Summary
Dit protocol beschrijft de op maat gemaakte op antilichamen gebaseerde fluorescentie-etikettering en injectie in vroege Drosophila-embryo's om live beeldvorming van eiwitten met een lage abundantie of posttranslationele modificaties mogelijk te maken die moeilijk te detecteren zijn met behulp van traditionele GFP/mCherry-tag-benaderingen.
Abstract
Visualisatie van eiwitten in levende cellen met behulp van GFP (Green Fluorescent Protein) en andere fluorescerende tags heeft het begrip van eiwitlokalisatie, dynamiek en functie sterk verbeterd. In vergelijking met immunofluorescentie geeft live beeldvorming de lokalisatie van eiwitten nauwkeuriger weer zonder mogelijke artefacten die voortvloeien uit weefselfixatie. Belangrijk is dat live beeldvorming kwantitatieve en temporele karakterisering van eiwitniveaus en lokalisatie mogelijk maakt, cruciaal voor het begrijpen van dynamische biologische processen zoals celbeweging of -deling. Een belangrijke beperking van fluorescerende tagging-benaderingen is echter de noodzaak van voldoende hoge eiwitexpressieniveaus om een succesvolle visualisatie te bereiken. Bijgevolg kunnen veel endogeen gelabelde fluorescerende eiwitten met relatief lage expressieniveaus niet worden gedetecteerd. Aan de andere kant kan ectopische expressie met behulp van virale promotors soms leiden tot verkeerde lokalisatie van eiwitten of functionele veranderingen in fysiologische contexten. Om deze beperkingen aan te pakken, wordt een benadering gepresenteerd die gebruik maakt van zeer gevoelige antilichaam-gemedieerde eiwitdetectie in levende embryo's, waarbij in wezen immunofluorescentie wordt uitgevoerd zonder de noodzaak van weefselfixatie. Als bewijs van het principe kan de endogeen GFP-gelabelde Notch-receptor die nauwelijks detecteerbaar is in levende embryo's met succes worden gevisualiseerd na injectie van antilichamen. Bovendien werd deze benadering aangepast om posttranslationele modificaties (PTM's) in levende embryo's te visualiseren, waardoor temporele veranderingen in tyrosinefosforyleringspatronen tijdens de vroege embryogenese konden worden gedetecteerd en een nieuwe subpopulatie van fosfotyrosine (p-Tyr) onder apicale membranen kon worden onthuld. Deze aanpak kan worden aangepast om andere eiwitspecifieke, tag-specifieke of PTM-specifieke antilichamen te accommoderen en moet compatibel zijn met andere injectie-ontvankelijke modelorganismen of cellijnen. Dit protocol opent nieuwe mogelijkheden voor live beeldvorming van eiwitten met een lage abundantie of PTM's die voorheen moeilijk te detecteren waren met behulp van traditionele fluorescerende tagging-methoden.
Introduction
Immunofluorescentie is een hoeksteentechniek van de moderne celbiologie, oorspronkelijk ontwikkeld door Albert Coons, die de detectie van moleculen in hun oorspronkelijke cellulaire compartimenten en karakterisering van de moleculaire samenstellingen van subcellulaire organellen of machinerieën mogelijk maakt. In combinatie met genetische manipulaties helpt immunofluorescentie bij het vestigen van het nu algemeen aanvaarde concept dat eiwitlokalisatie essentieel is voor zijn functie2. Afgezien van specifieke primaire antilichamen en heldere fluorescerende kleurstoffen, is het succes van deze techniek afhankelijk van een voorbereidend proces genaamd fixatie en permeabilisatie, dat cellulaire morfologieën behoudt, antigenen immobiliseert en de toegankelijkheid van antilichamen in intracellulaire compartimenten vergroot. Het is onvermijdelijk dat het fixatie- en permeabilisatieproces cellen zou doden en alle biologische processen zou beëindigen3. Daarom biedt immunofluorescentie alleen momentopnamen van de levensreis van eiwitten. Veel biologische processen, zoals celmigratie en -delingen, zijn echter dynamisch van aard en vereisen onderzoek naar eiwitgedrag op een ruimtelijk-temporeel opgeloste manier 4,5.
