Summary
Denne protokollen beskriver en tilnærming for å utføre kalsiumavbildning i virusinfiserte humane tarmorganoider og tilbyr en tilnærming til analyse.
Abstract
Kalsiumsignalering er en integrert regulator av nesten alle vev. Innenfor tarmepitelet er kalsium involvert i regulering av sekretorisk aktivitet, aktindynamikk, inflammatoriske responser, stamcelleproliferasjon og mange andre ukarakteriserte cellulære funksjoner. Som sådan kan kartlegging av kalsiumsignaldynamikk i tarmepitelet gi innsikt i homeostatiske cellulære prosesser og avdekke unike responser på ulike stimuli. Humane intestinale organoider (HIO) er en høykapasitets, menneskeavledet modell for å studere tarmepitelet og dermed representere et nyttig system for å undersøke kalsiumdynamikk. Dette papiret beskriver en protokoll for å stabilt transdusere HIOer med genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECIs), utføre live fluorescensmikroskopi og analysere bildebehandlingsdata for å meningsfullt karakterisere kalsiumsignaler. Som et representativt eksempel ble 3-dimensjonale HIOer transdusert med lentivirus for stabilt å uttrykke GCaMP6s, en grønn fluorescerende proteinbasert cytosolisk GECI. De konstruerte HIO-ene ble deretter spredt i en encellesuspensjon og sådd som monolag. Etter differensiering ble HIO monolayers infisert med rotavirus og/eller behandlet med legemidler kjent for å stimulere en kalsiumrespons. Et epifluorescensmikroskop utstyrt med et temperaturkontrollert, fuktet levende bildekammer tillot langtidsavbildning av infiserte eller medikamentbehandlede monolag. Etter avbildning ble innhentede bilder analysert ved hjelp av den fritt tilgjengelige analyseprogramvaren, ImageJ. Samlet sett etablerer dette arbeidet en tilpasningsdyktig pipeline for karakterisering av cellulær signalering i HIOer.
Introduction
Kalsium er en vidt bevart andre budbringer som spiller en kritisk rolle i regulering av cellulær fysiologi1. Gitt sin sterke ladning, liten størrelse og høy oppløselighet under fysiologiske forhold, er kalsium en ideell manipulator av proteinkonformasjon. Dette gjør kalsium til et kraftig middel for å transdusere elektrokjemiske signaler til enzymatiske, transkripsjonelle eller posttranskripsjonelle endringer. De strenge kalsiumkonsentrasjonsgradientene over endoplasmatisk retikulum (ER) og plasmamembraner skaper en høy drivkraft som muliggjør raske endringer i cytosolisk kalsiumkonsentrasjon. Flere mekanismer, inkludert både bufring og aktiv transport, opprettholder denne gradienten tett. Selv om det er nødvendig for normale cellulære funksjoner, er dette vedlikeholdet energisk dyrt, noe som gjør det spesielt utsatt i tilstander av stress 2.
Som sådan er dysregulering av kalsium i cytosolen et nesten universelt signal om mange typer cellulær stress. Metabolske forstyrrelser, toksiner, patogener, mekanisk skade og genetiske forstyrrelser kan alle forstyrre kalsiumsignalering. Uavhengig av stimulansen, på helcellenivå, kan vedvarende, ukontrollerte økninger i cytosolisk kalsium fremme apoptose og til slutt nekrose 3,4. Endringer i cytosoliske kalsiumnivåer med lavere amplitude eller høyere frekvens har imidlertid varierende effekter2. På samme måte kan resultatene av kalsiumfluktuasjoner variere basert på det romlige mikrodomenet der de forekommer5. Overvåking av kalsiumnivåer kan derfor gi innsikt i dynamiske signalprosesser, men dette krever prøvetaking med relativt høy tidsmessig og romlig oppløsning.
Genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECI) er kraftige verktøy for kontinuerlig prøvetaking i levende cellesystemer6. Noen av de mest brukte GECIene er GFP-baserte kalsiumresponsive fluorescerende proteiner kjent som GCaMPs7. Den kanoniske GCaMP er en fusjon av tre forskjellige proteindomener: en sirkulær permutert GFP (cpGFP), calmodulin og M136. Calmodulin-domenet gjennomgår en konformasjonsendring ved binding av kalsium, slik at dets interaksjon med M13. Calmodulin-M13-interaksjonen induserer en konformasjonsendring i cpGFP som øker dens fluorescerende utslipp ved eksitasjon. Som sådan korrelerer en økning i kalsiumkonsentrasjon med en økning i GCaMP-fluorescensintensitet. Disse sensorene kan være cytosoliske eller målrettet mot spesifikke organeller8.
I likhet med de fleste vev regulerer kalsium en rekke funksjoner i mage-tarmepitelet. Tarmepitelet er integrert for nærings- og væskeabsorpsjon, men må også danne en tett barriere og immungrensesnitt for å unngå patogeninvasjon eller giftige fornærmelser. Kalsiumavhengige veier påvirker nesten alle disse vitale funksjonene 9,10,11. Imidlertid er kalsiumsignalering i tarmepitelet fortsatt en underutforsket grense med lovende potensial som terapeutisk mål. Mens overvåking av kalsiumdynamikk i tarmepitelet in vivo fortsetter å presentere utfordringer, tilbyr humane tarmorganoider (HIO) et tilpasningsdyktig ex vivo-system for eksperimentering12. HIO er 3-dimensjonale (3D) sfæroider avledet fra humane intestinale stamceller, og ved differensiering rekapitulerer mye av det cellulære mangfoldet i det opprinnelige tarmepitelet12.
Denne protokollen beskriver omfattende metoder for å konstruere HIOer som uttrykker GECI og deretter forberede konstruerte HIOer som monolayers for kalsiumavbildning av levende celler. Det gir virusinfeksjon som et eksempel på en patologisk manipulasjon som forstyrrer kalsiumsignalering og gir en analytisk tilnærming for å kvantifisere disse endringene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle humane tarmorganoider (HIOer) som brukes i denne protokollen, og de representative forsøkene, ble avledet fra humant vev oppnådd og vedlikeholdt av Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core. Alle prøver ble samlet inn i samsvar med en protokoll godkjent av Institutional Review Board ved Baylor College of Medicine.
1. Fremstilling av materialer og reagenser
- For organoid vedlikehold, samle cellekulturbehandlede 24-brønnsplater, kjellermembranmatrise (BMM), 15 ml koniske rør og 1,5 ml koniske rør.
