,9,10.
Dechiffrering av rotekssudater i jordmiljøer der metabolitter lett absorberes av jordpartikler og raskt snus av mikrobielle samfunn er ikke enkelt, spesielt for plantearter med fine rotsystemer som modellplanten Arabidopsis thaliana11. Dette er grunnen til at det i de fleste studier blir tatt prøver av rotekssudater fra hydroponiske systemer. I disse mikrokosmos holdes luftdeler av planter på plass av tilpassede planteholdere eller mer lavmælte materialer som nett, agar og glassperler. Beholderne som brukes spenner fra petriskåler over flerbrønnsplater til ulike tilpassede og kommersielle bokser med eller uten luftefilter 12,13,14,15,16,17,18,19. Avhengig av systemet vil plantevekstforholdene variere sterkt og gjenspeile naturlige forhold i større eller mindre grad.
Her presenterer vi et glassbasert, semihydroponisk system som er eksperimentelt mottagelig og gir svært reproduserbare resultater. Det er enkelt å montere og bruke og er basert på allment tilgjengelige materialer. Systemet er basert på en glasskrukke fylt med glassperler, og utnytter glassets gjenbrukbare natur og lavbindingsegenskaper (figur 1). Perlene gir fysisk støtte til den voksende planten og simulerer mekanisk impedans, noe som bidrar til mer jordlignende rotarkitektur sammenlignet med hydroponiske oppsett 19,20,21. Hvis de inokuleres med mikrober, presenterer glassperlene overflater for bakterier å feste seg til.
Glassburken kan lukkes for å opprettholde steriliteten, og systemet er utformet for å gi tilstrekkelig headspace og luftsirkulasjon, og unngå et miljø mettet av fuktighet. Krukkene er egnet for langvarig vekst av forskjellige plantearter og kan skaleres opp og ned ved hjelp av krukker i forskjellige størrelser. Her vises applikasjoner for seks plantearter, som dekker C3 og C4 gress, dicots og belgfrukter. Blant dem er modellartene A. thaliana (dicot), Brachypodium distachyon (C3 monocot), Medicago truncatula (belgfrukter), samt avlinger som Solanum lycopersicum (tomat, dicot), Triticum aestivum (hvete, C3 monocot) og Sorghum bicolor (sorghum, C4 monocot). Protokollen som presenteres inkluderer eksperimentelt oppsett av systemet, frøsterilisering og spiring av seks plantearter, transplantasjon av frøplanter til krukker, forskjellige vekstmedier, mikrobeinokulering, rotekssudatprøvetaking og ekssudatbehandling for analyse.
Protocol
1. Forberedelse av frøplanter: Overflatesterilisering av frø
MERK: Overflatesterilisering av frø og alle følgende trinn må gjøres under sterile forhold med mindre annet er angitt. Trinn 1.1 til 1.4 er spesifikke for overflatesterilisering av A. thaliana frø. Andre plantearter har alternative variasjoner i rørstørrelse (avhengig av antall frø og frøstørrelse), tid i løsninger og steriliseringsløsninger (tabell 1).
- Tilsett frø til et mikrosentrifugerør (maksimalt 20 mg frø) og dekk frøene med 70% etanol.
FORSIKTIG: Etanol er brannfarlig. Ikke bruk i nærheten av åpen ild. - Flytt de lukkede mikrosentrifugerørene til en shaker i 15 minutter, og sett rotasjonen slik at frøene blir forsiktig omrørt.
- Fjern forsiktig 70% etanol med en pipette og erstatt den med 100% etanol. Gjenta trinn 1.2.
- Fjern 100% etanol og tørk frøene ved å la mikrosentrifugerørlokkene være åpne i en steril luftstrøm.
- Når frøene er tørre, spred dem jevnt ut på 0,5x Murashige og Skoog (MS) medium med 0,7% fyto-agar ved å knipse røret eller bruke steril tang. Lukk agarplatene og forsegl dem med 1,25 cm mikroporetape.
- Plasser platene horisontalt på en hylle i vekstkammeret (16 t lys / 8 h mørk, 22 ° C dag / 18 ° C natt, 150-160 μmol m-2 s-1).
2. Tilberedning av frøplanter: Overføring av spirefrø til friske plater
MERK: Følgende trinn er spesifikke for A. thaliana og er ikke nødvendige for andre arter.
- Etter spiring, overfør 5 til 6 frøplanter til nye 0,7% fyto-agarplater med 0,5x MS-medium ved å plassere plantene lineært, ca. 3 cm fra toppen (se rosettens posisjon i figur 2D).
- Forsegle agarplater med 1,25 cm mikroporetape og vokse vertikalt i vekstkammeret (figur 2D) til plantene er klare til å overføres i krukker 15-18 dager etter spiring (tabell 2).
3. Klargjøring av hydroponisk system: Jar-oppsett
- Tilsett 150 ml rene 5 mm glassperler i hver rene krukke og lukk med lokket (figur 1A).
