Summary
Ein einfaches Verfahren zur Aufzucht axenischer Delia antiqua mit halbfermentiertem sterilem Futter wird beschrieben. Mittels PCR wurde nur ein Wolbachia-Stamm in jedem Instar von axenic D. antiqua nachgewiesen.
Abstract
Axenische Insekten werden aus sterilen künstlichen Aufzuchtsystemen mit sterilen Medien gewonnen. Diese Insekten, die sich durch ihre geringe Größe, ihren kurzen Wachstumszyklus und ihren geringen Futterbedarf auszeichnen, sind ideal, um die Beziehung zwischen Mikroorganismen und Wirten zu untersuchen. Die Darmmikrobiota beeinflusst maßgeblich die physiologischen Eigenschaften von Insektenwirten, und die Einführung spezifischer Stämme in axenische Insekten bietet eine Methode zur Überprüfung der mikrobiellen Funktionen des Darms. Delia antiqua, ein bedrohlicher Schädling aus der Ordnung der Diptera, der Familie Anthomyiidae und der Gattung Delia, ernährt sich hauptsächlich von Zwiebeln, Knoblauch, Lauch und anderen Gemüsesorten aus der Familie der Liliaceae. Seine Larven ernähren sich von den Zwiebeln, was zu Fäulnis, Welken und sogar zum Absterben ganzer Pflanzen führt. Durch die Aufzucht axenischer Larven können Folgestudien durchgeführt werden, um die Auswirkungen der Darmflora auf das Wachstum und die Entwicklung von D. antiqua zu beobachten. Im Gegensatz zu der Methode, bei der assoziierte Mikroben durch Antibiotika eliminiert werden, wird in diesem Artikel ein kostengünstiger und hocheffizienter Ansatz zur Aufzucht von axenischen D. antiqua vorgestellt. Nach der Oberflächensterilisation von D. antiqua-Eiern wurde halbfermentiertes, steriles Futter verwendet, um Larven aufzuziehen, und der axenische Zustand von D. antiqua wurde durch kulturabhängige und kulturunabhängige Assays verifiziert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kombination aus Sterilisation von Insekteneiern und der Herstellung steriler Diäten für die Larvenzucht die Entwicklung einer effizienten und einfachen Methode zur Gewinnung von axenhaltigem D. antiqua ermöglicht hat. Diese Methode bietet einen leistungsstarken Ansatz zur Untersuchung von Insekten-Mikroflora-Interaktionen.
Introduction
Axenische Tiere, definiert als Tiere, bei denen keine lebensfähigen Mikroorganismen oder Parasiten nachgewiesen werden können, sind wertvolle experimentelle Modelle für die Untersuchung von Wirt-Mikroorganismen-Interaktionen 1,2. Insekten, die größte Gruppe der Wirbellosen, können symbiotische Beziehungen mit Mikroorganismen eingehen3. Axenische Insekten können verwendet werden, um Wirt-Symbionten-Interaktionen in symbiotischen Systemen zu untersuchen4. Zum Beispiel etablierten Nishide et al.5 ein praktisches steriles Aufzuchtverfahren für den übelriechenden Wurm Plautia stali, das eine zuverlässige und rigorose Analyse von Wirt-Symbionten-Interaktionen in symbiotischen Modellsystemen ermöglicht. Axenische Insekten können durch Sterilisation des Eistadiums und sterile Nahrung für die Larven und erwachsenen Tiere erzeugt werden 6,7. Axenische Insekten sind von großer Bedeutung und werden in der biologischen Forschung häufig eingesetzt. Zum Beispiel zeigte eine von Somerville et al.8 durchgeführte Studie, dass Diamantmotten, die mit Enterobacter cloacae geimpft wurden, die Anpassungsfähigkeit transgener Männchen verbesserten.
Delia antiqua Meigen ist weltweit ein wirtschaftlich bedeutender Schädling von Zwiebeln und anderen Liliengewächsen, wobei seine Larven die Zwiebeln von Zwiebeln und anderen Liliaceae-Kulturen schädigen9. D. antiqua kommt hauptsächlich in gemäßigten Klimazonen vor und ist in Zwiebelanbaugebieten Amerikas, Europas und Asiens weit verbreitet. Wenn es nicht richtig bekämpft wird, kann es zu Ernteverlusten bei Zwiebeln (Allium cepa L.), Knoblauch (Allium sativum L.), Schalotten (Allium fistulosum L.) und Lauch (Alliumchoenoprasum L.) von 50 % bis 100 % führen10,11. Die Larven ernähren sich von den unterirdischen Teilen der Pflanzen, und diese Fütterung führt dazu, dass die Sämlinge welken und schließlich sterben. Darüber hinaus können beschädigte Pflanzen das Eindringen von Krankheitserregern ermöglichen, was zur Fäulnis der Knollen führt12. Selbst wenn die Pflanzen nicht vollständig von den Larven verzehrt werden, machen die von ihnen verursachten Schäden die Zwiebelpflanzen unverkäuflich und führen zu wirtschaftlichen Verlusten.