- For å forberede komplette medier uten vekstfaktorer (CMGF-), tilsett 500 ml avansert DMEM F12 5 ml 1M HEPES, 5 ml 100x antibiotika-antimykotisk, 5 ml 100x glutamintilskudd.
- For å forberede Wnt-, R-spondin- og Noggin-holdige (WRNE) medier, bland like deler CMGF- og Wnt-betingede medier, tilsett Noggin-kondisjonert medium, 10 volumprosent, R-spondinbetinget medium, 20 volumprosent, 50 ng/ml human epidermal vekstfaktor, 10 mM nikotinamid, 10 nM [Leu15]-Gastrin I, 500 nM A-83-01, 10 μM SB202190, 1x B27-supplement, 1x N2-tilskudd og 1 mM N-acetylcystein.
- For lentiviral transduksjon, klargjør Fetal Bovine Serum (FBS), 0,05% Trypsin-EDTA i 1x fosfatbufret saltvann (PBS), CMGF- med 10% FBS, Steril 1x PBS, Polybrene, 10 μM Y-27632, Lentivirus, High Wnt WRNE + 10 μM Y-27632
- For å generere organoide monolayers, klargjør glassbunn 10-brønns cellekulturlysbilde, FBS, kollagen IV (1 mg / ml i deionisert (di) H2O), kjellermembranmatrise, 0,5 mM EDTA i 1x PBS, 5 mM EDTA i 1x PBS, enzymatisk dissosiasjonsbuffer, CMGF- med 10% FBS, WRNE + 10 μM Y-27632.
- For virusinfeksjon av organoide monolayers, klargjør trypsin, rotavirusstam, CMGF-, 25G nål, sterilt 1x PBS og fenolfritt differensieringsmedium.
- For å forberede fenolfrie differensieringsmedier, ta 500 ml fenolfritt cellekulturmedium, tilsett 5 ml 100x MEM ikke-essensielle aminosyrer, 5 ml 100x L-glutamin, 5 ml 100 nM natriumpyruvat og 7,5 ml 1M HEPES.
- For immunfluorescensfarging av organoider, lag 4% formaldehyd (16% formaldehyd fortynnet i 1x PBS), Triton X-100 (0,1% Triton X-100 i 1x PBS), Bovint serumalbumin (3% bovint serumalbumin i 1x PBS), NH4Cl-oppløsning (50 mM), DAPI (1 μg / ml DAPI-oppløsning i 1x PBS).
2. Engineering organoider for å uttrykke genetisk kodede kalsiumsensorer
MERK: Denne protokollen beskriver trinnene for å transdusere en enkelt brønn av 3-dimensjonale humane intestinale organoider belagt i 30 μL Basement Membrane Matrix (BMM) på en 24-brønnsplate13. De fleste linjene vil inneholde rundt 400 000 celler per brønn. En annen, ikke-transdusert brønn bør inkluderes som en kontroll. Oppbevar alle reagenser og cellesuspensjoner på is.
- Etter 2-5 dager fra siste passasje, fjern vedlikehold WRNE medium fra to brønner av HIOer. Bytt ut med 300 μL 0,05 % Trypsin-EDTA per brønn og pipetter forsiktig opp og ned 5x for å løsne BMM-en fra platen. Legges i en 37 °C inkubator i 4 minutter.
- Tilsett 500 μL CMGF- + 10% FBS per brønn. Forbelegg en 1 ml lavbindende pipettespiss med FBS ved å pipetere 1 ml FBS opp og ned 2x. FBS kan gjenbrukes på flere spisser. Med den forhåndsbelagte spissen pipetterer du HIO-ene opp og ned 10x.
- Overfør innholdet i hver brønn til sitt eget forhåndsbelagte 1,5 ml mikrosentrifugerør. Skyll hver brønn med ytterligere 500 μL CMGF- og tilsett vasken til det respektive røret.
- Sentrifuger rørene ved 100 x g i en svingende bøttestifuge i 5 minutter ved 4 °C. Fjern supernatant og eventuell gjenværende BMM.
- Resuspender i 1 ml 1x PBS. Del hvert rør i to mikrosentrifugerør for totalt 4 rør. Sentrifuger rørene ved 100 x g i 5 minutter ved 4 °C. Fjern supernatant.
- Resuspender hvert rør en ekstra gang i 1x PBS og sentrifuge ved 100 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Klargjør 400 μL transduksjonsmedium og kontrollmedium (tabell 1). Resuspender 2 rør i 200 μL av kontrollmediet og 2 rør i 200 μL av transduksjonsmediet.
- Inkuber i en cellekulturinkubator på 37 °C i 24 timer. Resuspenderes ved å pipettere opp og ned med en belagt spiss med jevne mellomrom (f.eks. 2 timer etter transduksjon (hpt), 12 hpt, 18 hpt) for å oppmuntre til jevn transduksjon.
- Etter 24 timer, sentrifugerør ved 100 x g i 5 minutter ved 4 °C. Fjern supernatant.
- Resuspender pellet i 500 μL på 1x PBS for å vaske. Sentrifuge ved 100 x g i 5 minutter ved 4 °C. Fjern supernatant.
- Bruk en iskald 200 μL pipettespiss til å resuspendere hver av de 4 pelletsene i 30 μl BMM. Pipetter forsiktig opp og ned for å spre jevnt.
- Plate innholdet i hvert rør i sin egen brønn på en 24-brønnsplate. Inkuber i 10 minutter ved 37 °C for å la BMM stivne før du tilsetter 500 μL HighWnt WRNE + 10μM Y-27632.
- La transduserte HIO-er vokse i 1 uke, og forfrisk mediet (HighWnt WRNE + 10 μM Y-27632) annenhver dag. Etter 1 uke, kontroller uttrykket av fluorescerende indikator ved mikroskopi. Hvis signalet er sterkt, begynn stoffvalg. Hvis signalet er svakt, gjenta transduksjonen som beskrevet ovenfor.
- Når linjen er etablert, må du kontrollere funksjonen til fluorescensindikatoren via agonistbehandling. 100nM ADP er en pålitelig agonist for GCaMP-validering. Test 3D-organoider for innledende validering som beskrevet nedenfor.
- Etter en passasje, plate en brønn (eller flere) organoider i BMM på en separat bildebunnplate. Plate organoider på omtrent 1/3 av normal tetthet for å unngå overflødig overlapping ved avbildning. Ikke fortsett å passere disse HIOene etter agonistbehandling, da det er vanskelig å sikre sterilitet.