MERK: I denne protokollen er 5 mm glassperler egnet for de fleste arter22, men perlestørrelsen kan justeres om ønskelig. - Plasser nok aluminiumsfolie over de lukkede krukkene til å dekke lokk-til-krukke-krysset og autoklaven (121 °C i 20 minutter) (figur 1B).
- Hold de tilberedte krukkene dekket til plantene er klare til å overføres (tabell 2).
4. Forberedelse av hydroponisk system: Tilsetning av frøplanter
- Når plantene er klare til å overføres i krukker (tabell 2), fjern aluminiumsfolien og lokkene på glassene i den sterile benken.
- Hvis glassene skal inokuleres med bakterier, utfør følgende trinn før du går videre til trinn 4.3; Hvis ikke, hopper du over trinn 4.2.
- Bruk en steril inokulasjonssløyfe til å plukke enkeltkolonier fra rene bakteriekulturer på agarplater og suspendere dem i 750 mikrol steril 10 mM MgCl2. Gjenta til løsningen er uklar.
- Valgfritt: Vask suspensjonen 3x med 750 mikrol steril 10 mM MgCl2 ved 5 min sentrifugering ved 1000 × g og romtemperatur etterfulgt av fjerning av supernatanten og resuspendering av pelleten i 750 mikroliter på 10 mM MgCl2.
- Valgfritt: Hvis du inokulerer flere forskjellige bakteriearter, bland suspensjonene av enkeltstammer tilberedt i trinn 4.2.1-4.2.2 i like forhold før du fortsetter.
- Juster den optiske tettheten ved bølgelengden 600 nm (OD600) til 0,2-0,4 i 0,5x MS-medium (pH 5,7 til 5,9, justert med KOH) eller et annet valgt vekstmedium (se trinn 4.3). Mål OD600 igjen for å kontrollere om oppløsningen ble fortynnet riktig.
FORSIKTIG: KOH er etsende; Bruk hansker og labfrakk. - Fortynn suspensjonen ytterligere til OD600 0,002-0,004 i samme medium (1:100 fortynning).
MERK: Endelig celletetthet vil avhenge av bakteriestammen som brukes, men etter vår erfaring tilsvarer dette inokulumet ca. 3-6 × 105 celler ml-1. - Tilsett 35 ml av den endelige fortynningen per krukke. Tilsett 35 ml sterilt vekstmedium for å kontrollere glassene. Rør kulene jevnt med 0,5x MS-medier før planteoverføring slik at røttene ikke tørker. Gå videre til trinn 4.4.
- Tilsett 35 ml 0,5x MS-medium i hver krukke (pH 5,7 til 5,9, juster med KOH). Rør perlene for å belegge jevnt med 0,5x MS-medier før planteoverføring, slik at røttene ikke tørker.
MERK: Vekstmediet kan modifiseres, for eksempel ved fjerning av næringsstoffer, tilsetning av osmolytter for å indusere saltstress, eller bruk av forskjellige pH-verdier eller vekstmedier. FORSIKTIG: KOH er etsende; Bruk hansker og labfrakk. - Plasser 3-5 A. thaliana planter i en krukke ved å plassere rotsystemene mellom glassperlene.
MERK: Antall planter per krukke er forskjellig for andre arter (tabell 2). - Beveg perlene rundt med steril tang eller skjeer for å dekke røttene og løft bladene ut av mediet (figur 1C).
NOTAT: Flytt forsiktig plantene og perlene for å unngå å bryte røttene og stresse plantene. - Legg 2 strimler med 1,25 cm mikroporetape over toppen av glassene og legg lokket forsiktig på toppen (figur 1D-F).
MERK: Ikke trykk ned på lokket for å unngå å hindre luftutveksling. - Dekk gapet mellom lokket og krukken med 2,5 cm mikroporetape for å opprettholde steriliteten samtidig som det tillater luftutveksling, og plasser glassene i et vekstkammer (figur 1G,H).
- Sett opp 4-8 krukker per eksperimentell tilstand, avhengig av det biologiske spørsmålet og variasjonen som forventes.
- Sørg for å inkludere biologiske negative kontroller (f.eks. krukker uten planter) for å ta hensyn til metabolittbakgrunnen til det eksperimentelle systemet. Sett opp samme antall replikater for negative kontroller som for eksperimentelle behandlinger (f.eks. kvadruplikater).
- For lengre vekstperioder, erstatt vekstmediet ukentlig: fjern resten av vekstmediet med en 25 ml volumetrisk pipette og tilsett 35 ml friskt medium.
5. Samling av rotekssudater
- Når plantene når ønsket alder, fjern 2,5 cm mikroporebånd og lokk i den sterile benken.
MERK: For A. thaliana i våre vekstforhold representerer 21 dager etter spiring et modent vegetativt stadium før blomstringen begynner. Fasen av vegetativ utvikling er spesifikk for plantearten, og tidspunktet for vekstperioden endres med plantearter; Denne timingen kan endres avhengig av forskningsspørsmålet. - For sterilitetstesting, aliquot 20 mikrol vekstmedium og pipet på LB agarplater.