Insekten sind eng mit der Darmmikrobiota verbunden, und die meisten Insektendärme enthalten eine Vielzahl symbiotischer Bakterien, die von den vom Wirt bereitgestellten Nährstoffen gedeihen13,14. Jing et al.15 zeigten, dass die primäre Funktion der symbiotischen Gemeinschaft im Darm darin besteht, essentielle Nährstoffe bereitzustellen, gefolgt von Funktionen, die mit der Verdauung und Entgiftung zusammenhängen. In bestimmten Fällen können Darmbakterien als mikrobielle Ressource für die Schädlingsbekämpfung dienen. Daher ist es wünschenswert, die Leistungen und spezifischen Funktionen der einzelnen Darmbakterien im Körper von D. antiqua zu untersuchen. Daher ist die Präparation axenischer Larven besonders wichtig, um die Wechselwirkungen zwischen bestimmten Bakterienstämmen und Insekten zu untersuchen16. Derzeit ist eine häufig verwendete Methode zur Eliminierung von Darminsekten die Verwendung einer Antibiotikakombination zur Ausrottung assoziierter Mikroben 17,18,19. Im Gegensatz zur alleinigen Verwendung von Antibiotika, die nur die Anzahl der Keime reduzieren können, ermöglicht die axenische Aufzucht von Insekten die Kontrolle über die Zusammensetzung und Menge der Mikroorganismen, was eine genauere Validierung der Funktionalität der Darmmikrobiota ermöglicht.
Daher wird in diesem Artikel ein Protokoll für die Vorbereitung und Aufzucht von axenischer D. antiqua vorgestellt. Axenic Larvenfutter wird durch Hochtemperatursterilisation von natürlichem Futter in Kombination mit halbfermentierten Lebensmitteln gewonnen. Die Eizellen werden nach einem experimentellen Protokoll sterilisiert, um axenische Eier zu erhalten, und schließlich werden axenische Larven aus den axenischen Eiern kultiviert. Das axenische Aufzuchtsystem wurde für das Experiment nur eine Generation lang durchgeführt. Dies wird die Untersuchung der Interaktion zwischen Insekten und Darmmikrobiota erleichtern.
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Protocol
D. antiqua werden aus dem Feld von Fanzhen, Taian, gewonnen.
1. Zubereitung von sterilen Diäten
- Die äußeren Schichten der Frühlingszwiebeln abziehen und die grünen Blätter wegwerfen. Bewahren Sie den weißen Teil der Frühlingszwiebeln auf (Abbildung 1A) und waschen Sie ihn mit sterilem Wasser, wobei der Spülvorgang dreimal wiederholt wird. Den weißen Teil der Frühlingszwiebeln mit einer Schere (siehe Materialtabelle) in 1-2 cm große, gewürfelte Stücke schneiden, die mit 75 %iger EtOH-Lösung (siehe Schritt 2.5) sterilisiert wurden, um sie später zu verwenden.
- 50 g der gewürfelten Frühlingszwiebeln abwiegen und in eine Küchenmaschine geben (siehe Materialtabelle). Fügen Sie 50 ml sterilisiertes Wasser hinzu und mahlen Sie sie fünfmal für jeweils 2 Minuten. Alle gewürfelten Frühlingszwiebeln sollten zu einer pastösen Konsistenz gemahlen werden (Abbildung 2A).
- Verwenden Sie eine Pinzette, um 10 Stück 3. Larven von D. antiqua in ein 10-ml-Zentrifugenröhrchen mit 10 ml 1x PBS zu geben und sie mit einem Einweg-Mahlstößel (siehe Materialtabelle) etwa 5 Minuten lang zu zerkleinern, um eine Larvenmahlflüssigkeit zu erhalten.
- Gießen Sie die pastöse Frühlingszwiebelflüssigkeit und die Larvenmahlflüssigkeit in einen sauberen 500-ml-Kolben (siehe Materialtabelle). Die konische Kolbenmündung wird mit zwei Lagen transparenter Siegelfolie umwickelt und dann in einen Schüttelinkubator (siehe Werkstofftabelle) gestellt, wo die Gärung bei 25 °C und 180 U/min 12 h lang erfolgt (Abbildung 2B).
- Schneiden Sie mit einer Schere sieben Lagen quadratische Gaze mit 10 cm Seitenlänge (keine Sterilität erforderlich) aus und stapeln Sie sie zu einem einfachen Filtergerät zusammen. Gießen Sie die fermentierte Frühlingszwiebelflüssigkeit langsam auf die Gaze und drücken Sie die gefilterte Flüssigkeit in einen neuen 500-ml-Konuskolben aus. Die restlichen Frühlingszwiebelreste zur späteren Verwendung in Alufolie auf der Gaze einwickeln.
- Das im vorherigen Schritt gewonnene Filtrat wird mit einer Vakuumpumpe (siehe Materialtabelle) und einem Buchner-Trichter filtriert. Geben Sie das mit deionisiertem Wasser benetzte Filterpapier auf den Büchner-Trichter, gießen Sie dann das Filtrat und führen Sie eine Saugfiltration dreimal mit unterschiedlichem Filterpapier durch. Das endgültige Filtrat wird im 500-ml-Konuskolben aufgefangen.
