Summary
新皮質のマイクロ回路のネットワークのダイナミクスを理解するために、それは同時に、神経細胞の多数のアクティビティを記録することが不可欠です。のin vivo二光子カルシウムイメージングは1つが、単一セルの分解能で緻密な神経集団の活動を記録できるようにする唯一の方法です。
Abstract
新皮質のマイクロ回路のネットワークのダイナミクスを理解するために、それは同時に、神経細胞の多数のアクティビティを記録することが不可欠です。のin vivo二光子カルシウムイメージングは1つが、単一セルの分解能で緻密な神経集団の活動を記録できるようにする唯一の方法です。方法は、神経細胞の多数により取り込まれ、最終的に生体内で二光子顕微鏡を用いて時間経過のカルシウムイメージングによる神経細胞の活動を記録することができる蛍光カルシウム指示薬を注入し、頭蓋イメージングウィンドウを注入で構成されています。アストロサイト特異的染料の同時注入は1つがアストロサイトからニューロンを区別することができます。技術はより良い細胞の異なるグループのネットワークの相互作用を理解するニューロンの特定の亜集団に蛍光分子を発現するマウスで行うことができます。
Protocol
- 蛍光カルシウム指示薬溶液を準備します。我々は短いために染料をアセトキシメチルエステルの染料を使用し、またはAM。これらは、細胞外に注入すると細胞に取り込まれることができる色素です。我々は通常、1mMの濃度でオレゴングリーンBAPTA - 1 AMまたはAMにみたFluo - 4を使用してください。 AMの染料は、50マイクログラムのバイアルにInvitrogenから入手できます。まず、DMSOでプルロニックF - 127の20％溶液を調製。我々は、その透明になるまで、毎日使用する前に解決策を温める。我々は、カルシウム指示薬を10mMの濃度15〜20分間、20％のプルロニックのF-127/DMSOを溶かす。 150のNaCl、2.5 KClを、10 HEPES、pH7.4の：私たちは、その後mMで含む溶液に1mMの解決策を希釈する。さらに、100μMスルホローダミン101は通常、ラベルのアストロサイトに含まれており、注入中にピペットを可視化する。我々は、0.49ミクロン遠心フィルター（。。; Garaschukら、2006 Stosiekら、2003）に注入する前に解決策をフィルタリング。
- イメージを作成する領域の上に頭蓋窓を移植。我々はしているJoveの一般的なアプローチを説明したが、次の変更がカルシウム色素注入のために重要である。
基本的な硬膜を傷つけないように細心の注意をしながら、興味の皮質領域の上に直径2mmの小さな開頭術を行う。開頭以上の場所でカバーを固定しますが、部分的にのみ斜めに皮質を入力するピペットのスペースを確保するために、開頭術のエッジとガラスカバーの間に少し隙間を残して、開頭をカバーしています。注入前に、開頭周り歯科用セメントで浅い井戸を作る。よくは方向に吻側として拡張し、注射用マイクロピペットの挿入を可能にするために十分な浅いはずです。 - 顕微鏡のステージに転送マウスを移し、私達に示すように、頭部を固定化する血流イメージングのビデオ 。
- ピペットプラーを使用して、抵抗、2〜4メガオームをもたらす先端径にガラス管微小電極ピペットを引き出します。マイクロシリンジを用いて、ガラスピペット上にカルシウム指示薬染料のミックスをロードします。マイクロマニピュレータを使用して、静かにして細かく40X目的の下に置かれている4X目的を、使用して脳の表面にマイクロピペットを下げます。画像を隠すためにほとんどまたはまったく覆う血管が存在するような注射に適した場所を、選択してください。二光子顕微鏡を使用して、ピペットの先端が硬膜下200メートルの深さに、可視化し、徐々に皮質に高度です。その後、圧力がPicospritzerを使用して1分間に10 PSIに染料混合物を注入する。我々は通常、約200から300ミクロンでスペースで区切られたAMのカルシウム色素のミックスを2〜4回の注射を、お届けします。わずかにオーバーラップ注射のこのバルクローディングアプローチでは、600 × 600ミクロンと同じ規模の面積が十分にカルシウムイメージングのために染色されていることを保証します。拡散すると神経細胞に取り込まれる色素を可能にするために、AM染料混合物の注入後に撮影1時間を始めます。
- - in vivoでのカスタムを使用した2光子イメージングはカメレオンのTi -サファイアレーザー（800から880 nmに調整された）とケンブリッジテクノロジーのガルバノミラーを用いて二光子顕微鏡を作った行います。我々は、カレルヴォの研究室（Pologrutoら、2003）で開発さscanimageでもソフトウェアを使用して画像を取得する。レーザーパワーは、サンプルウェルには70 mWの下に一般的にです。フィールド全体の画像は、毎秒1.95から15.63フレーム（256 × 64ピクセルから512 × 256ピクセル）で、20X（0.95 NA）または40倍速（0.8 NA）オリンパスの目標を使用していずれかを取得されています。ラインスキャンは、500 Hzで取得されています。撮像中に、動物は軽いイソフルラン麻酔（0.6〜0.9パーセント）の下で維持され、また℃のハーバード大学の装置の温度制御装置を用いて37℃で保持されます。ケアは、可能な限り100回/分近くに動物の呼吸速度を維持するために取得されます。麻酔の使用のこのレベルは、動物を固定化する最低レベルですが、まだ記録される自発的な活動を可能にします。
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Discussion
電気生理学的記録に比べてこの方法の利点は低侵襲であり、緻密な神経回路網の活動の記録を可能にすることです。この手順を行う際には、硬膜を傷つけないように開頭術を行う際に細心の注意を取ることを覚えておくことが重要S。と硬膜下出血の少量でも非常にイメージングを不明瞭。
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Acknowledgments
我々は、カルシウムの指標のバルクロードを最適化する上で有用な議論をオルガGaraschukに感謝します。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Oregon Green BAPTA1-AM | Reagent | Invitrogen | O-6807 | |
| Fluo 4- AM | Reagent | Invitrogen | F-14201 | |
| Sulforhodamine 101 | Reagent | Invitrogen | S-359 | |
| Pluronic F-127 in DMSO | Reagent | Invitrogen | P-3000MP | |
| Centrifugal Filter (0.45 micron) | Reagent | EMD Millipore | UFC3 0HV 0S |
References
- Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1, (2006).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In-vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7319-7324 (2003).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online 2:13. Biomed Eng Online. 2, (2003).