Om de eiwitdynamiek in levende organismen te onderzoeken, zijn live beeldvormingsmethoden ontwikkeld op basis van genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten zoals groen fluorescerend eiwit (GFP)6 en hogesnelheidsconfocale microscopen. Kortom, het eiwit van belang kan genetisch worden gemanipuleerd om te worden gefuseerd met GFP7 en vervolgens ectopisch tot expressie worden gebracht uit virale of gistpromotors zoals cytomegalovirus (CMV)8 of stroomopwaartse activeringssequentie (UAS)9. Omdat GFP autofluorescerend van aard is, zijn er geen fluorofoorgekoppelde antilichamen nodig om de lokalisatie van doeleiwitten te onthullen, wat de noodzaak van voorbereidende processen van fixatie of permeabilisatie omzeilt. In de afgelopen twee decennia zijn fluorescerende tags ontwikkeld die het hele spectrum van golflengten bestrijken10, waardoor meerkleurige live-beeldvorming van verschillende doeleiwitten tegelijkertijd mogelijk is. In vergelijking met chemisch gemanipuleerde fluorescerende kleurstoffen zoals AlexaFluor of ATTO, is de autofluorescentie van deze genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten echter relatief zwak en onstabiel wanneer ze tot expressie worden gebracht door endogene promotors, vooral tijdens live beeldvorming over langere tijdschalen10. Hoewel dit tekort kan worden verzacht door fluorescerend gelabelde doeleiwitten tot overexpressie te brengen, verstoren veel enzymatische activiteiten zoals kinasen en fosfatasen de normale biologische processen ernstig als ze niet op fysiologisch niveau tot expressie worden gebracht.
Dit protocol presenteert een methode die fototabele, op antilichamen gebaseerde doelverlichting mogelijk maakt in een live-beeldopstelling, waardoor in wezen immunofluorescentie mogelijk is zonder het proces van fixatie of permeabilisatie (Figuur 1). Door middel van een eenvoudige, op NHS gebaseerde primaire aminereactie11 kan men fluorescerende kleurstoffen zoals AlexaFluor 488 of 594 conjugeren met in wezen elk primair antilichaam of GFP/HA/Myc nanobody12. Door gebruik te maken van een ontwikkelingskenmerk dat alle embryonale cellen van Drosophila een gemeenschappelijk cytoplasma delen tijdens het syncytiumstadium13, kan men antigeenbinding en verlichting bereiken over hele embryo's na de injectie van kleurstofgeconjugeerde antilichamen. Met groeiende bibliotheken van endogeen gelabelde eiwitten die beschikbaar zijn in Drosophila en andere modelsystemen14, kan deze methode mogelijk de toepassingen van deze bibliotheken verbreden door de dynamiek van fluorescerend gelabelde eiwitten met een lage abundantie en andere niet-fluorescerend gelabelde (HA/Myc-gelabelde) eiwitten in levende weefsels te onthullen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en goedkeuring van de School of Life Sciences, SUSTech University. Het gebruikte organisme is Drosophila melanogaster en de genotypen zijn Notch-Knockin-GFP (chromosoom X) en Sqh-sqh-GFP (chromosoom II), genereus geleverd door de laboratoria van respectievelijk Dr. Francois Schweisguth (Institute Pasteur) en Dr. Jennifer Zallen (Sloan Kettering Institute). Hoewel dit protocol zich voornamelijk richt op aspecten van de etikettering van antilichamen en live beeldvorming, verwijzen wij u naar gepubliceerde rapporten voor meer gedetailleerde beschrijvingen van het verzamelen en injecteren van Drosophila-embryo's 15,16.
1. Fluorescerende etikettering van antilichamen
- Gebruik bij voorkeur monoklonale antilichamen of nanobodies voor het betreffende eiwit. Bereid de voorraadconcentratie van antilichamen voor op 1 mg/ml of hoger.
OPMERKING: In dit onderzoek wordt GFP-nanobody (zie Materiaaltabel) als voorbeeld gebruikt. De in de handel verkrijgbare GFP-nanobody is verpakt in een concentratie van 1,0 mg/ml en een volume van 250 μL. Daarnaast wordt een in de handel verkrijgbare antilichaametiketteringskit (zie Materiaaltabel) gebruikt, die Alexa Fluor 594 conjugeert aan primaire aminen van eiwitten via een succinimidylesterreactie11. Belangrijk is dat dit etiketteringsproces de antilichaamconcentratie niet significant verandert. - Bereid een natriumbicarbonaatoplossing van 1 M door component B (meegeleverd in de antilichaametiketteringskit) te resuspenderen in 1 ml gedeïoniseerd water.
