Name: 동시에 바이러스 특정 CD8 + T 세포 바이러스에 감염된 세포를 시각화하는 기술 현장에서 /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 47 s
Description: 배우세요 ISTH 기술을 사용하여 바이러스 특정 CD8+ T 세포와 감염된 세포의 공간적 관계를 시각화하는 방법을. 이 면역학 기법은 조직 내 면역 반응을 정량적으로 분석하여 감염 결과를 예측하는 데 활용됩니다.

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우리는 실버 곡물의 이미지를 캡처하는 공촛점 현미경을 설정하는 도움 J. 셋지위크 감사, 연구 자료 부여를위한 국립 센터, NIH 연구 기금 AI48484 (링), AI20048 (RA), 그리고 AI066314 (CJM)에 의해 부분적으로 지원. RR00169 (CNPRC, 캘리포니아 대학, 데이비스).

이 방법에 보고된 연구에 사용된 <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1726">리튬 외., 과학 323, 1726년부터 1729년까지 (2009)가</a> . 현장 tetramer의 얼룩과 현장 하이브리드화 (ISTH) 절차에 결합 ISTH 절차가 4 단계로 나눌 수 있습니다 항원에 특정한 CD8의 1) 인도 표준시의 얼룩 + 조직에서 T 세포 2) 바이러스에 감염된 - RNA + 세포를 감지하는 이쉬, 3) 인도 표준시 - 스테인드 세포와 바이러스 - RNA의 공촛점 현미경 이미징 + 셀, 4) 이미지 분석, 이미지 montages 건설과 tetramer + 및 바이러스 RNA + 세포의 매핑을 포함. 1. 항원에 특정한 CD8의 인도 표준시의 얼룩 + 조직 섹션에서 T 세포. <ol><li> vibratome 또는 메스를 사용하여 200 음 두께 섹션으로 신선한 조직을 잘라. </li><li> 칠 vibratome의 멸균 PBS - H와 함께 욕조와 0-2로 진정 ° C.는 다소 가파른 27 °로 vibratome 블레이드 각도를 설정합니다. 가능하면 조직이 저하를 최소화하기 위해 얼음에 차게 보관. 신선한 조직도가 차게되면 vibratome를 사용하여 섹션을하는 것이 더 쉽습니다. </li><li> 외과 가위 또는 0.25 cm 높이 조각으로 작은 약 0.5cm 너비로 메스와 조직을 잘라 버릴거야. 무게는 보트 또는 작은 접시에 조직 조각을 넣고 ° C 녹아 4퍼센트 PBS는 아가로 오스 녹지 낮은 버퍼 ~ 40 커버. 조직은 접시의 바닥과 접촉되어 있는지 확인하십시오. 그들은 부유하면 아래 조직 조각을 밀어. 얼음 고체화. 이것은 일반적으로 3~5분 걸립니다. </li><li> Loctite의 접착제로 코트 vibratome 조직 블록. 포셉를 사용하여 다음 메스와 함께 조직 주위 아가로 오스 컷 신중하게 접착제로 코팅 vibratome 차단하는 연약한 아가로 오스 임베디드 조직을 전송합니다. 그것이 조직 블록에 설정되면 조직의 조각을 이동하지 마십시오. 얼음 약 10 분 정도 건조 보자. </li><li> 마운트 조직 vibratome의 블록과 죽은 느린 전진 속도와 상대적으로 높은 진폭을 사용하여 200um 두께 섹션으로 조직을 잘라. 속도와 진폭 설정은 각 vibratome과 다를 수 있습니다. vibratome를 사용할 수없는, 또는 조직 sectioning vibratome 의무되지 않은 경우, 메스를 사용하여 얇은 스트립에 티슈를 잘라. </li><li> 냉장 PBS - H 1 ML을 포함하는 24 잘 조직 문화 판의 우물에 집합 조직 챔버에 페인트로 섹션을 전송합니다. 각 조직 챔버로 4 조직 섹션에 올려. 고무 밴드와 함께 접시에 실험 샘플 정보 및 보안 뚜껑과 조직 문화 접시의 뚜껑을 라벨. </li><li> 또는 vibratome 잘 넘어가지 마요 조직을 위해, 뱃속 같은 메스 또는 레이저 블레이드 가능 스트립처럼 얇은 절약하실 수 있습니다. 