In Vivo 2-Photon Imaging di calcio a livello 2 / 3 dei topi

Summary

Per capire le dinamiche della rete di microcircuiti nella neocorteccia, è essenziale per registrare contemporaneamente l'attività di un gran numero di neuroni. In vivo a due fotoni di imaging del calcio è l'unico metodo che permette di registrare l'attività di una densa popolazione neuronale con cella singola risoluzione.

Abstract

Per capire le dinamiche della rete di microcircuiti nella neocorteccia, è essenziale per registrare contemporaneamente l'attività di un gran numero di neuroni. In vivo a due fotoni di imaging del calcio è l'unico metodo che permette di registrare l'attività di una densa popolazione neuronale con cella singola risoluzione. Il metodo consiste nel impiantare una finestra del cranio di imaging, l'iniezione di un colorante fluorescente indicatore di calcio che può essere occupato da un gran numero di neuroni e, infine, registrare l'attività dei neuroni, con immagini di calcio lasso di tempo utilizzando un in-vivo due microscopio fotone. Co-iniezione di astrociti specifici coloranti permette di differenziare i neuroni da astrociti. La tecnica può essere eseguita in topi che esprimono molecole fluorescenti in specifiche sottopopolazioni di neuroni per comprendere meglio le interazioni di rete dei vari gruppi di cellule.

Protocol

1. Preparare la soluzione di indicatore fluorescente calcio. Noi usiamo coloranti estere acetossimetil o AM coloranti in breve. Si tratta di coloranti che possono essere captata dalle cellule quando iniettate extracellulare. Usiamo tipicamente Oregon-Green Bapta-1-AM o Fluo 04:00 ad una concentrazione di 1 mM. Coloranti AM può essere ottenuto da Invitrogen in flaconcini da 50 microgrammi. Per prima cosa preparare una soluzione al 20% del Pluronic F-127 in DMSO. Noi caldo la soluzione prima dell'uso tutti i giorni fino al suo chiaro. Noi sciogliere l'indicatore di calcio del F-127/DMSO Pluronic 20% per 15-20 minuti ad una concentrazione di 10 mm. Abbiamo poi diluire la soluzione a 1 mm in una soluzione contenente, in mm: 150 NaCl, 2.5 KCl, 10 Hepes, pH 7,4. Inoltre, 100 mM solforodamina 101 è solitamente incluso per astrociti etichetta e visualizzare la pipetta durante l'iniezione. Noi filtrare la soluzione prima di iniezione con un filtro di 0,49 micron centrifuga (Stosiek et al, 2003;.. Garaschuk et al, 2006).
   
   
2. Impiantare una finestra cranica sopra l'area da acquisire. Abbiamo descritto l'approccio generale in JOVE , ma le seguenti modifiche sono importanti per l'iniezione di calcio colorante:
   
   Fai una craniotomia minore di 2 mm di diametro su tutta l'area corticale di interesse, facendo attenzione estrema a non danneggiare la sottostante dura. Fissare un coprioggetto in posizione sopra la craniotomia, ma solo parzialmente coprire la craniotomia, lasciando un piccolo spazio tra il bordo della craniotomia e il coprioggetto di vetro per lasciare spazio per una pipetta per entrare nella corteccia obliquamente. Prima dell'iniezione, fare un pozzo poco profondo con cemento dentale in tutto il craniotomia. Il bene dovrebbe estendono in direzione rostrale ed essere poco profondo abbastanza da consentire l'inserimento della micropipetta per l'iniezione.
   
   
3. Trasferire il mouse trasferite alla fase del microscopio e immobilizzare la testa, come mostrato nel nostro video di imaging del flusso sanguigno .
   
   
4. Tirare pipette microelettrodo vetro a un diametro punta cedendo 2-4 Mega Ohm della resistenza, con un estrattore pipetta. Caricare l'indicatore mix di calcio inchiostri a pigmenti sul pipetta di vetro con una microsiringa. Utilizzando un micromanipolatore, abbassare delicatamente la micropipetta sulla superficie del cervello con un obiettivo 4X, che viene poi finemente posizionato sotto un obiettivo 40X. Scegliere un luogo adatto per l'iniezione, in modo tale che ci sono pochi o nessun vasi sanguigni sovrastante per oscurare l'imaging. Utilizzando la microscopia a due fotoni, la punta della pipetta è visualizzato e avanzava lentamente nella corteccia, ad una profondità di 200 micrometri al di sotto della dura. Poi, la pressione iniettare la miscela colorante a 10 PSI per 1 minuto usando un Picospritzer. Noi di solito consegnare 2-4 iniezioni di miscela colorante calcio AM, separati nello spazio da circa 200-300 micron. Questo approccio caricamento di massa di iniezioni leggermente sovrapposte assicura che un'area grande come 600 x 600 micron è adeguatamente macchiato per l'imaging di calcio. Iniziare l'imaging 1 ora dopo l'iniezione della miscela AM colorante, per consentire la tintura di diffondere e di essere ripreso da neuroni.
   
   
5. Eseguire in vivo a due fotoni di imaging con una misura microscopio a due fotoni con un Ti-Sapphire Chameleon Laser (sintonizzati su 800-880 nm) e di Cambridge specchi galvanometro Technology. Noi acquisire immagini con il software scanimage sviluppato nel laboratorio di Karel Svoboda (Pologruto et al., 2003). Potenza del laser è in genere ben inferiore a 70 mW a campione. Immagini intero campo vengono acquisiti sia mediante un 20X (0,95 NA) o 40X (0,8 NA) obiettivi Olympus, a 1,95-15,63 fotogrammi al secondo (512 x 256 pixel a 256 x 64 pixel). Scansioni linea vengono acquisiti a 500 Hz. Durante l'imaging, gli animali sono tenuti sotto la luce anestesia isoflurano (0,6-0,9%), e sono anche tenuti a 37 ° C utilizzando un dispositivo di controllo della temperatura di Harvard Apparatus. Si ha cura di tenere il ritmo respiratorio di animali più vicino a 100 respiri / minuto possibile. Questo livello di utilizzo dell'anestesia è il più basso livello che immobilizza l'animale, ma permette comunque l'attività spontanea da registrare.

Discussion

Il vantaggio di questo metodo rispetto registrazioni elettrofisiologiche è che è meno invasivo e permette le registrazioni di attività nel fitto reti neuronali neuronali. Nel fare questa procedura s importante ricordarsi di prendere la massima cura quando si esegue la craniotomia non danneggiare la dura. Anche una piccola quantità di sanguinamento subdurale con molto oscuro l'imaging.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Oregon Green BAPTA1-AM	Reagent	Invitrogen	O-6807
Fluo 4- AM	Reagent	Invitrogen	F-14201
Sulforhodamine 101	Reagent	Invitrogen	S-359
Pluronic F-127 in DMSO	Reagent	Invitrogen	P-3000MP
Centrifugal Filter (0.45 micron)	Reagent	EMD Millipore	UFC3 0HV 0S