- Tillat 2-3 dager for HIOene å komme seg etter passering. Før avbildning bytter du mediet til fenolfrie differensieringsmedier.
- Ved hjelp av et fluorescerende mikroskop, sett opp en 3 minutters løpetur med bilder tatt hver 5. s ved hjelp av 488 nm eksitasjon og et FITC / GFP-filtersett. Etter 30 s bildebehandling, legg til 100 nM ADP eller kjøretøykontroll. Fortsett avbildningen til signalet går tilbake til nær grunnlinjen, ~2 min. En forbigående, ~ 2 ganger økning i GCaMP-fluorescens med ADP-behandling indikerer vellykket transduksjon og biosensorfunksjon. For mer presis estimering av transduksjonseffektivitet, gjenta agonisttest med avbildning ved bruk av monolag generert via prosessen beskrevet i del 3.
3. Fremstilling av HIO monolayers for live fluorescensavbildning
- Belegg alle brønnene i et 10-brønns avbildningsbunnkammer med kollagen IV. For å gjøre dette, bland 34 μL 1 mg / ml kollagen IV med 960 mikrol sterilt avionisert vann. Tilsett 95 μL fortynnet kollagen IV-oppløsning til hver brønn og inkuber ved 37 °C i 0,5-2 timer.
- Fjern WRNE-vedlikeholdsmediet fra 4 brønner med 3D HIO-brønner. HIO bør være 5-7 dager fra siste passering.
MERK: 1 10-brønns plate krever vanligvis ~ 1,25 x 106 celler. Dette krever vanligvis 2-4 brønner med 3D HIOer belagt med 30 μL BMM hver, men vil variere basert på tetthet. - Tilsett 500 μL 1x PBS + 0,5 mM EDTA per brønn. Med en forhåndsbelagt spiss på 1 ml pipett pipetten forsiktig opp og ned for å løsne BMM fra platen. Overfør suspensjonen til et forhåndsbelagt 15 ml konisk rør, som kombinerer like brønner i samme rør.
- Skyll hver brønn med ytterligere 500 μL PBS + 0,5 mM EDTA. Sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten og gjenværende BMM.
- Bruk en forhåndsbelagt spiss til å resuspendere den gjenværende pelleten i 3 ml PBS + 5 mM EDTA (merk at dette er 10 ganger mer EDTA enn den første vasken).
- Sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten og gjenværende BMM. Resuspender pelleten i 2 ml enzymatisk dissosiasjonsbuffer.
- Inkuber i 37 °C perle/vannbad i 5 minutter. Tilsett 3 ml CMGF- + 10% FBS og pipette forsiktig for å blande.
- Sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten. Tilsett 1 ml CMGF-.
- Kraftig pipette opp og ned med en forhåndsbelagt spiss 80x-100x for mekanisk å bryte HIOer i enkeltceller. Sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. Fjern supernatant.
- Resuspender i 1 ml WRNE + 10 μM Y-27632. Få et celletall for 1 ml suspensjonen.
- Fortynn cellesuspensjonen med WRNE + 10μM Y-27632 for å oppnå en konsentrasjon på 1,25 x 105 celler/100 μL (1,25 x 106 celler/ml).
- Bruk en 200 μL pipette til å fjerne kollagenoppløsningen fra platen som ble fremstilt i trinn 1, da kollagenet nå har lagt seg til bunnen av brønnen. Unngå å berøre bunnen av brønnen med pipettespissen.
- Bruk en forhåndsbelagt 200 μL pipettespiss til å tilsette 100 μL av celleløsningen fra trinn 3,11 (1,25 x 105 celler) per brønn.
- Inkuber i 24 timer i en cellekulturinkubator på 37 °C. Etter 24 timer, fjern kulturmediet fra alle brønner og erstatt det med 100 μL differensieringsmedium per brønn.
MERK: På dette tidspunktet skal cellene feste seg til platen. Merk at monolaget sannsynligvis ikke vil være sammenflytende eller helt plan. - Plasser lysbildet tilbake i 37 °C cellekulturinkubatoren. Oppdater differensieringsmediet hver 24. time til monolaget er sammenflytende. Dette krever vanligvis 3-5 dager fra plating. Etter dette punktet er monolagene klare for nedstrømsapplikasjoner.
4. Virusinfeksjon av HIO monolayers
- Forbered virusinokulumet. Om nødvendig, trypsin aktivere viruslageret. For rotavirus, tilsett 10 μg / ml Worthingtons Trypsin til viruslagrene og inkuber ved 37 ° C i 1 time.
- Fortynn den aktiverte virusbestanden ved hjelp av en av de to følgende metodene.
- Hvis du sikter mot maksimalt antall infiserte celler ved bruk av bare en virusstamme, bland 50 μL av den aktiverte virusstammen med 50 μL CMGF-.
- Hvis du sammenligner flere stammer, må du forberede inokulumene for å oppnå ekvivalente infeksjonsmultiplikasjoner (MOI). Bruk følgende formel for å bestemme volumet av viruslager per brønn som er nødvendig for ønsket MOI. Legg CMGF- til volumet av viruslager beregnet for å oppnå et endelig volum på 100 μL per brønn.
MERK: Et enkelt HIO-monolag belagt i en brønn med en diameter på 5,46 mm (96-brønnsplate) inneholder ca. 200 000 celler. På grunn av den dårlige effektiviteten av infeksjon i monolayers, foretrekkes en høy MOI (100-1 million virale partikler per celle). Den optimale MOI må bestemmes empirisk.
- Infiser monolagene ved forsiktig å fjerne mediet fra HIO monolaget med en 200 ml pipette. Bytt ut med 100 ml virusinokulum eller mock inoculum.
- Siden de fleste rotavirusbestandene er forplantet i MA104-celler, bruk et uinfisert MA104-cellelysat for mock inoculum. Bruk et volum tilsvarende volumet av viruslager som brukes for de infiserte brønnene og legg til CMGF- for et endelig volum på 100 ml per brønn.
- For virus som infiserer celler basolateralt, for eksempel rotavirus14, bruk en 25G nål for å score monolaget. Det er lettest å lage en enkelt poengsum over monolagets lengde, fra bunnen til toppen av brønnen. Trykk kanylen forsiktig inn i monolaget i en vinkel med skråkantsiden opp, motsatt bevegelsesretningen, og dra den over lengden på monolaget for å lage et arr (figur 2A).