메스 컷 섹션에 대한 잘마다 하나의 섹션을 넣어. </li><li> 즉시 완료 후 절단 조직 염색법으로 진행합니다. 고정까지 항상 저하를 최소화하기 위해 냉장 섹션 보관하십시오. 섹션 밖으로 건조시키지 마십시오. 냉장 무균 PBS - H의 섹션을 유지. </li><li> 0.5 MG / ML FITC 복합 tetramers와 박 이상의 조직이 섹션을 품어. 마우스 또는 솔루션을 차단으로 1:200 희석이 부화에 세포 epitopes, 예를 들어 안티 CD8 항체에서 감독이 아닌 토끼 항체를 포함할 수 있습니다. 이 모든 후속 incubations에 대해 잘 당 1 ML 솔루션을 사용하고, 이것과 4 이후의 모든 incubations ° C 로킹 플랫폼에서 접시와 함께을 수행합니다. 잘 후속 단계에서 솔루션의 교차 오염을 방지하기 위해 비어있는 하나 이상의로 구분하여 여러 실험 샘플을 포함하는 조직 실 보관하십시오. </li><li> 기본 부화 후 20 분 각 냉장 PBS - H 회 (2X)로 섹션을 씻으십시오. 냉장 PBS - H를 포함하는 다른 24 잘 조직 배양 플레이트에 조직 회의소를 전송하여이 작업을 수행합니다. 한 실험 샘플에서 다른에 내용을 드립하지 않도록주의, 조직 회의소를 이동할 때. 모든 후속 incubations 및 세척을위한 유사하게 해당 솔루션을 포함하고 깨끗한 접시에 조직 챔버 스를 전송할 수 있습니다. 섹션은 조직 챔버의 측면에 집착하지 않도록하기 위해 절차를 수행하는 동안 조직 실에서 섹션을 모니터링합니다. </li><li> 신선한 PBS로 고정 섹션은 상온에서 2 시간 동안 4 % paraformaldehyde를 버퍼. 차가운 PBS - H 2X 5 분 각 씻으십시오. </li><li> 1-3일에 대한 솔루션을 차단에서 10000 : 토끼 방지 FITC 항체, 예를 들어 Biodesign1와 부화. 공동 라벨 들어,뿐만 아니라이 부화에 세포 epitopes에서 감독이 아닌 토끼 항체를 포함할 수 있습니다. 이 옵션을 들어, 필요한 경우 epitopes을 폭로하고 침투 사전 번째 배양하는 세포를 차단합니다. </li><li> 사용하는 항체가 포름 알데히드 고정에서 항원 검색을 필요로 세포 epitopes에서 감독 경우, 전자렌지에 0.01M 요소로 끓고 3 회 10 초 때마다 epitopes을 폭로. 각 가열​​ 사이에 2 분 기다리십시오. 끓는 솔루션 우물의 부분을 강제 수있는 매우주의하십시오. 이런 문제가 발생하면, 페인트 브러쉬를 사용하여조직 챔버의 측면에서 섹션을 추진하거나 다시 적절한 조직 챔버의 바닥에 접시의 뚜껑에서. 항체가 필요하지 않으면 항원 검색이 단계를 생략하십시오. </li><li> 이전 두 번째 부화하는 세포 epitopes에서 감독 항체를 사용 permeabolize 및 PBS - H 한 시간 트리톤 X - 100과 2퍼센트 정상 염소 혈청 0.3 %를 포함과 함께 조직 부분에서 세포를 차단하십시오. 그렇다면 0.3 % 트리톤 X - 100 2% 정상 염소 혈청을 포함하는 PBS - H에 남아 항체 incubations을 수행합니다. </li><li> 둘째 부화 후 몇 시간 20 분 동안 PBS - H의 섹션을 씻으십시오. 세 세척 총 두 번 반복합니다. 적절한 찬란 분류 항체와 최종 부화를 수행합니다. 예를 들어, 염소 방지 - 토끼 Cy3와 염소 방지 마우스 알렉사 488이 솔루션을 차단에 1:1000 각 희석. 1-3일위한 부화. 빛을 꺼버리는의 fluorophores으로 이후이 부화하는 동안 주석 박에있는 접시를 포장하고하여 빛으로부터 보호 구역 보관하십시오. </li><li> 몇 시간 20 분 동안 PBS - H의 섹션을 씻으십시오. 세 세척 총 두 번 반복합니다. </li><li> 이쉬 후 수정 섹션 장소에 안전 tetramers 및 항체 1 시간 동안 4 % paraformaldehyde에 포스트 수정과 함께 인도 표준시 들어, 다음에 다시와 마운트 PBS - H와 섹션을 씻어. </li><li> 현미경 슬라이드에 섹션을 전송하는 페인트를 사용하십시오. 