- Führen Sie eine weitere Filtration mit einer 0,22 μM-Filterflasche und einer Vakuumpumpe durch. Schrauben Sie den Deckel des Saugfilterkolbens zur weiteren Verwendung in eine ultrareine Bank (siehe Materialtabelle). Zu diesem Zeitpunkt erhält man den fermentierten Frühlingszwiebelrückstand und das Filtrat (Abbildung 2C).
HINWEIS: Die aus diesem Schritt gewonnene gefilterte Flüssigkeit ist steril. (0,22 μM Filterflasche ist ein steriles Vakuumfiltrationssystem zur Sterilisation des Filtrats). - Wiederholen Sie die vorherigen Schritte, um unfermentierte Frühlingszwiebelreste und Filtrat zu erhalten. Hier besteht der Unterschied darin, dass die Fermentation nicht benötigt wird.
- 0,24 g Cholinchlorid und 0,56 g L-Ascorbinsäure (siehe Materialtabelle) werden in ein 10-ml-Zentrifugenröhrchen eingewogen. Fügen Sie 3 ml deionisiertes Wasser hinzu und schütteln Sie es kräftig, bis sie sich vollständig aufgelöst haben. Verwenden Sie in der ultrareinen Bank eine neue 5-ml-Spritze und setzen Sie drei 0,22-μM-Spritzenvorsatzfilter (siehe Materialtabelle) auf, um die Lösung zu sterilisieren, und geben Sie sie zur späteren Verwendung in ein steriles 10-ml-Zentrifugenröhrchen.
HINWEIS: Cholinchlorid ist ein essentieller Neurotransmitter für das Wachstum von Insekten, während L-Ascorbinsäure als Konservierungsmittel wirkt. - 2 g Agar-Agar-Pulver und 6 g TSB (siehe Materialtabelle) abwiegen und in einen 500-ml-Konuskolben füllen. Fügen Sie dann 100 ml deionisiertes Wasser hinzu, um das Nährmedium herzustellen. Nachdem Sie den Glasstab mit deionisiertem Wasser gespült haben, rühren Sie damit die Mischung um, bis sie gut vermischt ist. Anschließend wird der Konuskolben mit zwei Schichten transparenter Siegelfolie verschlossen.
- Die fermentierten Frühlingszwiebeln und unfermentierten Frühlingszwiebeln (siehe Schritt 1.5 und 1.8) werden in Aluminiumfolie eingewickelt und zusammen mit dem Nährmedium in einem Autoklaven bei 121 °C für 20 min sterilisiert.
- Gießen Sie in der ultrareinen Bank das sterilisierte Cholinchlorid, die L-Ascorbinsäure und das sterile Filtrat in das Nährmedium und schwenken Sie es vorsichtig, um sie gründlich zu mischen. Zum Schluss die fermentierten und unfermentierten Frühlingszwiebeln hinzufügen und kräftig mit der Hand schütteln, um die sterilen Diäten zu erhalten. Gießen Sie die Diäten schräg in die 50-ml-Zentrifugenröhrchen (steril; Entlüftungskappe mit einer hydrophoben 0,22 μM PVDF-Membran) (siehe Materialtabelle) (Abbildung 2D).
HINWEIS: Nach der Sterilisation sollte die Temperatur des Nährmediums zwischen 65 und 80 °C gehalten werden, um ein schnelles Abkühlen und Erstarren bei der Zugabe von Frühlingszwiebeln oder anderen Zutaten zu verhindern. Gießen Sie außerdem in jedes Röhrchen etwa 10-15 ml Diäten. Sobald sich die Diäten verfestigt haben, lagern Sie die Röhrchen im Kühlschrank bei 4 °C, wenn sie nicht sofort verwendet werden.
2. Erwerb von axenischen Eizellen
- Laboraufzuchtsystem für D. antiqua
- Stellen Sie einen Aufzuchtkäfig in einen 25 °C warmen, intern LED-beleuchteten Inkubator (24 Stunden pro Zyklus, das Verhältnis von hell zu dunkel beträgt 16:8), um männliche und weibliche erwachsene Tiere aufzuziehen, damit sie sich paaren und Eier legen können. Füllen Sie den Wasserspender (Abbildung 1B) mit Wasser und verschließen Sie ihn mit angefeuchteter Watte, um Wasser für die Erwachsenen bereitzustellen.
- Setzen Sie vier 35 mm x 12 mm große Petrischalenböden in einen 94 mm x 16 mm großen Petrischalendeckel. Befeuchten Sie Watte mit ionisiertem Wasser und legen Sie dann feuchte Watte auf zwei der Petrischalenböden und geben Sie einen Esslöffel Saccharose auf die Watte.
- Füllen Sie die beiden anderen Petrischalenböden mit zwei Esslöffeln Saccharose und Hefeextrakt (siehe Materialtabelle), die den erwachsenen Insekten als Nahrung dienen (Abbildung 1C).