- Pas de antilichaamconcentratie aan op 1,0 mg/ml en voeg vervolgens 1/10evolume ( 10 μl voor 100 μl GFP-nanolichaam) van de 1 M natriumbicarbonaatoplossing toe.
- Voeg 110 μL van de antilichaammix (uit stap 1.3) rechtstreeks toe aan de tube met Alexa Fluor 594-kleurstof. Keer om om te mengen (niet vortex) en incubeer op een rotator gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Monteer de zuiveringskolom uit de conjugatieset (zie Materiaaltabel). Bereid een harsbed van 1,5 ml voor (meegeleverd in de antilichaametiketteringskit) en centrifugeer de kolom op 1100 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur (RT) om overtollige vloeistof uit de hars te verwijderen.
- Voeg het reactiemengsel (uit stap 1.4) druppelsgewijs toe aan de bovenkant van de harskolom en centrifugeer bij 1100 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om het gelabelde antilichaam te verzamelen. Het verzamelde antilichaam moet roze van kleur zijn en het volume moet iets minder dan 100 μL zijn. Bewaren in in folie verpakte of donkergekleurde tubes bij 4 °C.
2. Voorbereiding van Drosophila-embryo's
- Plaats 200 pas uitgekomen volwassen Drosophila in een plastic cilindervormige kooi (diameter = 5 cm, hoogte = 8 cm) met een man-vrouwverhouding van 1: 10. Sluit de ene kant af met poreus metalen gaas voor ventilatie en de andere kant met een agarplaat met vruchtensap/gistpasta.
- Vervang de plaat elke 12 uur gedurende drie dagen vóór het verzamelen van embryo's. Dit maakt synchronisatie van het leggen van Drosophila-eieren mogelijk en verbetert de efficiëntie van het verzamelen.
- Vervang de kooi op de dag van injectie in een vruchtensapplaat met minimale gistpasta en verzamel de embryo's gedurende 1 uur bij 25 °C. Als de eerste verzamelronde niet voldoende embryo's oplevert (<50 embryo's), gooi dan de eerste plaat weg en herhaal deze stap voor een tweede verzamelronde totdat er binnen 1 uur meer dan 100 embryo's zijn gelegd.
- Haal de plaat uit de kooi om het leggen van de eieren te stoppen en broed nog 2 uur uit bij 25 °C om embryo's te verkrijgen die 2-3 uur oud zijn. Het juiste stadium van embryo's is van cruciaal belang voor het succes van de injectie van antilichamen.
- Om de eierschaal van embryo's te verwijderen, voegt u 2 ml bleekmiddel van 50% toe aan de vruchtensapplaat en maakt u de embryo's voorzichtig los van de plaat met een penseel (Figuur 2A-4). Vaak worden embryo's direct op de gistpasta gelegd. In dit geval is het acceptabel om de gistpasta in de bleekoplossing te borstelen om alle embryo's te verzamelen.
- Incubeer de drijvende embryo's gedurende 2 minuten in 50% bleekmiddel en draai de fruitsapplaat elke 30 seconden rond om de efficiëntie van het verwijderen van de eierschaal te verbeteren.
- Breng het embryo/bleekmengsel over door het in een 70 μm nyloncelzeef te gieten (Figuur 2A-7). Was de embryo's grondig met een waterfles om eventueel achtergebleven bleekmiddel en gistpasta te verwijderen. Droog de celzeef volledig af met keukenpapier en zorg ervoor dat overtollig water rond de embryo's wordt verwijderd.
3. Uitlijning en uitdroging van embryo's
- Maak een 5 cm x 5 cm x 0,5 cm (breedte, lengte, hoogte) 4% agarosegel (figuur 2A-9) en laat de gel afkoelen tot kamertemperatuur. Snijd een agaroseblok van 1 cm x 3 cm x 0,5 cm (breedte, lengte, hoogte) met een schoon scheermesje en plaats het blok op een glasplaatje (Figuur 2A-2). Onderzoek het gelblok onder de snijschaal om er zeker van te zijn dat de randen recht zijn gesneden en dat het oppervlak vlak en droog is.
- Breng embryo's van de zeef over op het gelblok met behulp van een penseel. Verdeel de embryo's gelijkmatig over de middellijn van het blok door zachtjes te borstelen. Idealiter worden clusters van embryo's gescheiden in enkele of doubletten zonder elkaar aan te raken.