- Inkuber i en 37 °C inkubator i 2 timer. Fjern viruset og spott inokulum. Vask monolayers en gang med 1x PBS.
- Tilsett 100 μL fenolfritt differensieringsmedium. Plasser lysbildet i en 37 ° C inkubator til klar til bilde. Det optimale bildevinduet vil variere basert på kinetikken til virusinfeksjonen. For rotavirus, begynn avbildning 6-8 timer etter infeksjon.
- Fortynn den aktiverte virusbestanden ved hjelp av en av de to følgende metodene.
5. Ca2+ Avbildning av infiserte monolayers
- Forvarm scene-topp inkubatoren til 37 ° C. Kjør fuktet CO2 ved 0,02 l / min. Plasser lysbildet med de infiserte monolayers inn i inkubatorkammeret og forsegle lokket.
- Bruk lysfeltbelysning (BF) og et 20x-mål til å velge X- og Y-koordinatene for synsfeltene i monolaget som skal avbildes. Det er best å velge punkter med det scorede området i sikte, da de fleste infiserte celler vil være nær ripen.
- Optimaliser bildeparametere og skaff deg et bilde ved hjelp av 488 nm eksitasjon. For å minimere fototoksisitet, sett lyskilden til 50% effekt med en eksponeringstid på 50 ms. De riktige anskaffelsesparametrene kan variere og bør optimaliseres ved å anskaffe flere oppkjøp. Forsikre deg om at ingen piksler er mettede. Juster eksponeringstid og lyseffekt etter behov for å sikre at hele det dynamiske området til den fluorescerende kalsiumsensoren kan registreres.
- Hvis du bruker andre fluoroforer (f.eks. fluorescerende merkede virus), gjenta optimaliseringen på disse kanalene. Sett opp bildesløyfen og skaff deg et 488 nm bilde ved hver valgte X, Y-koordinat i en 1 min sløyfe. Se for deg denne sløyfen kontinuerlig. Når du bruker et fluorescerende merket virus, skaff deg et bilde på riktig kanal hver 10. sløyfe (dvs. 1 bilde / 10 min).
- Samle bilder i ~18 timer. Hvis du bruker virus uten fluorescerende koder, fikser du monolayers og utfører immunfluorescensfarging for å identifisere infiserte celler. Utfør dette etter å ha fullført avbildningskjøringen som beskrevet nedenfor.
- Fjern bildemedier og erstatt med 100 μL 4% formaldehyd i 1x PBS. Inkuber ved romtemperatur i 30 minutter.
- Fjern fikseringsmiddel og slukk med 100 μL 50mM NH4Cl i 10 minutter. Fjern NH4Cl. Permeabiliser monolagene med 100 μL på 0,1% Triton X-100 i 1x PBS i 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C.
- Fjern permeabiliseringsbufferen. Blokk med 100 μL 3% bovint serumalbumin i 1x PBS i 1 time.
- Fjern blokkeringsløsningen. Legg til primære antistoffer fortynnet til anbefalt/optimalisert konsentrasjon i 1x PBS. Tilsett 100 μL antistoffoppløsning per brønn.
- Inkuber natten ved 4 °C med forsiktig gynging. Fjern primære antistoffer. Vask 3x med 1x PBS.
- Legg til fluorescerende konjugerte sekundære antistoffer fortynnet til anbefalt / optimalisert konsentrasjon i 1x PBS. Tilsett 100 μL per brønn. Inkuber i 2 timer ved romtemperatur.
MERK: FPBase15 er en flott ressurs for å velge sekundære som vil unngå gjennomblødning ved multipleksing. De fleste sekundære er effektive ved en 1:1000 fortynning i 1x PBS. - Fjern sekundære antistoffer. Lag en 1 μg/ml DAPI-løsning i 1x PBS og tilsett 100 μL per brønn. Inkuber i 20 min. Fjern DAPI. Vask 3x med 1x PBS.
- Hold faste monolag i 100 μL med 1x PBS for avbildning. Plasser lysbildet tilbake på mikroskoptrinnet, last inn X- og Y-koordinatene fra live imaging-kjøringen, og avbilde hvert multipunkt på kanalen som tilsvarer det sekundære antistoffet som ble brukt til farging. Referer til bildene fra live imaging-kjøringen for å sikre at de samme punktene blir tatt.
6. Kvantifisering av intercellulære kalsiumbølger
- Forsikre deg om at Fiji er Just ImageJ (FIJI) er installert med følgende plugin-moduler: Bio-Formats (bør forhåndsinstalleres i FIJI, men vil ikke være i ImageJ); Kokebok: For å installere, fra FIJI-menyen, gå til Hjelp > oppdateringer > Administrer oppdateringssider. Sjekk kokebok. Start FIJI på nytt.
- Del datafilen fra live-bildekjøringen i flere filer, og skill hver X- og Y-koordinat. I Nikon NES Elements velger du Fil > Import/eksport > delte multipunkter. Velg en mappe for eksport og et passende prefiks.
- Åpne FIJI. Last inn en enkelt fil fra de delte multipunktene. Hvis du bruker et bilde med flere kanaler, deler du kanalene. Velg vinduet med bildene fra 488 nm-kanalen (GCaMP).
- Kjør DeltaF Up-funksjonen for å bestemme endringen i hver bildepunktverdi fra ett tidspunkt til det neste. Hvis du vil gjøre dette, velger du Kokebok > T-funksjoner > Delta F Opp.
- Bla gjennom stabelen til et bilde med en kalsiumbølge er funnet. Med kalsiumbølgen i sikte angir du en terskel ved å klikke på Bilde > Juster > terskel. Juster den nedre grensen for å minimere mengden signal som ikke er en del av bølgen som kommer forbi terskelen. For 16-biters bilder som er tatt opp ved hjelp av parametrene beskrevet ovenfor, starter du med en lavere terskel på 600 og justerer etter behov.
- Kjør partikkelanalysatoren for å segmentere bølger ved å klikke Analyser > Analyser partikler. Angi minimumsstørrelsen på bølgen i μm2 ved å justere området. Den er satt til 0-uendelig ved baseline. For bilder av MA104-celler oppnådd ved hjelp av et 20x-objektiv, start med å øke den nedre grensen til 10 000 μm2 og juster etter behov.