- For inokulerte glass teller aliquot 100 μL vekstmedium til bruk for kolonidannende enhet (CFU) (f.eks. i en fortynningsserie23).
MERK: Etter vår erfaring varierer bakterietettheten innen 105-10 8 levende celler ml-1 av vekstmedium.
- For inokulerte glass teller aliquot 100 μL vekstmedium til bruk for kolonidannende enhet (CFU) (f.eks. i en fortynningsserie23).
- Fjern så mye vekstmedium som mulig med en 25 ml volumetrisk pipet, og unngå skade på røttene.
- Tilsett 50 ml oppsamlingsmedium (f.eks. 20 mM ammoniumacetat; pH 5,7-5,9 justert med HCl) ved å pipettere langs veggene i krukken for å unngå fukting av bladene. Lukk glassene med lokk og inkuber dem i sterile forhold for ønsket tid for ekssudatoppsamling. For tidssensitive eksperimenter er 2 timer et godt innsamlingsvindu.
FORSIKTIG: HCl er etsende; Bruk hansker og labfrakk. For lengre rotoppsamlingstider, pakk lokkene igjen med tape og flytt glassene til vekstkammeret. - Etter 2 timer fjernes ønsket mengde oppsamlingsmedier i rør (f.eks. 50 ml for analyser eller analyser ved bruk av konsentrerte ekssudater, eller 2 ml for direkte bruk). Oppbevar de oppsamlede rotekssudatene ved -80 °C inntil videre behandling eller analyse.
- Når du arbeider med inokulerte krukker, sentrifugerer de innsamlede ekssudatene i 10 minutter ved 5000 × g og 4 ° C og bruker bare supernatanter til analysen. Alternativt kan du filtrere ekssudatene med et 0,22 μm eller 0,45 μm filter.
- Hvis eksperimentet er en del av en tidsserie, fjern alt gjenværende oppsamlingsmedium fra krukker og tilsett 35 ml 0,5x MS-medium. Sett på lokket og 2,5 cm tape før glassene settes tilbake i vekstkammeret.
- Mål roten og skyt frisk vekt av alle plantene i en krukke for senere å normalisere rotekssudater etter plantevekt.
MERK: Plantevev kan prøves i tillegg om ønskelig.
6. Prosessering av rotekssudater for massespektrometri
- Avhengig av analysemetoden, frysetørker roten ekssudater for å konsentrere seg og fjerne oppsamlingsmediet (-80 °C ved 0,37 mbar til ingen væske er tilstede). Oppbevares ved -80 °C til den er klar til analyse.
MERK: Dataene som presenteres her ble generert med strømningsinjeksjon TOF-MS-analyse på et nøyaktig kvadrupol time-of-flight-instrument. - Før injeksjon i analyseinstrumentet skal frysetørkede ekssudater eller fortynne ubehandlede rotekssudater rekonstitueres med oppsamlingsmedium i henhold til rotens ferskvekt.
MERK: Oppsamlingsmediet ble valgt for å være kompatibelt med massespektrometeret. Avhengig av analysemetoden kan det imidlertid være nødvendig å avsalte trinn før injeksjon.
Representative Results
Det eksperimentelle systemet introdusert her tillater kontroll av eksperimentelle og miljømessige faktorer som endrer rotekssudasjonsprofiler. Vi sammenlignet A. thaliana-vekst under forskjellige lysforhold, plantealder og plantetetthet på tvers av to forskjellige laboratorier (figur 3). Plantene så friske ut på tvers av laboratorier (figur 3A,B). Kortdagsforhold (10 timers lys vs. 16 timers lys, figur 3) resulterte i høyere rotmasse sammenlignet med langdagsforhold (figur 3C, D). På samme måte var den totale rotmassen av alle planter dyrket i langdagsforhold mindre enn på kort dag (figur 3C). Samlet sett var variasjonen i vekst i og mellom krukker lav på tvers av laboratorier.
Glassburkesystemet er kompatibelt med en rekke plantearter og utviklingsstadier. Endepunktet for rotekssudatanalyse er typisk 21 dager, da mange plantearter under våre eksperimentelle forhold er i et modent vegetativt stadium før de går over til reproduksjonsstadiet (figur 4A-E). Planter kan enkelt fjernes fra det eksperimentelle systemet uten synlig skade på rotsystemet. Dermed er det enkelt å bestemme vevvekter eller bruke vev for nedstrømsanalyse. De høyeste skuddvektene ble funnet for hvete, etterfulgt av durra og tomat. De høyeste rotvektene ble funnet for durra, etterfulgt av hvete og M. truncatula. Root:shoot-forholdet varierer mellom arter. Samlet sett varierte vevsvekten mellom 100 mg og 800 mg.