- Maak een pincet klaar met twee poten stevig aan elkaar geplakt om een enkele fijne punt te maken (Figuur 2A-5). Pak onder een ontleedscoop individuele embryo's op met behulp van het pincet en plaats ze langs de lange rand van het gelblok. Lijn 20-30 embryo's uit en zorg ervoor dat hun voorste-achterste as evenwijdig is aan de rand (Figuur 2C).
- Pipetteer 10 μL heptaanlijm (zie Materiaaltabel) in het midden van een dekglaasje van 24 mm x 50 mm (Figuur 2A-1) en verdeel de lijm met behulp van een pipetpunt in een rechthoekig gebied van 0,5 cm x 3 cm. Wacht voor gebruik tot de lijm volledig droog is.
- Plaats het glasplaatje met het gelblok aan de rand van het bureau, met de embryo's naar buiten gericht. Til het dekglaasje met lijm op met een pincet met platte punt (Figuur 2A-6) en houd het stil bovenop de embryo's, met de lijmzijde naar de embryo's gericht in een gekantelde hoek van ongeveer 45 graden.
NOTITIE: Druk het dekglaasje voorzichtig tegen het gelblok zodat de embryo's in contact komen met de lijm, laat dan snel de druk los en til het dekglaasje op. De hoeveelheid spanning die wordt uitgeoefend is van cruciaal belang, zodat embryo's stabiel aan de lijm kunnen worden bevestigd zonder te hard te worden ingedrukt en te barsten. - Pipetteer 10 μL water in het midden van een nieuw objectglaasje en plaats het dekglaasje met de embryo's erop, met de zijkant van het embryo naar boven gericht (figuur 2B). Zorg ervoor dat u water gebruikt in plaats van nagellak of andere zelfklevende lijm om het dekglaasje aan het glasglaasje te bevestigen, aangezien deze kant van het dekglaasje direct op de confocale lens wordt geplaatst voor live beeldvorming.
- Droog de embryo's in een droogkamer (Figuur 2A-3) (zie Materiaaltabel) gedurende 10-15 minuten totdat het vitellinemembraan rimpelt (Figuur 2E). De benodigde tijd kan variëren met de vochtigheid van de kamer en moet experimenteel worden getest voor elke laboratoriumomstandigheid.
- Pipetteer 40 μl halogeenkoolstofolie (een mengsel van type 27 en type 700 in een volumeverhouding van 1:1, zie materiaaltabel) aan het ene uiteinde van de embryostrook. Kantel het glaasje totdat de halogeenkoolstofolie het hele oppervlak van de embryo's bedekt.
4. Antilichaaminjectie en beeldvorming
- Bereid een paar injectieglazen naalden voor met behulp van een micropipettrekker (zie Materiaaltabel voor parameterinstellingen) en vul elke naald met 5 μL AlexaFluor-gelabelde antilichaamoplossing (uit stap 1.6).
- Plaats een dekglaasje van 25 mm x 25 mm op een glasplaatje. Pipetteer 40 μL halogeenkoolstofolie en verdeel dit langs de rand van het dekglaasje.
- Lijn onder de injectiescoop de punt van de naald uit tegen de rand van het dekglaasje onder olie. Stel de injectieluchtdruk van de picopomp zo in (zie Materiaaltabel) dat één pomp één bel met antilichamen genereert. De diameter van de bel moet worden beperkt tot 20-50 μm (Figuur 2F).
- Vervang het lege glaasje door een glaasje met embryo's onder olie. Lijn de punt van de injectienaald loodrecht uit tegen de voorste-achterste as van de embryo's (Figuur 2D,G).
- Controleer het stadium van de embryo's om er zeker van te zijn dat de meeste cellularisatie zijn begonnen, maar nog niet zijn begonnen met gastrulatie (stadium 4 en stadium 5), en blijven als een syncytium (Figuur 2F,G).
OPMERKING: Het kenmerk van deze fase is de afwezigheid van groeven of plooien en de aanwezigheid van een ovaalvormige, donkergekleurde dooierzak die zichtbaar is in het midden van het embryo. Morfologische karakterisering van het embryonale stadium onder olie is gebaseerd op het boekhoofdstuk "Stadia van Drosophila Embryogenesis" door Volker Hartenstein17. - Gebruik de X-Y-stadiummanipulator om embryo's naar de naald te verplaatsen totdat de punt in het midden van de dooier aankomt. Pomp twee tot drie keer om antilichamen in de dooier te injecteren. Een succesvolle injectie wordt aangegeven door het snel verdwijnen van de vitelline-membraanrimpel naarmate embryo's volume krijgen van de antilichaamoplossing (Figuur 2G).