- Merk av i boksene for Vis resultater og Fjern resultater. Fra rullegardinmenyen "Vis" velger du Disposisjoner, og klikker deretter OK. Dette skal resultere i 2 utganger: Ett vindu, Resultater, vil liste opp hver bølge oppdaget, området av bølgen, og dens gjennomsnittlige, minimum og maksimale intensitetsverdier (basert på delta F). Det andre vinduet, med tittelen Tegning av [filnavn], vil inneholde en ny stabel med konturene av segmenterte bølger. Bruk dette til å verifisere bølgedeteksjon. Juster terskelverdier og størrelsesområde om nødvendig, og sjekk bølgeanropene på nytt.
- For gruppebehandling bruker du det medfølgende makroskriptet (tilleggsfil 1). For å utnytte dette, følg trinnene beskrevet nedenfor.
- Del flere punkter i enkeltfiler som beskrevet i trinn 6.2. Åpne FIJI. Velg Behandle > satsvis > makro. I "input" -boksen, gi kartet til mappen som inneholder de delte flerpunktsfilene. La "output" -boksen være tom.
- Lim inn skriptet fra Supplementary Coding File 1 i boksen. Juster intensitetsterskelen og størrelsesterskelen i skriptet for å gjenspeile de optimaliserte parameterne fra trinn 6.5 og 6.6.
- Klikk på Prosess. Avhengig av antall flerpunkter og behandlingshastigheten til datamaskinen, kan det ta 30 minutter eller lenger å behandle alle bildene. Når de er ferdige, blir dataene skrevet inn i en ny regnearkfil med navnet "Gi meg nytt navn etter skriving" på skrivebordet. Utdatafilen skal inneholde, for hvert multipunkt, et bølgeantall og bølgemetrikk (areal, gjennomsnittlig intensitet, minimum og maksimum intensitet og intensitetstetthet).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A viser en BMM-kuppel som inneholder 3-dimensjonale humane intestinale organoider som har blitt transdusert til stabilt uttrykke GCaMP6s. Figur 1B viser samme linje av organoid replisert som et monolag ved 24, 48 og 72 timer etter såing. For å validere funksjonen til GCaMP6s ble monolaget avbildet ved fluorescensmikroskopi hver 2 s i 4 minutter, og 100 nM ADP ble tilsatt mediet etter ~ 20 s. ADP fremkaller kalsiumfrigivelse fra endoplasmatisk retikulum, og øker cytosolisk kalsium. Fluorescensintensiteten detektert på 488 nm-kanalen ved hver eksponering er plottet i figur 1C. Sporet viser en jevn baseline fluorescensintensitet etterfulgt av en rask økning ved ADP-tillegg, og en gradvis retur mot baseline. En kjøretøykontroll er inkludert for å verifisere at responsen er en sann signalhendelse, og ikke bare en endring i fluorescensintensitet som kan oppstå ved tilsetning av media.
Scoring av et HIO-monolag øker effektiviteten av rotavirusinfeksjon. Mens teknikker for skåring varierer, er det lettest å få konsistent infeksjon ved å bruke en enkelt score langs monolagets lengde, som vist i figur 2A. Ved bruk av rekombinante stammer av rotavirus som uttrykker fluorescerende proteiner, kan infeksjon verifiseres under levende avbildning (figur 2B). Ved bruk av en stamme som ikke uttrykker en markør, kan infeksjon detekteres ved immunfluorescens etter avbildning. Gitt motiliteten til celler i HIO monolayers, er det ofte vanskelig å spore en enkelt infisert celle over tid. Bruk i stedet endepunktfarging som metode for å verifisere infeksjon og bekrefte at infeksjonsmangfoldet samsvarer mellom synsfeltene (figur 2C).
Intercellulære kalsiumbølger i HIO kan observeres kvalitativt, som vist i figur 3A. Bestemmelse av frekvensen av kalsiumbølger i et gitt synsfelt krever imidlertid kvantitativ analyse. Trinnene for vellykket segmentering, som beskrevet i trinn 6 i protokollen ovenfor, er illustrert i figur 3A. Figuren viser råbildet (figur 3Ai), bildet etter at pikselintensitetene fra forrige bilde er trukket fra (figur 3Aii), deretter den segmenterte kalsiumbølgen (figur 3Aiii).
Når kalsiumbølgene har blitt segmentert og kvantifisert for hvert synsfelt i løpet av avbildningskjøringen, er det ofte informativt å sammenligne frekvensen av bølger i monolag utsatt for forskjellige forhold. Stripdiagrammet i figur 3B viser totalt antall kalsiumbølger per synsfelt i mock og rotavirus-inokulerte monolag. Dette eksemplet inkluderer to stammer av RV: en stamme av humant rotavirus (Ito HRV) og en rekombinant stamme av simian rotavirus SA11 som uttrykker mRuby (SA11-mRuby). Den mock-infiserte kontrollen er tatt som baseline kalsiumbølgefrekvens, de ubehandlede rotavirusinfiserte monolayers tjener som positive kontroller, og de rotavirusinfiserte, behandlede monolayers er de eksperimentelle forholdene. Mock-infiserte og RV-infiserte monolayers behandlet med legemidler, inkludert ADP-reseptorhemmeren, BPTU, kan da sammenlignes med begge kontrollbetingelsene ved enveis ANOVA. Dataene antyder at BPTU effektivt reduserer frekvensen av intercellulære kalsiumbølger.
