Summary
Se describe un procedimiento sencillo para la cría de Delia antiqua axénica con dietas estériles semifermentadas. Solo se detectó una cepa de Wolbachia en cada estadio de D. antiqua axénica mediante PCR.
Abstract
Los insectos axénicos se obtienen a partir de sistemas de cría artificial estériles utilizando medios estériles. Estos insectos, caracterizados por su pequeño tamaño, ciclo de crecimiento corto y bajos requerimientos de alimento, son ideales para estudiar la relación entre microorganismos y hospedadores. La microbiota intestinal influye significativamente en las características fisiológicas de los insectos huéspedes, y la introducción de cepas específicas en los insectos axénicos proporciona un método para verificar las funciones microbianas intestinales. Delia antiqua, una plaga amenazante del orden Diptera, la familia Anthomyiidae y el género Delia, se alimenta principalmente de cebollas, ajos, puerros y otras verduras de la familia Liliaceae. Sus larvas se alimentan de los bulbos, causando la pudrición, el marchitamiento e incluso la muerte de plantas enteras. Al criar larvas axénicas, se pueden realizar estudios de seguimiento para observar los efectos de la microflora intestinal en el crecimiento y desarrollo de D. antiqua. A diferencia del método que implica la eliminación de antibióticos de los microbios asociados, este artículo presenta un enfoque de bajo costo y alta eficiencia para la cría de D. antiqua axénica. Después de la esterilización superficial de los huevos de D. antiqua , se utilizaron dietas estériles semifermentadas para criar larvas, y el estado axénico de D. antiqua se verificó mediante ensayos dependientes e independientes del cultivo. En conclusión, la combinación de la esterilización de huevos de insectos y la preparación de dietas estériles para el cultivo de larvas ha permitido el desarrollo de un método eficiente y sencillo para la obtención de D. antiqua axénica. Este método proporciona un enfoque poderoso para estudiar las interacciones entre insectos y microflora.
Introduction
Los animales axénicos, definidos como animales en los que no se pueden detectar microorganismos o parásitos viables, son modelos experimentales valiosos para estudiar las interacciones huésped-microorganismo 1,2. Los insectos, el grupo más grande de invertebrados, pueden formar relaciones simbióticas con los microorganismos3. Los insectos axénicos se pueden utilizar para estudiar las interacciones huésped-simbionte en sistemas simbióticos4. Por ejemplo, Nishide et al.5 establecieron un procedimiento práctico de cría estéril para el gusano de mal olor Plautia stali, que permite un análisis fiable y riguroso de las interacciones huésped-simbionte en sistemas simbióticos modelo. Los insectos axénicos pueden producirse esterilizando la etapa de huevo y proporcionando alimento estéril a las larvas y adultos 6,7. Los insectos axénicos son de gran importancia y se utilizan ampliamente en la investigación biológica. Por ejemplo, un estudio realizado por Somerville et al.8 demostró que las polillas dorso de diamante inoculadas con Enterobacter cloacae mejoraron la adaptabilidad de los machos transgénicos.
Delia antiqua Meigen es una plaga económicamente importante de las cebollas y otros cultivos de Liliaceae en todo el mundo, ya que sus larvas dañan los bulbos de las cebollas y otros cultivos de Liliaceae9. D. antiqua se encuentra principalmente en climas templados y está muy extendida en las zonas de cultivo de cebollas de América, Europa y Asia. Si no se controla adecuadamente, puede causar pérdidas en la cosecha de cebolla (Allium cepa L.), ajo (Allium sativum L.), chalotes (Allium fistulosum L.) y puerros (Alliumchoenoprasum L.) que oscilan entre el 50% y el 100%10,11. Las larvas se alimentan de las partes subterráneas de las plantas, y esta alimentación hace que las plántulas se marchiten y finalmente mueran. Además, las plantas dañadas pueden permitir la entrada de patógenos, lo que provoca la pudrición de los bulbos12. Incluso si las plantas no son consumidas completamente por las larvas, el daño que causan hace que las plantas de cebolla no sean comercializables y resultan en pérdidas económicas.