- Gebruik de X-Y-stadiummanipulator om embryo's na injectie weg te halen van de naald en naar beneden te bewegen naar het volgende embryo. Herhaal stap 6 totdat alle embryo's op het objectglaasje zijn geïnjecteerd.
- Breng het objectglaasje met geïnjecteerde embryo's over naar een vochtigheidskamer (Figuur 2A-8). Incubeer bij 25 °C tot het gewenste stadium van embryonale ontwikkeling is bereikt.
- Til het dekglaasje van 24 mm x 50 mm van het objectglaasje en plaats het direct in de objectglaasjeshouder van de microscoop. De kant zonder embryo's zal de doelstellingen onder ogen zien. Lokaliseer de embryo's met behulp van een lens met een lage vergroting onder heldere veldverlichting en schakel over naar een 40x of 63x lens voor fluorescerende live-beeldvorming met hoge resolutie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de voordelen van de antilichaaminjectiemethode ten opzichte van op fluorescerende tags gebaseerde live beeldvorming of immunofluorescentie aan te tonen, worden twee casestudy's gegeven die de dynamische lokalisatie van een transmembraanreceptor met lage abundantie, Notch, en een type posttranslationele modificatie genaamd tyrosinefosforylering in levende embryo's karakteriseren.
Notch-signaleringsactiviteit speelt een belangrijke rol bij het bepalen van het lot van cellen tijdens embryogenese en homeostase van volwassen organen18,19. Na activering door de liganden Delta/Jagged20, wordt het intracellulaire domein van de transmembraanreceptor Notch gesplitst en vrijgegeven in de kern21, waardoor stroomafwaartse transcriptieprogramma's worden geïnitieerd om veranderingen in het lot van de cel te stimuleren22. De statische lokalisatie van de Notch-receptor is goed gekarakteriseerd door immunofluorescentie in formaldehyde-gefixeerde weefsels. De dynamische lokalisatie van Notch tijdens ligandbinding of het intracellulaire splitsingsproces blijft echter grotendeels onbekend23, vanwege het ontbreken van een methode om dit eiwit met een relatief lage abundantie op een snelle manier live in beeld te brengen. Hier injecteerden we AlexaFluor-geconjugeerde GFP-nanobody in embryo's die GFP-gelabelde Notch van de endogene locus20 tot expressie brachten. Zonder injectie is Notch-GFP nauwelijks detecteerbaar onder standaard live beeldvormingsomstandigheden, en het fluorescerende signaal verbleekt snel tijdens time-lapse-beeldvorming. Na injectie verbetert de signaal-ruisverhouding van de Notch-receptor aanzienlijk, vergelijkbaar met de signaalkwaliteit van immunofluorescentie (Figuur 3A). Bovendien maakt antilichaaminjectie de temporele karakterisering van Notch-lokalisatie mogelijk met tussenpozen van 45 s, zonder een duidelijk verlies van signaalintensiteit gedurende een beeldvormingsvenster van 5 minuten (Figuur 3B).
Tyrosinefosforylering is een belangrijk type posttranslationele eiwitmodificatie dat signaaltransductie in veel biologische routesbemiddelt24. Zeer specifieke monoklonale antilichamen (zoals PY20 en 4G10) tegen fosfotyrosine (p-Tyr) zijn ontwikkeld om de lokalisatie en niveaus van algehele tyrosinefosforylering te karakteriseren met behulp van immunofluorescentie en western blots25. Hoewel er geen fluorescerende tags zijn die fosforyleringsveranderingen kunnen volgen, moeten weefsels of cellen op verschillende tijdstippen worden gefixeerd en gekleurd of gelyseerd en gedept om momentopnamen te maken van de fosforyleringsstatus in de loop van de tijd, om de kinetiek van tyrosinefosforylering te bestuderen bij signaalactivering26 (bijv. Behandeling met groeifactoren). Het tijdsinterval van deze aanpak is ten minste enkele minuten lang en inherent onnauwkeurig vanwege de variabele tijd die nodig is voor procedures zoals fixatie of cellyse.