HINWEIS: Die in Schritt 2.1.2 und 2.1.3 genannten Saccharose- und Hefeextrakte müssen nicht sterilisiert werden. - Legen Sie einen 94 mm x 16 mm großen Petrischale-Boden mit angefeuchtetem Sand und einem Stück unwurzelnder, geschälter Knoblauchzehe (Abbildung 1D) in den Fliegenkäfig, um die Eier zu sammeln. Das Weibchen wird vom Geruch des Knoblauchs angezogen und legt Eier um ihn herum.
- Entnahme von Eiern
- Nehmen Sie das Eiablagegerät, eine 94 mm x 16 mm große Petrischale mit Sand und Knoblauch (Schritt 2.14), aus dem Käfig. Gießen Sie den Sand zusammen mit dem Knoblauch in einen 500-ml-Becher und spülen Sie die restlichen Eier mit Leitungswasser aus dem Knoblauch in den Becher. Zu diesem Zeitpunkt schwimmen die Eier im Wasser.
- Nehmen Sie ein Sieb mit 100 Maschen (siehe Materialtabelle) und befeuchten Sie es mit Leitungswasser. Dann das Wasser mit den schwimmenden Eiern aus dem Becherglas auf das Sieb gießen. Die Eier bleiben auf dem Sieb.
- Nachdem die Eier auf dem Sieb auf natürliche Weise getrocknet sind, die Eier mit einer Bürste vorsichtig auf eine Petrischale kehren.
- Spülen Sie am ersten Tag das Eiablagegerät, um die Eizellen ohne Desinfektion oder Sterilisation zu sammeln. Am zweiten Tag um vier Uhr nachmittags spülen Sie die Eier erneut aus und sammeln Sie sie ein, indem Sie sie mit klarem Wasser sieben.
HINWEIS: Das Sammeln der Eizellen am zweiten Tag dient dazu, eine gleichmäßige Wachstumsrate in den folgenden Phasen zu gewährleisten. Vier Uhr nachmittags ist der Höhepunkt der Eiablage für D. antiqua. Daher ist es ideal, die Eier zu diesem Zeitpunkt zu sammeln. - Geben Sie die gesammelten Eier auf ein steriles Zellsieb (siehe Materialtabelle) in der Reinstbank (Abbildung 3A).
- Bereiten Sie die Lösung für die Eizellsterilisation vor
- Nehmen Sie 5 ml 5,2 % NaClO (siehe Materialtabelle) und überführen Sie es in einen sterilisierten 250-ml-Konuskolben. Fügen Sie 95 ml sterilisiertes Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 100 ml zu erhalten, was zu einer 0,26%igen NaClO-Lösung führt.
- Zur Herstellung einer 75%igen EtOH-Lösung werden 75 ml 99,7 %ige EtOH entnommen und in einen sterilisierten 250-ml-Konuskolben überführt. Fügen Sie 25 ml sterilisiertes Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 100 ml zu erhalten, was zu einer 75%igen EtOH-Lösung führt.
- Gießen Sie 30 ml NaClO in eine Petrischale und gießen Sie 30 ml EtOH in eine andere Petrischale. Das in Schritt 2.4 erwähnte Zellsieb mit den Eiern in die NaClO-Schüssel geben. Weichen Sie es 0,5 Minuten lang in der 0,26%igen NaClO-Lösung ein. Anschließend wird das Sieb in die EtOH-haltige Schale gegeben und weitere 0,5 min in der 75%igen EtOH-Lösung eingeweicht.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal und wechseln Sie alle 0,5 Minuten zwischen 0,26 % NaClO und 75 % EtOH ab. Danach werden axenische Eizellen gewonnen. Zu diesem Zeitpunkt sollte das Sieb mit den Eiern in EtOH getaucht werden.
HINWEIS: Um eine gründliche Sterilisation zu gewährleisten, verwenden Sie eine 1-ml-Pipette, um NaClO und EtOH abzusaugen und die Eier zu dispergieren. Wiederholen Sie den Spülvorgang mehrmals. Dieser Schritt reinigt die Oberfläche der Eier weiter von Restbakterien und Verunreinigungen und sorgt für eine saubere und sterile Oberfläche.
3. Aufzucht axenischer Larven
- Um die sterilisierten Eizellen zu übertragen, verwenden Sie eine Schere, die mit einer Alkohollampe sterilisiert wurde, um die Endspitze einer 1-ml-Pipette abzuschneiden (Abbildung 3B). Achten Sie darauf, dass die Endöffnung der geschnittenen Pipette größer als der Durchmesser der Eier ist (ca. 2 mm). Verwenden Sie dann die Pipette, um die Eier aus der EtOH-Lösung (Eier zusammen mit der Lösung) (Abbildung 3C) in ein Zentrifugenröhrchen mit den sterilen Diäten zu übertragen, und jedes Röhrchen sollte etwa 20-50 Eier enthalten (Abbildung 3D). Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Eizellen übertragen wurden.