Los insectos están estrechamente asociados con la microbiota intestinal, y la mayoría de los intestinos de los insectos contienen una variedad de bacterias simbióticas que prosperan con los nutrientes proporcionados por el huésped13,14. Jing et al.15 demostraron que la función principal de la comunidad simbiótica intestinal es proporcionar nutrientes esenciales, seguida de funciones relacionadas con la digestión y la desintoxicación. En ciertos casos, las bacterias intestinales pueden servir como un recurso microbiano para el control de plagas. En consecuencia, es deseable estudiar el rendimiento y las funciones específicas de las bacterias intestinales individuales dentro del cuerpo de D. antiqua. Por lo tanto, la preparación de larvas axénicas es particularmente importante para estudiar las interacciones entre cepas bacterianas específicas e insectos16. Actualmente, un método comúnmente utilizado para eliminar las bacterias intestinales de los insectos es el uso de una combinación de antibióticos para erradicar los microbios asociados 17,18,19. A diferencia del uso de antibióticos solos, que solo pueden reducir el número microbiano, la cría axénica de insectos permite controlar la composición y la cantidad de microorganismos, lo que permite una validación más precisa de la funcionalidad de la microbiota intestinal.
Por lo tanto, este artículo presenta un protocolo para la preparación y cría de D. antiqua axénica. El alimento para larvas axénicas se obtiene mediante la esterilización a alta temperatura de dietas naturales combinadas con alimentos semifermentados. Los huevos se esterilizan siguiendo un protocolo experimental para obtener huevos axénicos y, finalmente, se cultivan larvas axénicas a partir de los huevos axénicos. El sistema de cría axénica se llevó a cabo durante una sola generación para el experimento. Esto facilitará el estudio de la interacción entre los insectos y la microbiota intestinal.
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Protocol
D. antiqua se obtienen del campo de Fanzhen, Taian.
1. Preparación de dietas estériles
- Pele las capas exteriores de las cebolletas y deseche las hojas verdes. Mantenga la parte blanca de las cebolletas (Figura 1A) y lávelas con agua estéril, repitiendo el proceso de enjuague tres veces. Cortar la parte blanca de las cebolletas en trozos cortados en cubitos de 1-2 cm con unas tijeras (ver Tabla de materiales) esterilizadas con una solución de EtOH al 75 % (mencionada en el paso 2.5) para su uso posterior.
- Pese 50 g de las cebolletas cortadas en cubitos y colóquelas en un procesador de alimentos (consulte la tabla de materiales). Agregue 50 ml de agua esterilizada y muélalos cinco veces durante 2 minutos cada uno. Todas las cebolletas cortadas en cubitos deben molerse hasta obtener una consistencia pastosa (Figura 2A).
- Use pinzas para transferir 10 piezas de larvas de3er estadio de D. antiqua a un tubo de centrífuga de 10 ml que contenga 10 ml de 1x PBS, y muélalas con un mortero de molienda desechable (consulte la Tabla de materiales) durante aproximadamente 5 minutos para obtener un líquido de molienda para larvas.
- Vierta el líquido pastoso de cebolleta y el líquido de molienda de larvas en un matraz cónico limpio de 500 ml (consulte la tabla de materiales). Envuelva la boca del matraz cónico con dos capas de película de sellado transparente y, a continuación, coloque el matraz en una incubadora agitadora (ver Tabla de materiales) para la fermentación a 25 °C y 180 rpm durante 12 h (Figura 2B).
- Corta siete capas de gasa cuadrada con lados de 10 cm (sin necesidad de esterilidad) con unas tijeras y apílalas para formar un simple dispositivo de filtro. Vierta lentamente el líquido de cebolleta fermentado sobre la gasa y exprima el líquido filtrado en un nuevo matraz cónico de 500 ml. Envuelva el residuo restante de cebolleta en la gasa en papel de aluminio para su uso posterior.
- Filtrar el filtrado obtenido en el paso anterior utilizando una bomba de vacío (ver Tabla de Materiales) y un embudo Buchner. Coloque el papel de filtro humedecido por agua desionizada en el embudo Buchner y luego vierta el filtrado y realice la filtración por succión tres veces con diferentes papeles de filtro. Recoger el filtrado final en el matraz cónico de 500 ml.