Hier wordt bewijs geleverd dat de antilichaaminjectiemethode de directe visualisatie van de fosforyleringsstatus in levende embryo's mogelijk maakt, waarbij de lokalisatie en intensiteitsveranderingen van tyrosinefosforylering worden gevolgd met regelmatige tijdsintervallen op secondeniveau. AlexaFluor-geconjugeerd PY20-antilichaam werd geïnjecteerd in embryo's die GFP-gelabelde myosine-lichtketen tot expressie brachten en voerde tweekleurige live-beeldvorming uit met tussenpozen van 45 s. Zoals eerder werd aangetoond, is tyrosinefosforylering sterk verrijkt bij tricellulaire juncties27, een patroon dat ook wordt gerecapituleerd door immunofluorescentie (Figuur 4A). Interessant is dat live beeldvorming ook een nieuwe, tweede populatie van p-Tyr-signaal onder het midden van het apicale membraan onthulde, die niet wordt waargenomen met behulp van immunofluorescentie (Figuur 4B). Door middel van tweekleurige beeldvorming werd vastgesteld dat deze populatie van p-Tyr-signaal zich in de buurt bevindt van mediale myosine (Figuur 4B, close-ups), een subpopulatie van myosine28 die op dezelfde manier alleen uitgesproken is in live beeldvormingsomstandigheden, maar nauwelijks detecteerbaar is met behulp van immunofluorescentie. Bovendien vertoont de mediale populatie van p-Tyr vergelijkbare pulserende coalescentie- en dissipatiepatronen (Figuur 4C), zoals eerder aangetoond voor mediale myosine28. De identiteit en functie van een mediale subpopulatie van p-Tyr zijn nog onbekend. Samen tonen deze resultaten aan dat de antilichaaminjectiemethode een grote aanvulling zou kunnen zijn op traditionele benaderingen om het gedrag van eiwitten met een lage abundantie te karakteriseren en nieuwe lokalisatiepatronen te onthullen die mogelijk zijn verstoord tijdens het proces van immunofluorescentie.
Figuur 1: Workflow voor het injecteren van antilichamen. Schematische workflow die de stappen illustreert die betrokken zijn bij de antilichaaminjectiemethode. Het hele proces, van het verzamelen van embryo's tot het injecteren van antilichamen, duurt doorgaans ongeveer 4-5 uur. Na injectie van antilichamen kunnen embryo's in een vochtigheidskamer worden geïncubeerd tot het gewenste ontwikkelingsstadium voordat ze live worden afgebeeld. AEL, na het leggen van eieren; RT, kamertemperatuur; Ab, antilichaam. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Uitlijning en injectie van het embryo. (A) Overzicht van de items die nodig zijn voor injectie, waaronder een dekglaasje, glasplaatje, droogdoos, penseel, pincet, celzeef, vochtigheidskamer en agarosegel. (B) Uitgelijnde embryo's bevestigd aan heptaanlijm in het midden van het dekglaasje en bovenop uitdrogingskralen geplaatst. C) Uitlijning van de voorste en achterste as van de embryo's evenwijdig aan de rand van de agarosegel. (D) Overzicht van de injectie-instelling. (E) Vergelijking van de embryomorfologie voor en na het uitdrogingsproces, met bijzondere aandacht voor de rimpel van het vitellinemembraan na uitdroging. (F) Grootte van de injectiebel na één keer indrukken van de picopomp. (G) Vergelijking van de morfologie van het embryo voor en na de injectie van antilichamen, waarbij de nadruk wordt gelegd op het verdwijnen van membraanrimpels na injectie. (E-G) werden vastgelegd onder een objectieflens met een vergroting van 10x met behulp van helderveldmicroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Live beeldvorming van Notch-receptor in vroege embryo's. (A) Lokalisatie van endogeen GFP-gelabelde Notch-receptor door middel van immunofluorescentie (links), directe live beeldvorming op basis van GFP-autofluorescentie (midden) en AlexaFluor 594-geconjugeerde GFP-nanobody-injectie (rechts). (B) Dynamische lokalisatie van Notch-GFP afgebeeld met tussenpozen van 45 s na injectie van antilichamen. Alle beelden werden verkregen met de voorkant van de embryo's naar links en de ventrale kant naar beneden gericht. Schaalbalken = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Live beeldvorming van embryonale fosfotyrosinepatronen. (A) Lokalisatie van gefosforyleerd tyrosine (p-Tyr) in gefixeerde embryo's door middel van immunofluorescentie. (B) Lokalisatie van p-Tyr (magenta) in levende embryo's die GFP-gelabelde myosine lichte keten tot expressie brengen (groen). Het witte gestippelde vak geeft close-ups aan van de mediale populatie van fosfotyrosine en myosine onder het apicale membraan. Schaalbalken = 10 μm. (C) Lokalisatie van p-Tyr en GFP-myosine elke 45 s in beeld gebracht in levende embryo's. Witte pijlen geven de mediale populatie van p-Tyr en myosine aan. Alle beelden zijn gemaakt met de voorkant van de embryo's naar links en de ventrale kant naar beneden gericht. Schaalbalken = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze gepresenteerde procedure schetst de gespecialiseerde methode van fluorescentie-etikettering met aangepaste antilichamen en daaropvolgende injectie in Drosophila-embryo's in een vroeg stadium. Deze techniek vergemakkelijkt real-time visualisatie van eiwitten of posttranslationele modificaties die in kleine hoeveelheden voorkomen en doorgaans moeilijk te observeren zijn via conventionele GFP/mCherry-taggingmethoden.