HINWEIS: Der Durchmesser der Pipettenspitze sollte so groß wie möglich sein, um zu vermeiden, dass die Eier während des Transfers zerbrechen, was zu ihrem Tod führen könnte. - Verwenden Sie eine Pipette, um überschüssiges Ethanol aus dem Röhrchen zu entfernen. Legen Sie das Zentrifugenröhrchen mit Deckeln verschlossen in einen selbstverschließenden Beutel und legen Sie ein Stück Watte an die Öffnung des Beutels, um eine Luftzirkulation zu ermöglichen. Zum Schluss wird der Beutel zur Beobachtung und Kultivierung in einen 25 °C warmen Inkubator (relative Luftfeuchtigkeit: 50%-70%; Photoperiode: 16 h Licht: 8 h dunkel) gelegt.
- Etwa drei Tage später schlüpfen die axenischen Eier in der Nahrung (Abbildung 4A). Die geschlüpften Larven werden aktiv sein und die Oberfläche der sterilen Nahrung wird nicht mehr glatt sein. Die Larven fangen an, sich von der Nahrung zu ernähren.
- Beobachte die Larven weiter, bis sie das Stadium der 2. Larve erreicht haben. Beobachten Sie ihr Wachstum und ihre Entwicklung während dieser Zeit.
- Nach 9-12 Tagen haben sich mehr als 80 % der Eier zu 3. Larven entwickelt (Abbildung 4B). Dies deutet auf ein erfolgreiches Wachstum und eine erfolgreiche Entwicklung der Larven hin.
4. Validierung axenischer Larven mit kulturabhängigen Assays
- Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip drei axenische 3. Instar-Larven aus dem Zentrifugenröhrchen aus.
- Legen Sie die Larven zur Reinigung in eine 94 mm x 16 mm große Petrischale mit 75%igem Alkohol. Danach geben Sie sie zum weiteren Spülen in einen Behälter mit sterilem Wasser.
- Verwenden Sie eine desinfizierte Präparierzange, die mit 75%iger EtOH-Lösung sterilisiert wurde, um die Larven zu fassen (Kopf und Schwanz sind in Abbildung 5A dargestellt). Verwenden Sie eine Präparierschere, um die Kopf- und Schwanzenden zu entfernen (Abbildung 5B). Halten Sie den Schwanz der Larven mit der Pinzette fest und drücken Sie ihn mit einer anderen Pinzette vorsichtig vom Schwanz zum Kopf und entnehmen Sie die inneren Organe (das Ergebnis ist in Abbildung 5C dargestellt). Legen Sie die inneren Organe in deionisiertes Wasser und ziehen Sie den Darm vorsichtig ab, indem Sie mit einer Zange auf das Fettgewebe drücken, und legen Sie das extrahierte innere (Abbildung 5D) zur weiteren Verwendung in steriles Wasser.
- Legen Sie den Darm in ein steriles 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen, fügen Sie 500 μl sterilisierten 1x PBS-Puffer hinzu und zerkleinern Sie das Darmgewebe mit einem Einwegstößel zu einem Homogenat.
- Nehmen Sie 100 μl des Homogenats und geben Sie es in ein Nähragar-Medium. Verwenden Sie einen L-förmigen Spreizer (siehe Materialtabelle), um die Agarplatte zu streifen.
- Stellen Sie die Petrischale bei 28 °C in einen biochemischen Inkubator und inkubieren Sie sie 72 Stunden lang, um das Wachstum der Kolonien zu beobachten.
5. Validierung axenischer Larven mit kulturunabhängigen Assays
- Extrahieren Sie die Gesamt-DNA aus dem Darmgewebe axenischer Larven mit einem DNA-Extraktionskit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Messen Sie die DNA-Konzentration mit einem UV-Spektralphotometer.
- Durchführung der PCR-Reaktion mit universellen bakteriellen 16S rRNA-Primern (1492R: 5'- GGTTACCTTGTTACGACTT -3', 27F: 5'- AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3'). Das gesamte Reaktionsvolumen beträgt 25 μl und besteht aus 1 μl DNA-Template, 0,5 μl Vorwärtsprimer, 0,5 μl Reverse-Primer, 10,5 μlddH2Ound 12,5 μl 2x Taq PCR Master Mix (siehe Materialtabelle). Stellen Sie die PCR-Reaktionsbedingungen wie folgt ein: anfängliche Denaturierung bei 94 °C für 3 min; 35 Denaturierungszyklen bei 94 °C für 30 s, Glühen bei 55 °C für 30 s und Verlängerung bei 72 °C für 90 s; Enddehnung bei 72 °C für 10 min. Lagern Sie die PCR-Produkte zur weiteren Analyse bei 4 °C.
- Durchführung der PCR-Reaktion mit universellen Pilz-ITS-Primern (ITS1: 5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3', ITS4: 5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3'). Das gesamte Reaktionsvolumen beträgt 25 μl und besteht aus 1 μl DNA-Template, 0,5 μl Forward-Primer, 0,5 μl Reverse-Primer, 10,5 μlddH2Ound 12,5 μl 2x Taq-PCR-Mastermix. Stellen Sie die PCR-Bedingungen für 5 Minuten auf 95 °C ein; 35 Zyklen mit 95 °C für 30 s, 55 °C für 1 Minute und 72 °C für 90 s; anschließend 72 °C für 10 min. Lagern Sie die PCR-Produkte zur weiteren Analyse bei 4 °C.