Et sentralt aspekt ved eksperimentelle systemer som tillater rotekssudatinnsamling er kontrollert inokulering med mikrober for å studere plantemikrobeinteraksjoner i et definert miljø. Det eksperimentelle systemet som presenteres kan holdes sterilt selv ved gjentatt manipulasjon (se "kontrolltilstand" i figur 5), og bakterier kan legges til og opprettholdes i lengre perioder. Når 33 dager gamle A. thaliana-planter ble inokulert med en blanding av kommensale bakterier ved OD600 0,004, vedvarte bakteriene i 12 dager, som var hele varigheten av forsøket (figur 5). Kolonidannende enheter økte til og med 100 ganger i vekstmediet og koloniserte også røttene (figur 5C). Fenotyper av inokulerte planter kunne ikke skilles fra sterile planter (figur 5A,B).
Det presenterte eksperimentelle systemet tillater ekssudatinnsamling under mange eksperimentelle forhold. Her presenterer vi ekssudasjonsprofiler av A. thaliana Col-0 samlet enten i ammoniumacetat eller i vann fra de samme plantene etter hverandre (figur 6A). Ekssudater ble lagret ved -80 °C til analyse, normalisert ved rotvekt, og analysert ved massespektrometri. Prøver av krukker som inneholdt planter ble filtrert mot eksperimentelle kontroller (krukker uten planter). Av 2 163 metabolitter viste 436 et signal over bakgrunnen (20,16 %) og ble beholdt for analyse. Av disse viste 416 eller 95% av forbindelsene tydelig overflod mellom eksperimentelle forhold. Imidlertid kunne 26 metabolitter ikke tilskrives noen form for forbindelse og er derfor ikke definert. De fleste metabolittene (406 eller 98 %) var mer tallrike i vannoppsamlede ekssudater. Den påfølgende samlingen av ekssudater først i ammoniumacetat og senere i vann kan påvirke ekssudasjonsprofilen, da metabolske signaler kan fortynnes med tiden. Det nesten utelukkende høyere ekssudasjonssignalet i vann samlet inn som et andre tidspunkt, støtter imidlertid ikke denne hypotesen: Ekssudatoppsamling i rent vann skaper sannsynligvis et osmotisk sjokk for planter, noe som forårsaker økte metabolittmengder sammenlignet med et oppsamlingsløsningsmiddel ekvimolært med vekstløsningen (20 mM ammoniumacetat er ekvimolært til 0,5x MS medium). Undersøkelse av kjemiske klasser av identifiserte forbindelser av begge vekstbetingelser viste at flertallet av forbindelsene er organiske syrer og derivater (28, 6%) etterfulgt av organiske oksygenforbindelser (18%), organoheterocykliske forbindelser (14, 2%) og lipider (13, 2%). Bare en liten undergruppe av metabolitter tilhører fenylpropanoider og polyketider (8,7%) og benzenoider (6%). Organiske nitrogenforbindelser, nukleosider, organosulfatforbindelser, alkaloider, lignaner og relaterte forbindelser representerer mellom 2% og 0,5% av de klassifiserte forbindelsene (figur 6B). Fordelingen av metabolitter som er avbildet her, tilsvarer allerede publiserte data ved bruk av andre typer rotekssudatesamlingssystemer24.
Figur 1: Oppsett av glassburk. (A) Krukke med glassperler. (B) Krukke med glassperler klar til å bli autoklavert. (C) Frøplanter i krukker (øverste visning). (D) Frøplanter i en krukke (sett ovenfra) med 1,25 cm mikroporetape. (E) Frøplanter i krukker (sett fra siden) med 1,25 cm mikroporetape. (F) Frøplanter i krukker (sett fra siden) med 1,25 cm mikroporetape og lokk. (G) Komplett krukkeoppsett med frøplanter i krukker (sett fra siden) med 1,25 cm mikroporetape, lokk og 2,5 cm mikroporetape. (H) Komplett krukkeoppsett (sett ovenfra). (I) Planter 21 dager gamle og klare for høsting (øverste visning). Krukkestørrelse 147 mm høyde x 100 mm diameter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Overflatesteriliserte frøplanter på 0,5x Murashige og Skoog medium agarplater i et vekstkammer. (A) Arabidopsis thaliana (6 dager gammel), (B) Brachypodium distachyon (6 dager gammel), (C) Medicago truncatula (6 dager gammel), (D) A. thaliana (18 dager gammel). Agarplatestørrelse 120 mm x 120 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Arabidopsis thaliana Col-0 planter dyrket i krukker under kort- og langdags lysforhold. (A) Krukke med tre 33 dager gamle planter dyrket på kort dag (10 t lys / 14 h mørk, 220 μmol m-2 s-1 lysintensitet, 21 ° C dag / 18 ° C natt) og (B) krukke med fem 21 dager gamle planter dyrket i lange dagforhold (16 t lys / 8 h mørk, 150-160 μmol m-2 s-1 lysintensitet, 22 °C dag/18 °C natt). Rotvekt av (C) alle planter av en krukke og (D) av enkeltplanter. ** Representere signifikansverdier av t-test (p < 0,05). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Fem fylogenetisk distinkte arter ved dag 21 i oppsettet av det sterile glassburkesystemet. (A) Modell monocot Brachypodium distachyon, (B) modell belgfrukt Medicago truncatula, (C) dicot Solanum lycopersicum (tomat), (D) dicot Sorghum bicolor, (E) monocot Triticum aestivum (hvete). (F) Frisk vekt av røtter og skudd av arten dyrket i glasskrukker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Arabidopsis thaliana Col-0 (33 dager gammel) dyrket på kort dag. (A) I et sterilt oppsett eller (B) inokulert i 12 dager med et konsortium av kommensale bakterier. (C) Kolonidannende enheter for sterile (kontroll) og inokulerte krukker av vekstsubstratet (venstre) og roten (høyre). N = 4 krukker for steril kontrolltilstand, og n = 8 krukker for inokulert tilstand. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Distinkte rotekssudatprofiler for 21 dager gamle A. thaliana Col-0. Ekssudater ble samlet i 2 timer i sterilt 20 mM ammoniumacetat (pH 5,7) etterfulgt av 2 timers oppsamling i sterilt filtrert avionisert vann. Metabolitter ble detektert ved massespektrometri ved direkte injeksjon. (A) Hovedkomponentanalyse av 436 metabolitter påvist over bakgrunnsnivå (sammenligning av krukker med planter mot krukker uten planter). PC: hovedkomponent med mengden varians forklart. Blå: vannoppsamlede ekssudater, gule: ammoniumacetat-oppsamlede ekssudater. (B) Kakediagram over 416 metabolitter signifikant forskjellig mellom eksperimentelle forhold (Tukey test) farget i henhold til superklasse (https://cfb.fiehnlab.ucdavis.edu/). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Art | Forberedelse av frø | Tid i 70% etanol (min) | Konsentrasjon av natriumhypokloritt (NaClO) (v/v % blekemiddel) | Tid i blekemiddel (min) | ||
| Arabidopsis thaliana | 15 | Ingen; 100% etanol | 15 | |||
| Brachypodium distachyon* | Dehusk | 0.5 | 6 | 5 | ||
| Medicago truncatula*a | 30 | 6 | 30 | |||
| Solanum lycopersicum* | 0.5 | 6 | 5 | |||
| Sorghum bicolor* | Dehusk | 0.5 | 6 | 30 | ||
| Triticum aestivum* | Dehusk | 0.5 | 12 | 20 | ||
Tabell 1: Overflatefrøsteriliseringsmetoder for flere arter. * Vasket 4-5x med filtrert avionisert vann mellom etanol og blekemiddel og på slutten; eninkubasjon i 3-6 timer etter blekemiddel, erstatt med filtrert avionisert vann hvert 30. minutt.
| Art | Dag til krukker | Antall planter |
| Brachypodium distachyon | 4 til 5 | 3 |
| Sorghum bicolor | 4 til 5 | 3 |
| Triticum aestivum | 4 til 5 | 2 |
| Medicago truncatula | 5 til 6 | 3 |
| Solanum lycopersicum | 7 til 8 | 3 |
| Arabidopsis thaliana | 17 | 3 til 5 |
Tabell 2: Alder på frøplanter i dager for overføring til krukker og antall planter per krukke for ulike plantearter.
Discussion
Det eksperimentelle systemet som presenteres her er basert på glasskrukker og glassperler og gir dermed et enkelt, lite vedlikehold og allsidig semihydroponisk system for å studere rotekssudasjon i ulike sammenhenger. Det har blitt brukt i studier som undersøker ekssudasjonsprofilene til forskjellige plantearter25, responsene på ekssudasjon til forskjellige vekstforhold25, samt påvirkning av jordens fysiokjemiske egenskaper på ekssudasjon22. Systemet er egnet for alle plantearter som testes her i lengre vekstperioder, fra uker til måneder. Vedlikehold av sterile forhold er enkelt, det samme er inokuleringen med bakterier, som vedvarer over den analyserte 2-ukers vekstperioden. Dermed tillater det eksperimentelle systemet ikke bare en kontrollert samling av rotekssudater i sterile forhold, men det kan også brukes til å studere plantemikrobe-interaksjoner. Videre kan plantevekstmediene varieres for å studere metabolske responser på forskjellige næringsnivåer, og vekstperioder kan justeres ved å tilpasse lysforholdene eller bruke krukker av ulik størrelse.
Studier av rotekssudater i hydroponiske eller semihydroponiske forhold forblir standard i feltet, hovedsakelig på grunn av den forbedrede oppløsningen av lavkonsentrasjonsmetabolitter11. Mange hydroponiske tilnærminger stole på petriskåler, flerbrønnsplater eller andre små beholdere som tillater sterilitet og høy gjennomstrømning, men begrenser eksperimentering til små planter eller frøplanter dyrket i miljøer med høy luftfuktighet 17,18,26,27. I det presenterte glassburkoppsettet er tilstrekkelig hodeplass gitt av de sammenlignbare store krukkene, noe som gir lengre vekstperioder. Mikropore tape striper sikrer luftutveksling samtidig som steriliteten opprettholdes. Dermed kan selv høye monocots som bygg og mais dyrkes i glassburkoppsettet i flere uker. Små planter som A. thaliana og kløver kan studeres i 4-5 uker etter spiring, inkludert vegetative og reproduktive stadier.