Voorzichtigheid is geboden bij het uitbreiden van deze methode om kwantitatieve vergelijkingen te maken tussen wildtype en gemuteerde embryo's. Hoewel de concentratie van primaire en secundaire antilichamen bij immunofluorescentie hetzelfde kan worden gehouden tussen controle- en experimentele groepen, kunnen de hoeveelheid geïnjecteerde antilichamen en de labelefficiëntie variëren tussen embryo's. Daarom moet kwantitatieve analyse worden beperkt tot het volgen van veranderingen in fluorescerende intensiteit in de loop van de tijd of het uitvoeren van correlatieanalyse met signalen van andere kanalen in hetzelfde embryo bij het uitvoeren van meerkleurige live-beeldvorming. Lokalisatie- en correlatieanalyse kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd met behulp van p-Tyr- en myosine-intensiteiten27, terwijl p-Tyr-intensiteiten niet direct kunnen worden vergeleken tussen wildtype en gen-X knockdown-embryo's met behulp van de antilichaaminjectiemethode.
Net als bij andere op fluorescerende tags gebaseerde benaderingen om de eiwitdynamiek te onderzoeken, kan antilichaambinding mogelijk de activiteit, handel of lokalisatie van doeleiwitten veranderen. Daarom hebben monoklonale antilichamen of nanobodies de voorkeur boven polyklonale antilichamen voor injectie. Omdat de epitopen van monoklonale antilichamen of nanobodies goed gedefinieerd zijn, kan worden gemodelleerd of het blokkeren van deze epitopen met antilichamen de eiwitactiviteit verandert, op basis van alfa-vouwstructuren12,25. Aan de andere kant zijn epitopen van polyklonale antilichamen niet precies afgebakend, en hun binding kan mogelijk de lokalisatie of activiteit van eiwitten veranderen als katalytische pockets of signaalpeptiden van doeleiwitten worden geblokkeerd. Ten tweede kunnen antilichamen andere niet-specifieke epitopen dan doeleiwitten herkennen, vooral gezien het feit dat er hier geen "uitwas"-stappen zijn, zoals bij immunofluorescentie, om niet-specifieke bindingen met een lagere affiniteit te verwijderen. Daarom is het belangrijk om controlegroepen te hebben, zoals het injecteren van antilichamen in cellen zonder het epitoop, om te verifiëren of het waargenomen signaal echt de doeleiwitten of andere niet-specifieke epitopen weerspiegelt.