- Realice otra filtración utilizando una botella de filtro de 0,22 μM y una bomba de vacío. Enrosque la tapa del matraz del filtro de succión en un banco ultralimpio (consulte la tabla de materiales) para su uso posterior. En este punto, se obtiene el residuo de cebolleta fermentada y el filtrado (Figura 2C).
NOTA: El líquido filtrado obtenido de este paso será estéril. (La botella de filtro de 0,22 μM es un sistema de filtración al vacío estéril para esterilizar el filtrado). - Repita los pasos anteriores para obtener residuos y filtrado de cebolleta sin fermentar. Aquí la diferencia es que la fermentación no es necesaria.
- Pesar 0,24 g de cloruro de colina y 0,56 g de ácido L-ascórbico (ver Tabla de materiales) en un tubo de centrífuga de 10 ml. Añadir 3 mL de agua desionizada y agitar vigorosamente hasta que se disuelvan por completo. En el banco ultralimpio, utilice una jeringa nueva de 5 ml y coloque tres filtros de jeringa de 0,22 μM (consulte la tabla de materiales) para esterilizar la solución y colóquela en un tubo de centrífuga estéril de 10 ml para su uso posterior.
NOTA: El cloruro de colina es un neurotransmisor esencial para el crecimiento de insectos, mientras que el ácido L-ascórbico actúa como conservante. - Pesar 2 g de agar en polvo y 6 g de TSB (ver Tabla de Materiales) y verterlos en un matraz cónico de 500 mL. Luego agregue 100 ml de agua desionizada para preparar el medio de cultivo. Después de enjuagar la varilla de vidrio con agua desionizada, utilícela para revolver la mezcla hasta que esté bien mezclada. A continuación, selle el matraz cónico con dos capas de film de sellado transparente.
- Envuelva las cebolletas fermentadas y las cebolletas no fermentadas (mencionadas en los pasos 1.5 y 1.8) en papel de aluminio y esterilícelas, junto con el medio de cultivo, en un autoclave a 121 °C durante 20 min.
- En el banco ultralimpio, vierta el cloruro de colina esterilizado, el ácido L-ascórbico y el filtrado estéril en el medio de cultivo mientras se agita suavemente para mezclarlos bien. Finalmente, agregue las cebolletas fermentadas y no fermentadas y agite vigorosamente con la mano para obtener las dietas estériles. Vierta las dietas en los tubos de centrífuga de 50 ml (estériles; tapa de ventilación con una membrana hidrofóbica de PVDF de 0,22 μM) (ver Tabla de materiales) en ángulo (Figura 2D).
NOTA: Después de la esterilización, la temperatura del medio de cultivo debe mantenerse entre 65 y 80 °C para evitar un enfriamiento y solidificación rápidos al agregar cebolletas u otros ingredientes. Además, en cada tubo, vierte aproximadamente 10-15 mL de dietas. Una vez que las dietas se hayan solidificado, almacenar los tubos en un refrigerador a 4 °C, si no se utiliza inmediatamente.
2. Adquisición de huevos axénicos
- Sistema de cría de laboratorio para D. antiqua
- Coloque una jaula de cría en una incubadora iluminada internamente con LED a 25 °C (24 h al ciclo, la relación de luz y oscuridad es de 16:8) para criar adultos machos y hembras, permitiéndoles aparearse y poner huevos. Llene el dispensador de agua (Figura 1B) con agua y séllelo con algodón humedecido para proporcionar agua a los adultos.
- Coloque cuatro fondos de placas de Petri de 35 mm x 12 mm en una tapa de placa de Petri de 94 mm x 16 mm. Humedezca el algodón con agua ionizada y luego coloque el algodón húmedo en dos de los fondos de la placa de Petri, y encima del algodón, agregue una cucharada de sacarosa.
- Llene los otros dos fondos de la placa de Petri con dos cucharadas de sacarosa y extracto de levadura (ver Tabla de Materiales), que sirven como alimento para los insectos adultos (Figura 1C).
NOTA: No es necesario esterilizar el extracto de sacarosa y levadura mencionado en los pasos 2.1.2 y 2.1.3. - Coloque un fondo de placa de Petri de 94 mm x 16 mm que contenga arena humedecida y un trozo de diente de ajo pelado y sin raíces (Figura 1D) dentro de la jaula de moscas para recolectar los huevos. La hembra se sentirá atraída por el olor del ajo y pondrá huevos a su alrededor.