- Verwenden Sie den Nukleinsäurefarbstoff Super Green (siehe Materialtabelle), um sich gleichmäßig mit jeder der beiden Arten von PCR-Produkten zu mischen, und analysieren Sie sie durch Elektrophorese auf einem 1%igen Agarose-Gel in 1x TAE-Puffer (verdünnt von 50x TAE, siehe Materialtabelle). Verwenden Sie 3 μl DNA-Marker (siehe Materialtabelle) als Referenz.
- Verwenden Sie einen UV-Transilluminator, um das Gel zu beobachten und das Zielfragment zu lokalisieren.
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Representative Results
Die Lebensstadien von D. antiqua sind in Abbildung 4 dargestellt. Der gesamte Lebenszyklus umfasst Eier, Larven, Puppen (Abbildung 4C) und erwachsene Tiere (Abbildung 4D). Sie werden in sterilen Zentrifugenröhrchen gezüchtet, und ihr Aussehen und ihre Überlebensrate unterscheiden sich nicht von denen von D. antiqua , die unter nicht-axenischen Bedingungen aufgezogen wurden. Die Wachstums- und Entwicklungszeiten für jedes Stadium von D. antiqua sind in Abbildung 6 dargestellt. Das Eistadium von nicht axenisch aufgezogenem D. antiqua beträgt 2,83 ± 0,29 Tagen und das von axenisch aufgezogenem D. antiqua 2,83 ± 0,29 Tagen, ohne signifikanten Unterschied zwischen den beiden (unabhängiger t-Test, t = 0,00, p = 1,00). Das normale Larvenstadium dauert 13,83 ± 0,76 Tage, während das axenische Larvenstadium 14,50 ± 0,50 Tage dauert, ohne dass es einen signifikanten Unterschied zwischen den beiden gibt (unabhängiger t-Test, t = 1,27, p = 0,27). Das Puppenstadium von normal aufgezogenem D. antiqua beträgt 17,33 ± 0,76 Tage und das von axenisch aufgezogenem D. antiqua 18,00 ± 0,50 Tage, ohne signifikanten Unterschied zwischen den beiden (unabhängiger t-Test, t = 1,27, p = 0,27). Die Überlebenszeit der adulten Tiere beträgt 81,50 ± 1,00 Tage für die normale Aufzucht und 80,33 ± 0,76 Tage für die axenische Aufzucht, wobei es keinen signifikanten Unterschied zwischen den beiden gibt (unabhängiger t-Test, t = 1,61, p = 0,18). Es kann beobachtet werden, dass es keinen signifikanten Unterschied in der Entwicklungszeit zwischen axenischen D. antiqua und solchen, die unter normalen Bedingungen aufgezogen wurden, gibt.
Kulturabhängige Assays zeigten, dass keine Kolonien im Larvendarm nachgewiesen wurden (Abbildung 7). Darüber hinaus ergab eine PCR-Analyse auf der Grundlage bakterieller 16S-rRNA das Vorhandensein einer Bande bei etwa 1500 bp (Abbildung 8A), die als Wolbachia (Die GenBank-Zugangsnummer für diese Nukleotidsequenz ist: OR564190), ein endosymbiontisches Bakterium, identifiziert wurde. In der PCR-Analyse wurden jedoch keine Banden beobachtet, die auf pilzliche ITS-Regionen abzielten (Abbildung 8B). Dies deutet darauf hin, dass die Larven den axenischen Zustand erreicht haben. Axenische Larven sind von großer Bedeutung für die Untersuchung der Mechanismen der Interaktion zwischen D. antiqua und Mikroorganismen sowie für die Vorbeugung und Kontrolle der durch D. antiqua verursachten Schäden.