Alternative hydroponiske oppsett er også tilgjengelige for større planter, men disse krever ofte skreddersydde bokser og innløp laget av nett, skumplater og engraftmentkurver for plantestøtte 15,28,29,30. I tillegg er disse enhetene vanligvis ikke satt opp for å være sterile, eller de krever utfordrende oppsetts- og vedlikeholdsprosedyrer for å holde dem fri for mikrobielle og / eller kjemiske forurensninger. Oppsett og vedlikehold av sterilitet i det presenterte eksperimentelle systemet er grei. I tillegg reduserer bruken av glass til krukker og perler tilstedeværelsen av forurensninger som lekker ut fra plast og sparer ressurser da det lett kan vaskes og gjenbrukes.
Glassperler har blitt brukt tidligere for å etterligne jordpartikler. De induserer naturlig rotutvikling i rotekssudasjonsprøvetakingsenheter som ekssudasjonsfeller31 eller andre semihydroponiske systemer19. Glass-krukkeoppsettet utnytter denne utviklingen og introduserer perlene som en koloniseringsoverflate for mikrober. I jord utvikler mikrobiomet rundt planterøtter seg i et halvfast miljø, med kompakte partikler og mellomrom fylt med luft eller vann. Selv om glassburkoppsettet ikke inkluderer aktiv lufting av vekstmediet på grunn av hvilken den nedre væskefasen sannsynligvis ikke inneholder optimale oksygennivåer, skaper kombinasjonen av et større dråpevolum med et mindre vekstmediumvolum en fuktig, men luftet øvre fase hvor mikrober kan vokse under oksiske forhold. Andre har foreslått å riste vekstbeholdere26,28 eller bruke rør koblet til luftpumper19,29 for å opprettholde lufttilførselen i hydroponiske vekstsystemer. Imidlertid er disse systemene enten satt opp for ikke å være sterile, eller krever spesialisert materiale og konstant overvåking for å opprettholde sterilitet. I tillegg, når det gjelder risting, er det mye forsiktighet for å unngå nedsenking av skudd i vekstløsninger og skade på rotsystemer. Likevel, hvis ønskelig, kan det eksperimentelle oppsettet tilpasses med tilleggsmateriale for lufting.
Et avgjørende aspekt å vurdere i alle plantemikrobeinteraksjonsstudier som undersøker metabolisme, er at mikrober nedbryter planteavledede forbindelser og produserer metabolitter alene. Uten et spesialisert sterilt eksperimentelt oppsett er det ikke mulig å skille mellom plante- og mikrobeavledede metabolitter. For å hemme mikrobiell aktivitet og berike planteavledede forbindelser, foreslo Oburger et al. å kjemisk sterilisere rotekssudatprøveløsningen for å hemme bakteriell nedbrytning32. Effekten av kjemiske hemmere kunne studeres i det presenterte eksperimentelle systemet, og sammenligne ekssudasjonsprofiler av sterile versus ikke-sterile planter behandlet med eller uten inhibitoren.
En hovedbegrensning i det presenterte glassburkoppsettet er at vekstforholdene forblir svært kunstige sammenlignet med jord. Ekssudater fra jorddyrkede planter samles ofte enten fra perkolasjonssystemer13, hvor løsningsmiddelgjennomstrømninger samles ved foten av vekstbeholdere, eller jordhydroponiske hybridsystemer, hvor planter først dyrkes i jord og deretter overføres til hydroponiske forhold16,33. I motsetning til glassburkoppsettet er disse prosedyrene vanligvis destruktive, og tillater ikke flere samlinger over tid i skiftende vekstmiljøer. Videre, mens i perkolerende systemer, blir jordbakgrunnen samplet sammen med ekssudatene, i jordhydroponiske hybridsystemer blir problemet med høy jordmetabolsk bakgrunn omgått med overføringen til hydroponiske forhold for ekssudatoppsamling. Selv om gjenopprettingstider er implementert for å redusere metabolittlekkasje via sårede røtter11, er planteoverføringen svært forstyrrende og sår vil sannsynligvis vedvare, og plantemetabolisme kan endres som respons på overføring til hydroponiske forhold. Dessuten induseres et osmotisk sjokk i mange tilfeller ved å overføre planter til vann i stedet for en passende vekstløsning16,33. I den presenterte protokollen byttes vekstløsningen ut med en ekvimolær løsning for å opprettholde osmotisk balanse, som fortsatt tillater å fange ekssudasjon innen et kort, definert tidsvindu. Endringen av vekstløsning er vanlig praksis i mange publiserte studier og kan enkelt oppnås i hydroponiske oppsett uten rotsår 12,16,26,34. På grunn av sin allsidighet kan det eksperimentelle systemet som presenteres lett tilpasses for å etterligne mer naturlige forhold, for eksempel ved å bruke sterilt eller ikke-sterilt jordekstrakt som vekstløsning med eller uten tilstedeværelse av faste jordpartikler. Den gradvise endringen mot naturlige forhold gjør det mulig å studere virkningen av de forskjellige fysiokjemiske jordegenskapene og mikrobiell tilstedeværelse på plantemetabolisme og fysiologi. Før det vitenskapelige samfunnet har en god forståelse av ekssudasjon i ulike miljøer, er det ønskelig å bruke jordbaserte og hydroponiske systemer parallelt, da begge oppsettene har sine fordeler og begrensninger13.