- Recogida de huevos
- Saque el dispositivo de oviposición, que es una placa de Petri de 94 mm x 16 mm que contiene arena y ajo mencionada anteriormente (paso 2.14), de la jaula. Vierta la arena junto con el ajo en un vaso de precipitados de 500 ml y use agua del grifo para enjuagar los huevos restantes del ajo en el vaso de precipitados. En este punto, los huevos están flotando en el agua.
- Tome un colador de malla 100 (consulte la tabla de materiales) y humedézcalo con agua del grifo. A continuación, vierta el agua que contiene los huevos flotantes del vaso de precipitados en el colador. Los huevos permanecerán en el colador.
- Después de que los huevos se sequen naturalmente en el colador, use un cepillo para barrer suavemente los huevos sobre una placa de Petri.
- El primer día, enjuague el dispositivo de oviposición para recoger los huevos sin desinfección ni esterilización. El segundo día a las cuatro de la tarde, vuelva a enjuagar los huevos y recójalos tamizándolos con agua limpia.
NOTA: La recolección de los huevos en el segundo día es para asegurar una tasa de crecimiento constante en las etapas posteriores. A las cuatro de la tarde es el pico de puesta de huevos de D. antiqua. Por lo tanto, es ideal recolectar los huevos en este momento. - Coloque los huevos recolectados en un tamiz de células estériles (consulte la Tabla de materiales) en el banco ultralimpio (Figura 3A).
- Preparar la solución para la esterilización de óvulos
- Tome 5 mL de NaClO al 5,2% (ver Tabla de Materiales) y transfiéralo a un matraz cónico esterilizado de 250 mL. Agregue 95 mL de agua esterilizada para obtener un volumen total de 100 mL, lo que da como resultado una solución de NaClO al 0,26 %.
- Para preparar una solución de EtOH al 75 %, tome 75 ml de EtOH al 99,7 % y transfiéralo a un matraz cónico esterilizado de 250 ml. Agregue 25 ml de agua esterilizada para obtener un volumen total de 100 ml, lo que da como resultado una solución de EtOH al 75%.
- Vierta 30 ml de NaClO en una placa de Petri y vierta 30 ml de EtOH en otra placa de Petri. Coloque el tamiz de células que contiene los huevos mencionados en el paso 2.4 en el plato que contiene NaClO. Sumérjalo en la solución de NaClO al 0,26% durante 0,5 min. A continuación, transfiera el colador al plato que contiene EtOH, dejándolo en remojo en la solución de EtOH al 75% durante otros 0,5 minutos.
- Repetir este proceso tres veces, alternando entre 0,26% de NaClO y 75% de EtOH cada 0,5 min. Después de eso, se obtendrán huevos axénicos. En este punto, el tamiz que contiene los huevos debe sumergirse en EtOH.
NOTA: Para garantizar una esterilización completa, utilice una pipeta de 1 ml para aspirar NaClO y EtOH y dispersar los huevos. Repita el proceso de enjuague varias veces. Este paso limpiará aún más la superficie de los huevos de bacterias e impurezas residuales, asegurando una superficie limpia y estéril.
3. Cría de larvas axénicas
- Para transferir los huevos esterilizados, utilice unas tijeras que hayan sido esterilizadas con una lámpara de alcohol para cortar la punta final de una pipeta de 1 ml (Figura 3B). Asegúrese de que la abertura final de la pipeta cortada sea mayor que el diámetro de los huevos (aproximadamente 2 mm). A continuación, utilice la pipeta para transferir los huevos de la solución de EtOH (huevos junto con la solución) (Figura 3C) a un tubo de centrífuga que contenga las dietas estériles, y cada tubo debe contener aproximadamente 20-50 huevos (Figura 3D). Repite este proceso hasta que todos los óvulos hayan sido transferidos.
NOTA: El diámetro de la punta de la pipeta debe ser lo más grande posible para evitar que los huevos se rompan durante la transferencia, lo que podría provocar su muerte. - Utilice una pipeta para eliminar el exceso de etanol del tubo. Coloque el tubo de centrífuga cerrado con tapas dentro de una bolsa autosellante y coloque un trozo de algodón en la abertura de la bolsa para permitir la circulación del aire. Por último, colocar la bolsa dentro de una incubadora a 25 °C (humedad relativa: 50%-70%; fotoperiodo: 16 h luz: 8 h oscuridad) para su observación y cultivo.