Abbildung 1: Die Aufzuchtgeräte und das Futter für D. antiqua. (A) Der weiße Teil der Frühlingszwiebel für Larven. (B) Wasserspender für Erwachsene. (C) Lebensmittel für Erwachsene. (D) Auffangvorrichtung für die Eier. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bestandteile der Nahrungszubereitung. (A) Gemahlene Frühlingszwiebeln. (B) Fermentierte Frühlingszwiebeln. (C) Fermentierte Frühlingszwiebelrückstände und Filtrat. (D) Zubereitete Diäten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Der Prozess des Eizelltransfers. (A) Eier im Zellsieb. (B) 1 ml Pipette ohne Endspitze. (C) 1 ml Pipette mit Eiern. (D) Eier, die in die Ernährung überführt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Lebensstadien von axenic D. antiqua. (A) Eier. b) Larven. (C) Puppe. (D) Weibliche und männliche Erwachsene. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Der Prozess des Sezierens von Larvendärmen. (A) Kopf und Schwanz der Larve. (B) Die Larve mit entferntem Kopf und Schwanz. (C) Getrennte Darm- und Körpergewebe. (D) Ein intakter Darm nach der Sektion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Entwicklungszeit der einzelnen Wachstumsstadien von normal aufgezogenen und axenisch aufgezogenen D. antiqua. Kein signifikanter Unterschied in der Entwicklungszeit zwischen axenisch aufgezogener und normal aufgezogener D. antiqua. Unabhängiger t-Test, p < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Bestätigung der Sterilität von D. antiqua durch zufällige Auswahl von drei Larven und Inkubation von Darmhomogenaten auf TSA- und PDA-Agarplatten. Bei Larven, die mit steriler Nahrung gefüttert wurden, wurden keine Bakterien beobachtet. (A) Axenische Larven auf TSA. (B) Normale Larven auf TSA. (C) Axenische Larven auf PDA. (D) Normale Larven auf PDA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Bestätigung der Sterilität von D. antiqua durch PCR-Analyse unter Verwendung von universellen 16S rRNA-Primern und pilzlichen ITS-Primern. Die Zielbande des 16S-rRNA-Gens liegt bei ~1.500 bp. Eine Bande von ca. 1500 bp wurde beobachtet und als das endosymbiontische Bakterium Wolbachia identifiziert. Die Zielbande des ITS-Gens liegt bei 500-750 bp. In den AF-Gruppen wurde keine Zielbande beobachtet. (A) 16S rRNA-Elektropherogramm. (B) ITS-Elektropherogramm. Abkürzungen: M = Markierung; NC = Negativkontrolle; NF = normale Fütterung; AF = axenische Fütterung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Insekten besitzen eine hochkomplexe Darmmikrobiota20,21, was den Einsatz von axenischen Insekten erforderlich macht, die mit spezifischen Darmmikrobiellen Stämmen geimpft wurden, um die Interaktionen zwischen Insekten und Mikroorganismen zu untersuchen. Die Präparation von axenischen Insekten ist für solche Forschungsvorhaben von entscheidender Bedeutung. Die antibiotische Behandlung ist eine Methode zur Beseitigung der Darmmikrobiota. Zum Beispiel fütterten Jung und Kim22 Spodoptera exigua mit Penicillin, während Raymond23 P. xylostella mit einer künstlichen Diät fütterte, die Rifampicin enthielt, um die Darmbakterien zu beseitigen. Eine antibiotische Behandlung kann Darmbakterien jedoch nicht vollständig eliminieren und hat viele Nebenwirkungen auf Wirtsinsekten. Dazu gehören Veränderungen der metabolischen Enzymaktivität, beeinträchtigte Darmfunktion, Hemmung von Wachstum, Entwicklung und Fortpflanzung sowie erhöhte Sterblichkeitsraten 23,24,25. Folglich kann die Funktionalität der Darmmikrobiota von Insekten nach einer Antibiotikabehandlung maskiert sein. Glücklicherweise kann dieses Problem durch eine chemische Desinfektion der Oberfläche der Eier überwunden werden, was die Produktion von axenischen Insekten mit relativer Leichtigkeit ermöglicht16. Im Vergleich dazu ist die Kombination aus Flächendesinfektion der Eier und anschließender Fütterung mit sterilem Futter wirksamer und praktikabler als eine antibiotische Behandlung26,27.
Die Gewinnung von Axenic D. antiqua beruht in erster Linie auf der Verwendung von axenischen Eiern und steriler Ernährung. Im Vergleich zu anderen Insektenarten sind die Eier von D. antiqua relativ klein. Bisher angewandte Desinfektionsmethoden, wie z. B. das kurze Einweichen der Eier in 0,1%igem Natriumdodecylbenzolsulfonat, gefolgt von einer 5-minütigen Behandlung mit einer 2%igen Wasserstoffperoxidlösung, um axenische Kakerlakeneierzu erhalten 28, oder die Verwendung einer 10%igen Natriumhypochloritlösung für 10 min zur Oberflächendesinfektion der Eier des Roten Palmrüsselkäfers29, sind nicht für die Desinfektion von D. antiqua geeignet Eier. Es existieren frühere Studien zur Desinfektion von Eiern von Diptera-Arten, wie z. B. die Verwendung von Wasserstoffperoxidlösungen als Händedesinfektionsmittel und Wasserstoffperoxid als Oberflächendesinfektionsmittel zur Sterilisation von Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) Eiern30. Daher ist es notwendig, die Wahl des Desinfektionsmittels und die Desinfektionszeit zu optimieren. Nach Experimenten wurde festgestellt, dass die Verwendung von 0,26 % NaClO und 75 % EtOH, die Desinfektion der Eier für 0,5 Minuten und die dreimalige Wiederholung des Vorgangs eine Sterilisation von D. antiqua-Eiern erreichen kann.