Avslutningsvis skiller det presenterte semihydroponiske, glassbaserte eksperimentelle oppsettet seg ut på grunn av sin enkelhet kombinert med høy allsidighet av applikasjoner. Den presenterer en tilgjengelig, rimelig måte å samle inn og studere ekssudasjon i sterile forhold, eller i kombinasjon med mikrober og plantemikrobeinteraksjoner.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Vi takker Prof. Dr. Nicola Zamboni og Prof. Dr. Uwe Sauer fra ETH Zürich, Sveits, for å bestemme rotekssudasjonsprofilene med direkte injeksjon og Prof. Dr. Klaus Schläppi fra Universitetet i Basel for A. thaliana commensal bakterier. Videre anerkjenner vi Swiss National Science Foundation (PR00P3_185831 til JS, som støtter S.M., A.S., E.M.S.) og PSC-Syngenta Fellowship-programmet (gitt til Prof. Dr. Klaus Schläppi og JS, som støtter CJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar powder for bacteriology | VWR | 20767.298 | |
| Aluminum foil | FORA GmbH | ||
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 32301-1KG | ACS reagent, Eur >- 98% |
| Autoclave VX-150 | Systec | 1150 | |
| Balance | Sartorius | QUINTIX64-1S | |
| Centrifuge | Hermle Labortechnik GmbH | 305.00 V05 | |
| Cuvettes | Greiner Bio-One | 613101 | |
| Difco LB Broth, Lennox | BD | 240210 | |
| Ethanol | Reuss-Chemie AG | RC-A15-A-005L | |
| Filtered deionized water | Merck Millipore | Milli-Q IQ7000 | |
| Glass beads | Carl Roth | HH56.1 | 5 mm |
| Hydrochloric acid | Merk | 1.00317.1000 | |
| Inoculation loop | Karl Hammacher GmbH | HWO_070-21 | |
| Jars | Weck | 105741 | 850 mL |
| Lyophilizer | Christ | Alpha 2-4 LSCplus | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Carl Roth | 2189.1 | |
| Matrix Orbital thermoshaker | IKA | 10006248 | |
| Microcentrifuge tube | Sarstedt AG & Co. KG | 72.695.500 | SafeSeal reaction tube, 2 mL, PP |
| Micropore tape | 3M | 1530-0 | 1.25 cm x 9.1 m |
| Micropore tape | 3M | 1530-1 | 2.5 cm x 9.1 m |
| Murashige & Skoog Medium (MS) | Duchefa Biochemie | M0221.0050 | |
| Growth chamber | Percival | SE41-TLCU4 | 16 hour light/8 dark. 22 °C day/18 night |
| Phyto agar | Duchefa Biochemie | P1003.1000 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 8.14353.0100 | |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | |
| Sodium hypochlorite solution, 12% Cl | Carl Roth | 9062.4 | |
| Square petri dish | Greiner Bio-One | 688102 | 120x120x17 mm, with vents |
| Stericup Quick release | Millipore | S2GPU05RE | 0.22 µm PES, 500 mL |
| Sterile bench | FASTER S.r.l. | FlowFast H 18 |
References
- Sasse, J., Martinoia, E., Northen, T. Feed your friends: do plant exudates shape the root microbiome. Trends in Plant Science. 23 (1), 25-41 (2018).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Lopez, J. L., et al. Growth rate is a dominant factor predicting the rhizosphere effect. The ISME Journal. 17 (9), 1396-1405 (2023).
- Hu, L., et al. Root exudate metabolites drive plant-soil feedbacks on growth and defense by shaping the rhizosphere microbiota. Nature Communications. 9 (1), 2738 (2018).
- Edwards, J., et al. Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (8), 911-920 (2015).
- Bulgarelli, D., et al. Structure and function of the bacterial root microbiota in wild and domesticated barley. Cell Host Microbe. 17 (3), 392-403 (2015).
- Li, J., Wang, J., Liu, H., Macdonald, C. A., Singh, B. K. Application of microbial inoculants significantly enhances crop productivity: A meta-analysis of studies from 2010 to 2020. Journal of Sustainable Agriculture and Environment. 1 (3), 216-225 (2022).
- Escudero-Martinez, C., Bulgarelli, D. Engineering the crop microbiota through host genetics. Annual Review of Phytopathology. 61, 257-277 (2023).