- Aproximadamente tres días después, los huevos axénicos de las dietas comienzan a eclosionar (Figura 4A). Las larvas eclosionadas estarán activas y la superficie de las dietas estériles ya no será lisa. Las larvas comenzarán a alimentarse de las dietas.
- Continúe observando las larvas hasta que alcancen la etapa de larvas del2º estadio. Siga monitoreando su crecimiento y desarrollo durante este período.
- Después de 9-12 días, más del 80% de los huevos se han convertido en larvas de 3er estadio (Figura 4B). Esto indica un crecimiento y desarrollo exitoso de las larvas.
4. Validación de larvas axénicas con ensayos dependientes del cultivo
- Seleccione al azar tres larvas axénicas del3er estadio del tubo de centrífuga.
- Coloque las larvas en una placa de Petri de 94 mm x 16 mm que contenga alcohol al 75% para su limpieza. Después de eso, transfiéralos a un recipiente con agua estéril para enjuagarlos más.
- Utilice una pinza de disección desinfectada que haya sido esterilizada con una solución de EtOH al 75% para agarrar las larvas (la cabeza y la cola se muestran en la Figura 5A). Use tijeras de disección para quitar los extremos de la cabeza y la cola (Figura 5B). Sostenga la cola de las larvas con las pinzas y use otra pinza para apretar suavemente desde la cola hasta la cabeza y extraer los órganos internos (el resultado se muestra en la Figura 5C). Coloque los órganos internos en agua desionizada y tire suavemente del intestino presionando el tejido adiposo con fórceps, y coloque el órgano interno extraído (Figura 5D) en agua estéril para su uso posterior.
- Coloque el intestino en un tubo de centrífuga estéril de 1,5 ml, agregue 500 μl de tampón 1x PBS esterilizado y use un mortero desechable para moler el tejido intestinal hasta obtener un homogeneizado.
- Tome 100 μL del homogeneizado y agréguelo a un medio de agar nutriente. Utilice un esparcidor en forma de L (consulte la Tabla de materiales) para rayar la placa de agar.
- Colocar la placa de Petri en una incubadora bioquímica a 28 °C e incubar durante 72 h para observar el crecimiento de las colonias.
5. Validación de larvas axénicas con ensayos independientes del cultivo
- Extraiga el ADN total del tejido intestinal de las larvas axénicas utilizando un kit de extracción de ADN (consulte la Tabla de materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Mida la concentración de ADN con un espectrofotómetro UV.
- Realice la reacción de PCR utilizando cebadores universales de ARNr bacteriano 16S (1492R: 5'- GGTTACCTTGTTACGACTT -3', 27F: 5'- AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3'). El volumen total de reacción es de 25 μL y consta de 1 μL de plantilla de ADN, 0,5 μL de cebador directo, 0,5 μL de cebador inverso, 10,5 μL ddH2O y 12,5 μL 2x Taq PCR Master Mix (consulte la Tabla de materiales). Ajuste las condiciones de reacción de la PCR de la siguiente manera: desnaturalización inicial a 94 °C durante 3 min; 35 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 s, recocido a 55 °C durante 30 s y extensión a 72 °C durante 90 s; extensión final a 72 °C durante 10 min. Almacene los productos de PCR a 4 °C para su posterior análisis.
- Realizar la reacción de PCR utilizando cebadores ITS fúngicos universales (ITS1: 5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3', ITS4: 5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3'). El volumen total de reacción es de 25 μL y consta de 1 μL de plantilla de ADN, 0,5 μL de cebador directo, 0,5 μL de cebador inverso, 10,5 μL ddH2O y 12,5 μL 2x Taq PCR Master Mix. Ajuste las condiciones de PCR a 95 °C durante 5 min; 35 ciclos de 95 °C durante 30 s, 55 °C durante 1 min y 72 °C durante 90 s; seguido de 72 °C durante 10 min. Almacene los productos de PCR a 4 °C para su posterior análisis.