Nach der Gewinnung von axenischen Eiern ist ein weiterer wichtiger Aspekt der Aufzucht von axenic D. antiqua die Bereitstellung steriler Nahrung für die Larven in vitro. Obwohl künstliche Diäten natürliche Lebensmittel nicht vollständig replizieren können, haben die Studien31, 32, 33 die Durchführbarkeit der Aufzucht von Insekten mit künstlicher Ernährung gezeigt. Der Nährstoffgehalt künstlicher Diäten kann das Immunsystem und die Anpassungsfähigkeit von Insekten beeinflussen34. Daher ist es wichtig, dass künstlich zubereitete Diäten ähnliche Nährstoffbestandteile wie natürliche Lebensmittel enthalten. Dies trägt dazu bei, dass die gezüchteten Insekten die notwendigen Nährstoffe für ihre Entwicklung, Immunantwort und allgemeine Gesundheit erhalten. In dieser Studie dienen Frühlingszwiebeln als Hauptbestandteil einer sterilen Ernährung für D. antiqua. Halbfermentierte Diäten liefern bessere Nährstoffe für D. antiqua und tragen zu ihrem Wachstum und ihrer Entwicklung bei. Darüber hinaus zielt das Mischen des Larvenhomogenats mit dem Futter darauf ab, die Vorverdauung der Nahrung durch die Darmmikrobiota außerhalb des Körpers zu erleichtern. Denn Darmbakterien wirken sich auf die Nahrungsaufnahme und Verdauung von Insekten aus35. Die Verwendung dieser Methode zur Zubereitung steriler Diäten für D. antiqua vereinfacht den Prozess und verbessert die Effizienz der Diätvorbereitung erheblich.
Bakterielle Symbionten, die mütterlich innerhalb von Zellen übertragen werden, sind in Insekten weit verbreitet36. Wolbachia, ein intrazelluläres Bakterium, das mütterlich übertragen wird, kommt in zahlreichen Insekten vor37. Wolbachia ist vor allem für ihre Rolle bei der Manipulation der Fortpflanzung bekannt, da sie das Geschlechterverhältnis der Nachkommen des Wirts so verändern kann, dass mehr infizierte Weibchen produziertwerden 38. Nach der Überprüfung des axenischen Zustands von D. antiqua-Larven wurde festgestellt, dass die Larven nach der Desinfektion im Wesentlichen axenisch waren, mit Ausnahme des endosymbiontischen Bakteriums Wolbachia, das im Zytoplasma von Eierstockgewebezellen in D. antiqua vorhanden ist und vertikal über Generationen durch das Zytoplasma der Eizellen übertragen wird. Was die Methode zur Eliminierung von Wolbachia betrifft, so ist die antibiotische Behandlung ein gängiger Ansatz. Zusammenfassend wird in diesem Artikel eine Methode zur Aufzucht von axenischer D. antiqua vorgestellt. Gemäß dem Protokoll kann axenische D. antiqua erfolgreich gezüchtet werden. Darüber hinaus zeichnet sich diese Methode durch ihre Einfachheit und geringen Kosten aus, was einen neuen Ansatz für die Aufzucht anderer axenischer Insekten bietet und die Durchführbarkeit der Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Insekten und Darmmikrobiota erhöht.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (32272530), dem New Twenty Policies for University in Jinan Project (2021GXRC040), Major Scientific and Technological Innovation Projects in Shandong Province (2021TZXD002) und dem Science and Education Integration Project der Qilu University of Technology (2022PYI009, 2022PY016, 2022PT105) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μM filter bottle | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| 0.22 μM Syringe Filter | Biosharp | BS-QT-011 | |
| 100-mesh sieve | Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory | No Catalog numbers | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 2x Taq PCR Master Mix | GENVIEW | GR1113-1ML | |
| 5.2% NaClO solution | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80010428 | |
| 500 mL Conical flask | Thermo Scientific | 4103-0500 | |
| 50 mL vented centrifuge tube | JET BIOFIL | BRT-011-050 | |
| 50x TAE buffer | GENVIEW | GT1307 | |
| Agar powder | Ding Guo | DH010-1.1 | |
| Biochemical incubator | STIK | 21040121500010 | |
| Cell sieve | SAINING | 5022200 | |
| Choline chloride | Sangon Biotech | A600299-0100 | |
| ddH2O | Ding Guo | PER018-2 | |
| Disposable grinding pestle | JET BIOFIL | CSP-003-002 | |
| DNA extraction kit | Sangon Biotech | B518221-0050 | |
| DNA Marker | Sangon Biotech | B600335-0250 | |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Filter paper | NEWSTAR | 1087309025 | |
| Food processor | Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd. | WBL25B26 | |
| Illuminated incubator | Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd. | A16110768 | |
| L-Ascorbic acid | Sangon Biotech | A610021-0100 | |
| L-shaped spreader | SAINING | 6040000 | |
| Nutrient agar medium | Hope Bio | HB0109 | |
| Scissors | Bing Yu | BY-103 | Purchase on Jingdong |
| Shock incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd. | 2020000014 | |
| Sucrose | GENVIEW | CS326-500G | |
| Super Green nucleic acid dye | Biosharp | BS355A | |
| Super-clean table | Heal Force | AC130052 | |
| TSB | Hope Bio | HB4114 | |
| Vacuum pump | Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd. | 22051031 | |
| Yeast extract | Thermo Scientific | LP0021B |
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