Figur 1: Validering av GCaMP6s uttrykk i jejunale humane tarmorganoider. (A) Etter lentivirustransduksjon gjennomgikk GCaMP-uttrykkende HIOer seleksjon og flere passasjer, vist her ved 7 dager siden siste passasje. Ved stimulering med 488 nm laseren er GCaMP6s uttrykk tydelig i de transduserte HIOene belagt i 15 μL kjellermembranmatrise som 3-dimensjonale sfæroider (Ai). 50 ms eksponeringer ble anskaffet ved 50% lasereffekt ved hjelp av et 20x mål, deretter sydd sammen for å visualisere hele kjellermembranmatrisekuppelen. En lignende prosess ble utført ved bruk av 4 ms brightfield exposures (Aii). I brightfield-bildet er de mørke HIO-ene i midten av kuppelen en indikasjon på at kulturene er klare for passasje. (B) HIO ble enzymatisk fordøyd til en enkeltcellesuspensjon, deretter belagt på nytt med en tetthet på 150 000 celler per brønn (5 mm i diameter) av en bildebunnplate forhåndsbelagt med kollagen IV. Ved 72 timer etter såing var monolaget sammenflytende og klart for nedstrøms applikasjoner. For å validere funksjonen til GCaMP ble bilder tatt ved hjelp av 488 nm filtersett med 50 ms eksponeringer ved 50% lasereffekt hver 2 s i 4 minutter. (C) Sporene vist her representerer fluorescensintensiteten i hele feltet normalisert til den første oppkjøpet i løpet av avbildning. Ved rundt 20 s (pil), etter den tiende eksponeringen, ble 100 nM adenosindifosfat (ADP) tilsatt for å fremkalle en spike i cytosolisk kalsium (rødt). Tilsetningen av et likt volum på 1x PBS fremkalte ikke en meningsfull respons (blå). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skåring av et HIO-monolag for å lette bobilinfeksjon. (A) Figuren illustrerer en egnet teknikk for å skåre et monolag ved hjelp av en 25G nål. (B) Et HIO monolag ble infisert med en rekombinant stamme av RV som uttrykker mRuby fluorescerende protein (magenta, pil), noe som muliggjør identifisering av infiserte celler. Alternativt, når du bruker en naturlig forekommende stamme av RV, kan infiserte celler identifiseres ved hjelp av immunfluorescens. (C) Bildene som vises er fra 4 forskjellige HIO monolayers etter fiksering, DAPI-farging (blå) og antistoffmerking av rotavirusantigen (magenta). Begge teknikkene illustrerer den foretrukne RV-infeksjonen nær den scorede delen av monolaget. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Segmentering og kvantifisering av RV-induserte intercellulære kalsiumbølger. De 488 nm eksponeringene av RV-infiserte HIOer som uttrykker GCaMP6s ble anskaffet hvert 1. minutt i 16 timer ved hjelp av protokollen. (A) Figuren illustrerer prosessen med intercellulær kalsiumbølgesegmentering. Først trekkes bildepunktverdiene fra forrige opptak (t-1) fra hvert råbilde (Ai) for å kvantifisere endringen i fluorescensintensitet (Aii). En terskel basert på en eksperimentelt optimalisert minimumsøkning i intensitet fra forrige bilde blir deretter brukt. Bildene filtreres deretter for et minimum sammenhengende signalområde for å velge for intercellulære kalsiumbølger (Aiii) og ekskludere encellede kalsiumsignaler. Denne behandlingen muliggjør kvantifisering av kalsiumbølger ved hvert synsfelt. I dette eksperimentet ble monolayers enten mock-infisert, infisert med ITO-stammen av humant rotavirus (HRV), eller infisert med en rekombinant stamme av simian rotavirus som koder for mRuby på gensegment 7, nedstrøms for ikke-strukturelt protein 3 (SA11-mRuby). Infiserte monolayers ble enten behandlet med ADP-reseptorhemmeren BPTU eller venstre ubehandlet. Monolayers ble deretter avbildet i 8 forskjellige posisjoner, og kalsiumbølger i hvert synsfelt ble kvantifisert ved hjelp av rørledningen beskrevet i denne protokollen. Punktene på stripdiagrammet indikerer antall kalsiumbølger oppdaget i hver posisjon lagt på et søylediagram som markerer gjennomsnittet og SD. Enveis ANOVA etterfulgt av Dunnetts tester viser at mens enten stamme av RV øker frekvensen av intercellulære kalsiumbølger over den for den uinfiserte gruppen, forhindrer BPTU-behandling den RV-medierte økningen i kalsiumbølgefrekvens. **p<0,01, ***p<0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Reagent | Transduksjon | Kontroll |
| Y-27632 (1 mM lager) | 4 μL | 4 μL |
| Polybren (1 mg/μL stam) | 2 μL | 2 μL |
| Lentivirus | variabel* | |
| HighWnt-WRNE * se notater | til 400 μL | til 400 μL |
Tabell 1: Lentivirustransduksjonsmedium. Forbered transduksjonsmediet og kontrollmediet ved å kombinere reagensene i volumene som er angitt i henholdsvis andre og tredje kolonne. Sikt på en mangfoldighet av infeksjon (MOI) på 10 lentivirus transduksjonsenheter per celle. For LV pakket internt, krever dette vanligvis ~ 25-50 μL konsentrert LV. Titeren til de fleste kommersielt pakkede LV vil bli utstyrt med analysesertifikatet.
Supplerende kodefil 1: ImageJ-makroskript for å tillate kalsiumbølgekvantifisering ved batchbehandling. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Endringer i cytosoliske Ca2+ nivåer kan være både en årsak og virkning av patologier i epitelet 10,16,17. Økninger i cytosolisk kalsium kan direkte drive sekresjon via aktivering av den kalsiumavhengige kloridkanalenTMEM16A 18,19. Aktivering av TMEM16A som respons på Ca2+ muliggjør apikal utstrømning av klorid, og etablerer en osmotisk gradient som fremmer væskesekresjon20,21. Videre utløser økninger i Ca2+ i enteroendokrine celler frigjøring av serotonin, noe som stimulerer afferente sensoriske nevroner som kan modulere aktivitet i det enteriske nervesystemet22. Ca2+ signaler kan også modulere tette kryss for å påvirke barrierefunksjon23,24, og regulere spredning i intestinale stamceller25. Dermed kan dysregulering av Ca2+ ha brede og vidtrekkende effekter.
Mange virus manipulerer cytosolisk Ca2+ for å skape et cellulært miljø som bidrar til replikasjon26. Rotavirus er et godt eksempel på dette i tarmepitelet27. Rotavirus ikke-strukturelt protein 4 (NSP4) er en Ca2+-ledende kanal som muliggjør utstrømning av Ca2+ fra endoplasmatisk retikulum inn i cytosol28,29. Dette stimulerer autofagi og hjelper monteringen av det ytre kapsidet 30,31,32. Rotavirusinfeksjon induserer også frigjøring av ADP, og utløser intercellulære Ca2+ bølger som bidrar til patogenese17. Andre enteriske virus, inkludert både calicivirus og enterovirus, koder for Ca2+-ledende viroporiner som utløser lignende dysregulering av Ca2+ i infiserte celler33,34.
Levende celle Ca2+ avbildning av humane intestinale organoider tilbyr en allsidig plattform for å studere virusindusert signalering i epitelet. Styrken i konklusjonene fra bildedataene avhenger imidlertid uløselig av helsen og kvaliteten på HIO-ene, passende bildeparametere og en god analytisk tilnærming.