- Utilice el colorante de ácido nucleico Super Green (consulte la Tabla de materiales) para mezclar con cada uno de los dos tipos de productos de PCR de manera uniforme y analícelos por electroforesis en un gel de agarosa al 1% en 1 tampón TAE (diluido a partir de 50 veces TAE, consulte la Tabla de materiales). Utilice 3 μL de marcador de ADN (ver Tabla de Materiales) como referencia.
- Utilice un transiluminador UV para observar el gel y localizar el fragmento objetivo.
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Representative Results
Las etapas de la vida de D. antiqua se representan en la Figura 4. El ciclo de vida completo comprende huevos, larvas, pupas (Figura 4C) y adultos (Figura 4D). Se cultivan en tubos de centrífuga estériles, y su aparición y tasa de supervivencia son indistinguibles de las de D. antiqua criada en condiciones no axénicas. Los tiempos de crecimiento y desarrollo para cada etapa de D. antiqua se pueden encontrar en la Figura 6. El estado de huevo de D. antiqua criado no axénicamente es de 2.83 ± 0.29 días, y el de D. antiqua criado axénicamente es de 2.83 ± 0.29 días, sin diferencia significativa entre los dos (prueba t independiente, t = 0.00, p = 1.00). El estadio larvario normal dura entre 13,83 ± 0,76 días, mientras que el estadio larvario axénico dura entre 14,50 ± 0,50 días, sin diferencias significativas entre ambos (prueba t independiente, t = 1,27, p = 0,27). El estado de pupa de D. antiqua criado normalmente es de 17,33 ± 0,76 días, y el de D. antiqua criado axénicamente es de 18,00 ± 0,50 días, sin diferencias significativas entre ambos (prueba t independiente, t = 1,27, p = 0,27). El tiempo de supervivencia de los adultos es de 81,50 ± 1,00 días para la cría normal y de 80,33 ± 0,76 días para la cría axénica, sin diferencias significativas entre ambas (prueba t independiente, t = 1,61, p = 0,18). Se puede observar que no existe diferencia significativa en el tiempo de desarrollo entre D. antiqua axénica y las criadas en condiciones normales.
Los ensayos dependientes del cultivo mostraron que no se detectaron colonias en los intestinos de las larvas (Figura 7). Además, el análisis de PCR basado en ARNr bacteriano 16S reveló la presencia de una banda en torno a los 1500 pb (Figura 8A), identificada como Wolbachia (el número de acceso del GenBank para esta secuencia de nucleótidos es: OR564190), una bacteria endosimbiótica. Sin embargo, no se observaron bandas en el análisis de PCR dirigidas a regiones ITS fúngicas (Figura 8B). Esto indica que las larvas han alcanzado el estado axénico. Las larvas axénicas son de gran importancia para estudiar los mecanismos de interacción entre D. antiqua y los microorganismos, así como para prevenir y controlar el daño causado por D. antiqua.
Figura 1: Los dispositivos de cría y el alimento de D. antiqua. (A) La parte blanca de la cebolleta para las larvas. (B) Dispensador de agua para adultos. (C) Alimentos para adultos. D) Dispositivo de recogida de los huevos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Componentes de la preparación de dietas. (A) Cebolletas molidas. (B) Cebolletas fermentadas. (C) Residuo y filtrado de cebolleta fermentada. D) Dietas preparadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: El proceso de transferencia de óvulos. (A) Huevos en el tamiz de celdas. (B) Pipeta de 1 ml sin la punta del extremo. (C) Pipeta de 1 ml con huevos. (D) Huevos transferidos a dietas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Etapas de vida de D. antiqua axénica. (A) Huevos. b) Larvas. (C) Pupa. D) Adultos femeninos y masculinos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Proceso de disección de los intestinos de las larvas. (A) La cabeza y la cola de la larva. (B) La larva sin la cabeza y la cola. (C) Separación de tejidos intestinales y corporales. (D) Un intestino intacto después de la disección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Tiempo de desarrollo de cada etapa de crecimiento de D. antiqua criada normalmente y criada axénicamente. No hay diferencias