Het injecteren van antilichamen verschilt qua experimentele opzet niet van het injecteren van siRNA of CRISPR-gRNA's. Daarom moeten de meeste cellulaire systemen die vatbaar zijn voor injecties compatibel zijn met de antilichaaminjectiemethode. In Drosophila-embryo's zijn Alexa Fluor-geconjugeerde antilichamen stabiel tijdens de ontwikkeling en fluorescerende signalen blijven detecteerbaar na uren embryogenese. Voor andere systemen, zoals Xenopus- of zebravisembryo's, moeten de concentratie en het injectievolume van antilichamen empirisch worden getest door middel van seriële verdunningen om een ideale etiketteringsefficiëntie te bereiken. Bovendien kunnen alternatieve fluorescerende kleurstoffen zoals ATTO10 mogelijk een betere signaal-ruisverhouding en oplosbaarheid in water bieden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
We willen Dr. Jennifer A. Zallen bedanken voor het leveren van de Sqh-GFP Drosophila-lijn en ondersteuning voor de eerste ontwikkeling van deze techniek, en Dr. Francois Schweisguth voor het leveren van de Notch-GFP Drosophila-lijn . Dit werk werd ondersteund door financiering van de National Natural Science Foundation of China (32270809) aan HHYU, genereuze financiële en personeelssteun van de School of Life Sciences, SUSTech, en financiering aan Y. Yan van de Shenzhen Science and Technology Innovation Commission/JCYJ20200109140201722.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sangon Biotech | A620014 | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20185 | Purification column from step 1.6 is included in this kit |
| Biological Microscope | SOPTOP | EX20 | Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25 |
| Bleach | Clorox® | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5245 | |
| Cell Strainer | FALCON | 352350 | |
| Desiccation chamber | LOCK&LOCK | HSM8200 | 320ml |
| Dissecting Microscope | Mshot | MZ62 | Eyepiece lens: WF10X/22mm. |
| Double-sided Tape | Scotch | 665 | |
| Fine Super Tweezer | VETUS | ST-14 | |
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545F | |
| Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Forcep | VETUS | 33A-SA | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | H2198-1L | Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane |
| Dehydration reagent | TOKAI | 1-7315-01 | Fill to 90% volume of the dessication chamber |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50 |
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV 830 | Eject: 20 psi; Range: 100ms; Duration: timed |
| PY20 | Santa Cruz | SC-508 | |
| Square petri dishes | Biosharp | BS-100-SD | |
| GFP nanobody | Chromotek | gt |
References
- Coons, A. H.
- Arthur, G., et al.
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H.
- Ragkousi, K., Gibson, M. C. Epithelial integrity and cell division: Concerted cell cycle control. Cell Cycle. 17 (4), 399-400 (2018).
- Herszterg, S., Leibfried, A., Bosveld, F., Martin, C., Bellaiche, Y. Interplay between the dividing cell and its neighbors regulates adherens junction formation during cytokinesis in epithelial tissue. Developmental Cell. 24 (3), 256-270 (2013).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, aequorea. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Boshart, M., et al. A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell. 41 (2), 521-530 (1985).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2016).
- Berg, E. A., Fishman, J. B. Labeling antibodies using N -Hydroxysuccinimide (NHS)-fluorescein. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (3), (2019).
- Saerens, D., et al. Identification of a universal VHH framework to graft non-canonical antigen-binding loops of camel single-domain antibodies. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 597-607 (2005).
- Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (6), 2199-2203 (1995).
- Lye, C. M., Naylor, H. W., Sanson, B. Subcellular localisations of the CPTI collection of YFP-tagged proteins in Drosophila embryos. Development. 141 (20), 4006-4017 (2014).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 50, e2477 (2011).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 49, e2503 (2011).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 9-102 (1997).
- Ho, D. M., Artavanis-Tsakonas, S.
- Kopan, R., Ilagan,, Ma, X. G. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
- Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
- Struhl, G., Greenwald, I. Presenilin is required for activity and nuclear access of Notch in Drosophila. Nature. 398 (6727), 522-525 (1999).
- Henrique, D., Schweisguth, F. Mechanisms of Notch signaling: a simple logic deployed in time and space. Development. 146 (3), dev172148 (2019).
- Trylinski, M., Mazouni, K., Schweisguth, F. Intra-lineage fate decisions involve of notch receptors basal to the midbody in drosophila sensory organ precursor cells. Current Biology. 27 (15), 2239.e3-2247.e3 (2017).
- Hunter, T. Protein kinases and phosphatases: The Yin and Yang of protein phosphorylation and signaling. Cell. 80 (2), 225-236 (1995).
- Glenney, J. R., Zokas, L., Kamps, M. P.
- Hunter, T., Cooper, J. A. Epidermal growth factor induces rapid tyrosine phosphorylation of proteins in A431 human tumor cells. Cell. 24 (3), 741-752 (1981).
- Yu, H. H., Zallen, J. A. Abl and Canoe/Afadin mediate mechanotransduction at tricellular junctions. Science. 370 (6520), eaba5528 (2020).
- Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin–myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