Effektiv lentiviviral transduksjon er ofte det begrensende trinnet ved etablering av nye HIO-linjer, men høytiterlentivirus og multiple transduksjoner bidrar til å sikre tilstrekkelig transgen ekspresjon. Det er viktig at dette må balanseres med potensialet for betydelig cellulær stress ved transduksjon. Dette er oftest midlertidig og avtar etter valg og flere passasjer. Ikke desto mindre er det kritisk at HIOer konstruert for å uttrykke GECIs viser normal vekst og spredning før de begynner eksperimenter. På samme måte induserer spredning av 3-dimensjonale HIOer og reformering av dem som monolayers cellulær stress. Det er beste praksis å tillate tre eller flere dager for monolayers å tilpasse seg etter plating. Å belegge platene med kollagen IV er kritisk for monolagsintegritet35,36. Aliquoting kollagen IV og lagring ved -80 ° C mellom bruk bidrar til å sikre monolagsadherens. Bestemmelse av optimal såtetthet for hver HIO-linje kan også bidra til å forbedre konsistensen. Til slutt, inkludert de riktige kontrollene, og sammenligne dem på tvers av eksperimenter, er uunnværlig for å sikre at enhver observasjon representerer et svar på den aktuelle variabelen, snarere enn en teknisk forstyrrelse.
Mens scoring av et monolag kan forårsake uønsket celleskade, forbedrer det sterkt RV-infeksjon av 2D HIO. Figur 2 illustrerer dette, da nesten alle infiserte celler ligger rett ved siden av ripen. Eksperimentelle bevis tyder på at RV infiserer mest effektivt på den basolaterale overflaten av tarmepitelceller37. Dermed er det spådd at scoring av et monolag øker smittsomheten ved å eksponere den basolaterale overflaten. Effektiv monolagsinfeksjon kan også oppnås ved plating av HIOer på polykarbonatmembraner suspendert i brønner som inneholder kulturmedium, noe som gir tilgang til den basolaterale overflaten. Den relativt lange avstanden mellom platen og polykarbonatmembranen, selve polykarbonatmembranen og plastoverflaten ved bunnen av brønnen gjør dem imidlertid uegnet for epifluorescensavbildning. Dermed forblir scoringsmetoden beskrevet i denne protokollen den favoriserte tilnærmingen. Gitt at skåring i seg selv kan føre til signalforstyrrelser, er inkluderingen av den uinfiserte, skårede kontrollen avgjørende for tolkningen. For virus, som humant norovirus, som effektivt infiserer via den apikale membranen, er det ikke nødvendig å score monolaget38.
Som med alle levende bildesystemer, kan fototoksisitet lett forvirre eksperimenter ved hjelp av HIO monolayers. Gjennom et bildebehandlingseksperiment er det viktig å overvåke for uventet vakuolisering, membranblebbing eller andre morfologiske indikatorer på stress39. Hvis noen av disse tegnene oppdages, må varigheten, frekvensen eller eksitasjonskraften reduseres. Å øke signal-støy-forholdet kommer ofte på bekostning av langsiktig cellehelse, og derfor er empirisk optimalisering av parametere avgjørende. Fotobleking, som indikert ved en reduksjon i baseline fluorescensintensitet over tid, er en harbinger av cellestress og bør unngås.
Visualiteten av bildedata kan føre etterforskere til å favorisere kvalitative, snarere enn kvantitative, analyser. Imidlertid, som med enhver modalitet, krever reproduserbare konklusjoner kvantifisering. Kvantitativ bildeanalyse inneholder langt mer kompleksitet enn det som kan dekkes i et enkelt manuskript, men det er verdt å fremheve noen få hovedpunkter. For det første krever konsistent kvantifisering konsistent anskaffelse. En analysepipeline utviklet for et gitt sett med innsamlingsparametere er kanskje ikke effektiv for bilder tatt ved forskjellige frekvenser, eksponeringstider, laserkrefter eller bølgelengder. For det andre har infeksjonens mangfold en overdimensjonert innflytelse på frekvensen av viralt induserte kalsiumsignaler. Som sådan er det viktig å evaluere antall infiserte celler per synsfelt og sikre konsistens på tvers av behandlingsbetingelser. Alternativt kan normalisering av signalfrekvens til antall infiserte celler per synsfelt bidra til å redusere feil. Til slutt, mens den nylig utviklede mNG-baserte kalsiumindikatoren (NEMO) tilbyr en lovende tilnærming for å bestemme absolutte Ca2+ konsentrasjoner i celler40, formidler de fleste biosensorer bare relativ informasjon om biologiske systemer. Dermed er bakgrunnssubtraksjon, normalisering og sammenligning med en kontroll kritisk.
Mens denne protokollen fokuserer på kalsiumavbildning under virusinfeksjon, er den generelle tilnærmingen lett tilpasningsdyktig. Virusinfeksjon kan lett erstattes av en alternativ behandlingstilstand, og det er en stadig voksende litani av biosensorer for å overvåke mange forskjellige cellulære veier og prosesser. Med enhver protokolltilpasning må etterforskere holde analysen top-of-mind, designe eksperimenter med klare, kvantifiserbare resultater.
Samlet sett gir live imaging uovertruffen tidsmessig oppløsning, noe som forbedrer karakteriseringen av svært dynamiske prosesser. Inkorporering av organoider i levende bildeeksperimenter gjør det mulig å observere disse prosessene i en sann vev, fysiologisk relevant modell. Vi håper at protokollen beskrevet her letter eksperimentell design og optimalisering, og gir forskere mulighet til å avdekke nye aspekter av celle- og vevssignalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser å opplyse.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd R01DK115507 og R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) fra National Institutes of Health (NIH). Traineestøtte ble gitt av NIH grants F30DK131828 (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F. J. Scribano) og F32DK130288 (PI: K.A. Engevik). Vi ønsker å takke Texas Medical Center fordøyelsessykdommer Enteroid Core for å gi organoid vedlikehold media.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| [Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Gibco | 25300054 | |
| 1.5mL microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 5408137 | |
| 15mL conical tubes | Thermofisher Scientific | 0553859A | |
| 16% formaldehyde | Thermofisher Scientific | 28906 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 25 gauge needle | Thermofisher Scientific | 1482113D | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| Antibiotic-antimycocytic | Gibco | 15240062 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240062 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Bovine serum albumin | FisherScientific | BP1600100 | |
| CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments | Greiner | 543979 | |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| Fluorobrite | Gibco | A1896701 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050079 | |
| Human epidermal growth factor | ProteinTech | HZ-1326 | |
| Lentivirus | VectorBuilder | (variable) | |
| Matrigel | BD Biosceicen | 356231/CB40230C | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates | Thermofisher Scientific | 142475 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR1003G | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S70767 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151100 | |
| TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Thermofisher Scientific | 12604013 | |
| Trypsin | Worthington Biochemical | NC9811754 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
References
- Bootman, M. D., Bultynck, G. Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802 (2020).