significativas en el tiempo de desarrollo entre D. antiqua criado axénicamente y criado normalmente. Prueba t independiente, p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Confirmación de la esterilidad de D. antiqua mediante la selección aleatoria de tres larvas y la incubación de homogeneizados intestinales en placas de agar TSA y PDA. No se observaron bacterias en las larvas alimentadas con dietas estériles. (A) Larvas axénicas en TSA. (B) Larvas normales en TSA. (C) Larvas axénicas en PDA. (D) Larvas normales en PDA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Confirmación de la esterilidad de D. antiqua mediante análisis de PCR utilizando cebadores universales de ARNr 16S e imprimadores ITS fúngicos. La banda diana del gen 16S rRNA es de ~1.500 pb. Se observó una banda de aproximadamente 1500 pb y se identificó como la bacteria endosimbiótica Wolbachia. La banda diana del gen ITS es de 500-750 pb. No se observó ninguna banda diana en los grupos de FA. (A) Electroferograma de ARNr 16S. (B) Electroferograma ITS. Abreviaturas: M = marcador; NC = control negativo; NF = alimentación normal; AF = alimentación axénica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los insectos poseen una microbiota intestinal muy compleja20,21, lo que hace necesario el uso de insectos axénicos inoculados con cepas microbianas intestinales específicas para estudiar las interacciones insecto-microorganismo. La preparación de insectos axénicos es crucial para este tipo de esfuerzos de investigación. El tratamiento con antibióticos es un método utilizado para eliminar la microbiota intestinal. Por ejemplo, Jung y Kim, de22 años, alimentaron a Spodoptera exigua con penicilina, mientras que Raymond, de23 años, alimentó a P. xylostella con una dieta artificial que contenía rifampicina para eliminar las bacterias intestinales. Sin embargo, el tratamiento con antibióticos no puede eliminar por completo las bacterias intestinales y tiene muchos efectos secundarios en los insectos huéspedes. Estos incluyen cambios en la actividad de las enzimas metabólicas, deterioro de la función intestinal, inhibición del crecimiento, desarrollo y reproducción, así como aumento de las tasas de mortalidad 23,24,25. En consecuencia, la funcionalidad de la microbiota intestinal de los insectos puede quedar enmascarada después del tratamiento con antibióticos. Afortunadamente, este problema puede superarse desinfectando químicamente la superficie de los huevos, lo que permite la producción de insectos axénicos con relativa facilidad16. Comparativamente, la combinación de la desinfección superficial de los huevos seguida de la alimentación con dietas estériles es más efectiva y factible que el tratamiento con antibióticos26,27.
La obtención de D. antiqua axénica se basa principalmente en la utilización de huevos axénicos y dietas estériles. En comparación con otras especies de insectos, los huevos de D. antiqua son relativamente pequeños. Los métodos de desinfección empleados anteriormente, como remojar brevemente los huevos en sulfonato de dodecilbenceno de sodio al 0,1% seguido de un tratamiento de 5 minutos con una solución de peróxido de hidrógeno al 2% para obtener huevos de cucaracha axénica28, o usar una solución de hipoclorito de sodio al 10% durante 10 minutos para desinfectar la superficie de los huevos del picudo rojo29, no son adecuados para desinfectar D . antiqua huevos. Existen estudios previos sobre la desinfección de huevos de especies de dípteros, como la utilización de soluciones de peróxido de hidrógeno utilizadas como desinfectante de manos y peróxido de hidrógeno como desinfectante de superficies para esterilizar huevos de Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae)30. Por lo tanto, se hace necesario optimizar la elección del desinfectante y el tiempo de desinfección. Después de la experimentación, se ha encontrado que usando 0,26% de NaClO y 75% de EtOH, desinfectando los huevos durante 0,5 min y repitiendo el proceso tres veces se puede lograr la esterilización de los huevos de D. antiqua .