- Poppeliers, S. W., Sanchez-Gil, J. J., de Jonge, R. Microbes to support plant health: understanding bioinoculant success in complex conditions. Current Opinion in Microbiology. 73, 102286 (2023).
- O'Callaghan, M., Ballard, R. A., Wright, D. Soil microbial inoculants for sustainable agriculture: Limitations and opportunities. Soil Use and Management. 38 (3), 1340-1369 (2022).
- Oburger, E., Jones, D. L. Sampling root exudates - Mission impossible. Rhizosphere. 6, 116-133 (2018).
- Yuan, J., et al. Root exudates drive the soil-borne legacy of aboveground pathogen infection. Microbiome. 6 (1), 156 (2018).
- Vismans, G., et al. Coumarin biosynthesis genes are required after foliar pathogen infection for the creation of a microbial soil-borne legacy that primes plants for SA-dependent defenses. Scientific Reports. 12 (1), 22473 (2022).
- Strehmel, N., Böttcher, C., Schmidt, S., Scheel, D. Profiling of secondary metabolites in root exudates of Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 108, 35-46 (2014).
- Song, Y., Pieterse, C. M. J., Bakker, P., Berendsen, R. L. Collection of sterile root exudates from foliar pathogen-inoculated plants. Methods in Molecular Biology. 2232, 305-317 (2021).
- Oburger, E., et al. A quick and simple spectrophotometric method to determine total carbon concentrations in root exudate samples of grass species. Plant Soil. 478 (1-2), 273-281 (2022).
- Koprivova, A., et al. Root-specific camalexin biosynthesis controls the plant growth-promoting effects of multiple bacterial strains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (31), 15735-15744 (2019).
- Gao, J., et al. Ecosystem fabrication (EcoFAB) protocols for the construction of laboratory ecosystems designed to study plant-microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. (134), e57170 (2018).
- Lopez-Guerrero, M. G., et al. A glass bead semi-hydroponic system for intact maize root exudate analysis and phenotyping. Plant Methods. 18 (1), 25 (2022).
- Boeuf-Tremblay, V., Plantureux, S., Guckert, A. Influence of mechanical impedance on root exudation of maize seedlings at two development stages. Plant and Soil. 172, 279-287 (1995).
- Groleau-Renaud, V., Plantureux, S., Guckert, A. Influence of plant morphology on root exudation of maize subjected to mechanical impedance in hydroponic conditions. Plant and Soil. 201, 231-239 (1998).
- Sasse, J., et al. Root morphology and exudate availability are shaped by particle size and chemistry in Brachypodium distachyon. Plant Direct. 4 (7), 00207 (2020).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. Arabidopsis Book. 1, 0039 (2002).
- Monchgesang, S., et al. Natural variation of root exudates in Arabidopsis thaliana-linking metabolomic and genomic data. Scientific Reports. 6, 29033 (2016).
- McLaughlin, S., Zhalnina, K., Kosina, S., Northen, T. R., Sasse, J. The core metabolome and root exudation dynamics of three phylogenetically distinct plant species. Nature Communications. 14 (1), 1649 (2023).
- Badri, D. V., Chaparro, J. M., Zhang, R., Shen, Q., Vivanco, J. M. Application of natural blends of phytochemicals derived from the root exudates of Arabidopsis to the soil reveal that phenolic-related compounds predominantly modulate the soil microbiome. Journal of Biological Chemistry. 288 (7), 4502-4512 (2013).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Nathoo, N., Bernards, M. A., MacDonald, J., Yuan, Z. C. A hydroponic co-cultivation system for simultaneous and systematic analysis of plant/microbe molecular interactions and signaling. Journal of Visualized Experiments. (125), e55955 (2017).
- Nguyen, N. T., McInturf, S. A., Mendoza-Cozatl, D. G. Hydroponics: a versatile system to study nutrient allocation and plant responses to nutrient availability and exposure to toxic elements. Journal of Visualized Experiments. (113), e54317 (2016).
- Yi, Y., Li, Z., Kuipers, O. P. Plant-microbe interaction: transcriptional response of Bacillus Mycoides to potato root exudates. Journal of Visualized Experiments. (137), e57606 (2018).
- Phillips, R. P., Erlitz, Y., Bier, R., Bernhardt, E. S. New approach for capturing soluble root exudates in forest soils. Functional Ecology. 22 (6), 990-999 (2008).
- Oburger, E., et al. Root exudation of phytosiderophores from soil-grown wheat. New Phytologist. 203 (4), 1161-1174 (2014).
- Neal, A. L., Ahmad, S., Gordon-Weeks, R., Ton, J. Benzoxazinoids in root exudates of maize attract Pseudomonas putida to the rhizosphere. PLoS One. 7 (4), e35498 (2012).
- Miao, Y., et al. Exogenous salicylic acid alleviates salt stress by improving leaf photosynthesis and root system architecture in cucumber seedlings. Scientia Horticulturae. 272, 109577 (2020).