- Clapham, D. E.
- Danese, A., et al. Cell death as a result of calcium signaling modulation: A cancer-centric prospective. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (8), 119061 (2021).
- Harr, M. W., Distelhorst, C. W. Apoptosis and autophagy: Decoding calcium signals that mediate life or death. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a005579 (2010).
- Barak, P., Parekh, A. B. Signaling through Ca2+ microdomains from store-operated CRAC channels. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (7), a035097 (2020).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Erofeev, A. I., Vinokurov, E. K., Vlasova, O. L., Bezprozvanny, I. B. GCaMP, a family of single-fluorophore genetically encoded calcium indicators. J Evol Biochem Phys. 59 (4), 1195-1214 (2023).
- Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging. Biophys J. 111 (6), 1119-1131 (2016).
- Nászai, M., Cordero, J. B. Intestinal stem cells: Got calcium. Curr Biol. 26 (3), R117-R119 (2016).
- Barrett, K. E. Calcium-mediated chloride secretion in the intestinal epithelium: Significance and regulation. Curr Top Membr. 53, 257-282 (2002).
- Xu, J., et al. Calcium-sensing receptor regulates intestinal dipeptide absorption via Ca2+ signaling and IKCa activation. Physiol Rep. 8 (1), e14337 (2020).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Lin, S. C., Haga, K., Zeng, X. L., Estes, M. K. Generation of CRISPR–Cas9-mediated genetic knockout human intestinal tissue–derived enteroid lines by lentivirus transduction and single-cell cloning. Nat Protoc. 17 (4), 1004-127 (2022).
- Crawford, S. E., Ramani, S., Blutt, S. E., Estes, M. K. Organoids to dissect gastrointestinal virus-host interactions: What have we learned. Viruses. 13 (6), 999 (2021).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nat Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
- Lai, Y., et al. Inhibition of calcium-triggered secretion by hydrocarbon-stapled peptides. Nature. 603 (7903), 949-956 (2022).
- Chang-Graham, A. L., et al. Rotavirus induces intercellular calcium waves through ADP signaling. Science. 370 (6519), eabc3621 (2020).
- Lee, B., et al. Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl− secretion induced by carbachol and cholera toxin. Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).
- Saha, T., et al. Intestinal TMEM16A control luminal chloride secretion in a NHERF1 dependent manner. Biochem Biophys Rep. 25, 100912 (2021).
- Mroz, M. S., Keely, S. J. Epidermal growth factor chronically upregulates Ca2+-dependent Cl− conductance and TMEM16A expression in intestinal epithelial cells. J Physiol. 590 (8), 1907-1920 (2012).
- Sui, J., et al. Dual role of Ca2+-activated Cl− channel transmembrane member 16A in lipopolysaccharide-induced intestinal epithelial barrier dysfunction in vitro. Cell Death Dis. 11 (5), 404 (2020).
- Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198.e16 (2017).
- Paradis, T., Bègue, H., Basmaciyan, L., Dalle, F., Bon, F. Tight junctions as a key for pathogens invasion in intestinal epithelial cells. Int J Mol Sci. 22 (5), 2506 (2021).
- Samak, G., et al. Calcium/Ask1/MKK7/JNK2/c-Src signalling cascade mediates disruption of intestinal epithelial tight junctions by dextran sulfate sodium. Biochem J. 465 (3), 503-515 (2015).
- Deng, H., Gerencser, A. A., Jasper, H. Signal integration by Ca2+ regulates intestinal stem cell activity. Nature. 528 (7581), 212-217 (2015).
- Saurav, S., Tanwar, J., Ahuja, K., Motiani, R. K. Dysregulation of host cell calcium signaling during viral infections: Emerging paradigm with high clinical relevance. Mol Aspects Med. 81, 101004 (2021).
- Chang-Graham, A. L., et al. Rotavirus calcium dysregulation manifests as dynamic calcium signaling in the cytoplasm and endoplasmic reticulum. Sci Rep. 9 (1), 10822 (2019).
- Hyser, J. M., Collinson-Pautz, M. R., Utama, B., Estes, M. K. Rotavirus disrupts calcium homeostasis by NSP4 viroporin activity. mBio. 1 (5), e00265-e00310 (2010).
- Pham, T., Perry, J. L., Dosey, T. L., Delcour, A. H., Hyser, J. M. The Rotavirus NSP4 viroporin domain is a calcium-conducting ion channel. Sci Rep. 7, 43487 (2017).
- Crawford, S. E., Hyser, J. M., Utama, B., Estes, M. K. Autophagy hijacked through viroporin-activated calcium/calmodulin-dependent kinase kinase-β signaling is required for rotavirus replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), E3405-E3413 (2012).
- Crawford, S. E., Criglar, J. M., Liu, Z., Broughman, J. R., Estes, M. K. COPII vesicle transport is required for Rotavirus NSP4 interaction with the autophagy protein LC3 II and trafficking to viroplasms. J Virol. 94 (1), e01341 (2019).
- Pando, V., Iša, P., Arias, C. F., Ló Pez, S. Influence of calcium on the early steps of Rotavirus infection. Virology. 295 (1), 190-200 (2002).
- Hyser, J. M., Estes, M. K.
- Strtak, A. C., et al. Recovirus NS1-2 has viroporin activity that induces aberrant cellular calcium signaling to facilitate virus replication. mSphere. 4 (5), e00506-e00519 (2019).
- In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. J Vis Exp. (146), 59357 (2019).
- Hirota, A., AlMusawi, S., Nateri, A. S., Ordóñez-Morán, P., Imajo, M. Biomaterials for intestinal organoid technology and personalized disease modeling. Acta Biomater. 132, 272-287 (2021).
- Cevallos Porta, D., López, S., Arias, C. F., Isa, P. Polarized rotavirus entry and release from differentiated small intestinal cells. Virology. 499, 65-71 (2016).
- Mirabelli, C., et al. Human Norovirus efficiently replicates in differentiated 3D-human intestinal enteroids. J Virol. 96 (22), e0085522 (2022).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. Bioessays. 39 (8), 28749075 (2017).
- Li, J., et al. Engineering of NEMO as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity. Nat Methods. 20 (6), 918-924 (2023).