Después de obtener huevos axénicos, otro aspecto crucial de la cría de D. antiqua axénicos es proporcionarles dietas estériles para las larvas in vitro. A pesar de que las dietas artificiales no pueden replicar completamente los alimentos naturales, los estudios 31,32,33 han demostrado la factibilidad de criar insectos utilizando dietas artificiales. El contenido nutricional de las dietas artificiales puede afectar el sistema inmunológico y la adaptabilidad de los insectos34. Por lo tanto, es importante que las dietas preparadas artificialmente contengan componentes nutricionales similares a los alimentos naturales. Esto ayudará a garantizar que los insectos criados reciban los nutrientes necesarios para su desarrollo, respuesta inmunitaria y salud general. En este estudio, las cebolletas sirven como el componente principal de las dietas estériles para D. antiqua. Las dietas semifermentadas proporcionan mejores nutrientes para D. antiqua, contribuyendo a su crecimiento y desarrollo. Además, la mezcla del homogeneizado larvario con las dietas tiene como objetivo facilitar la predigestión de las dietas por parte de la microbiota intestinal fuera del cuerpo. Esto se debe a que las bacterias intestinales tienen un efecto sobre la alimentación y la digestión de los insectos35. El uso de este método para preparar dietas estériles para D. antiqua simplifica el proceso y mejora significativamente la eficiencia de la preparación de la dieta.
Los simbiontes bacterianos transmitidos por vía materna dentro de las células están ampliamente presentes en los insectos36. La Wolbachia, una bacteria intracelular transmitida por vía materna, está presente en numerosos insectos37. Wolbachia es más comúnmente conocida por su papel en la manipulación reproductiva, ya que puede sesgar la proporción de sexos de la descendencia del huésped hacia la producción de más hembras infectadas38. Después de verificar el estado axénico de las larvas de D. antiqua , se encontró que las larvas eran esencialmente axénicas después de la desinfección, a excepción de la bacteria endosimbiótica Wolbachia, presente en el citoplasma de las células del tejido ovárico en D. antiqua y transmitida verticalmente a través de generaciones a través del citoplasma de los óvulos. En cuanto al método para eliminar la Wolbachia, el tratamiento con antibióticos es un enfoque común. En resumen, este artículo presenta un método para la cría de D. antiqua axénica. De acuerdo con el protocolo, la D. antiqua axénica se puede criar con éxito. Además, este método se caracteriza por su simplicidad y bajo coste, proporcionando un nuevo enfoque para la cría de otros insectos axénicos y aumentando la viabilidad de estudiar las interacciones entre los insectos y la microbiota intestinal.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32272530), el Proyecto de Nuevas Veinte Políticas para la Universidad de Jinan (2021GXRC040), los Grandes Proyectos de Innovación Científica y Tecnológica en la Provincia de Shandong (2021TZXD002) y el Proyecto de Integración de la Ciencia y la Educación de la Universidad Tecnológica de Qilu (2022PYI009, 2022PY016, 2022PT105).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μM filter bottle | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| 0.22 μM Syringe Filter | Biosharp | BS-QT-011 | |
| 100-mesh sieve | Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory | No Catalog numbers | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 2x Taq PCR Master Mix | GENVIEW | GR1113-1ML | |
| 5.2% NaClO solution | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80010428 | |
| 500 mL Conical flask | Thermo Scientific | 4103-0500 | |
| 50 mL vented centrifuge tube | JET BIOFIL | BRT-011-050 | |
| 50x TAE buffer | GENVIEW | GT1307 | |
| Agar powder | Ding Guo | DH010-1.1 | |
| Biochemical incubator | STIK | 21040121500010 | |
| Cell sieve | SAINING | 5022200 | |
| Choline chloride | Sangon Biotech | A600299-0100 | |
| ddH2O | Ding Guo | PER018-2 | |
| Disposable grinding pestle | JET BIOFIL | CSP-003-002 | |
| DNA extraction kit | Sangon Biotech | B518221-0050 | |
| DNA Marker | Sangon Biotech | B600335-0250 | |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Filter paper | NEWSTAR | 1087309025 | |
| Food processor | Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd. | WBL25B26 | |
| Illuminated incubator | Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd. | A16110768 | |
| L-Ascorbic acid | Sangon Biotech | A610021-0100 | |
| L-shaped spreader | SAINING | 6040000 | |
| Nutrient agar medium | Hope Bio | HB0109 | |
| Scissors | Bing Yu | BY-103 | Purchase on Jingdong |
| Shock incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd. | 2020000014 | |
| Sucrose | GENVIEW | CS326-500G | |
| Super Green nucleic acid dye | Biosharp | BS355A | |
| Super-clean table | Heal Force | AC130052 | |
| TSB | Hope Bio | HB4114 | |
| Vacuum pump | Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd. | 22051031 | |
| Yeast extract | Thermo Scientific | LP0021B |
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