글리세롤 / 젤라틴이 포함된 4mg/ml N - 프로필 gallate 또는 coverslip와 형광단의 방부제 및 커버를 포함하는 다른 실장 매체와 문장의 각 섹션을 참조하십시오. 스토어 -20 °에서 조명의 보호 슬라이드 컨테이너에 슬라이드. 조직 문화 접시를 씻어 알코올로 피부에 라벨을 제거합니다. 접시를 재사 용할 수 있습니다. </li><li> 공촛점 현미경으로 스테인드 조직 섹션을 분석합니다. 다음 이쉬을 진행할 수 있습니다. </li></ol> 2. 현장 하이브 리다이 제이션에 의해 바이러스에 감염된 - RNA + 세포를 감지합니다. 현장 하이브리드화 프로토콜이 다음과 같이 4,5의 이전에 게시된 프로토콜에서 바뀌었습니다 : <ol><li> 현장 tetramer 자국이 섹션의 두께에서 다시 절단 5-8 마이크론 두께 - sectionss. <ol><li> 200 마이크론 두께 - 섹션은 ° C 5 분 슬라이드에서 섹션을 분리하기 위해 70 가열됩니다. </li><li> 섹션 다음 드라이 아이스에 대한 OCT에 모두 담겨있다. </li><li> 8 미크론 섹션은 두께 섹션에서 그라 이오 스탯로 잘라 슬라이드 silanized을 준수하고 있습니다. </li><li> 슬라이드는 ° C 이후의 밀폐된 상자에 원위치 하이브리드화에서 -80에 저장할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 원위치 하이브리드화에서 <ol><li> 90 % 에탄올과 DEPC - 처리된 물에 3 분, 각 슬라이드를 immersing하여 조직 섹션을 Rehydrate. </li><li> ° C 물 목욕 15 분 98시 10mM 구연 산염 버퍼 (산도 6.0)에 가열하여 조직 섹션을 Permeabilize. </li><li> 20-30 분 실온에서 시원한 조직 섹션. </li><li> 3 분위한 DEPC - 처리된 물에 두 번 씻으십시오. </li><li> 10 분 0.1 M 차 (triethanolamine, pH8.0)에 0.25 % 아세트산 무수물에서 슬라이드를 immersing하여 조직 섹션을 Acetylate. </li><li> 5 분 0.1 M 차 (pH8.0)에 슬라이드를 전송합니다. </li><li> 섹션 35 S - 표시 바이러스 특정 안티 센스 탐침 또는 감각 (HIV - 1에 대한 부정적인 제어, SIV), 또는 35 S - 표시 LCMV의 riboprobes (풀링 감각과 안티 센스) (예 : HIV - 1, SIV와 같은).을 잡종 </li><li> 42 밤새 하이브리드화 후 5 분 2xSSC와 두 섹션을 씻어 ° C. </li><li> 5 분 인트에 섹션 (0.5 M NaCL, 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 20 MM 트리스 - HCL, pH를 7.5) 씻으십시오. </li><li> 30 분 37 RNases 인트 A와 T1 ° C로 섹션을 다이제스트 </li><li> 2X SSC의 섹션 플러스 5 분 50 % 포름 아미드 씻으십시오. </li><li> 1X SSC 10 분에 섹션을 씻으십시오. </li><li> 0.5 X SSC 15 분 섹션을 씻으십시오. </li><li> 70 섹션, 80 및 0.3 M의 암모늄 아세테이트, 각 5 분을 포함하는 100 % 에탄올을 탈수. </li><li> 핵 트랙 에멀젼과 함께 코트 섹션 </li><li> 1 시간 동안 어두운 방에서 건조. </li><li> 4 섹션을 노출 ° C 11일 (SIV)와 3 일 (LCMV)에 대한. </li><li> 3 분 (코닥, 고양이 # 146 4,593) D19에 섹션을 개발 dH2O 30 초 세척, 4 분 (코닥, 고양이 # 146 4106) 신속한 해결사에서 해결, dH2O 5 분 × 3 회 씻는다. </li><li> 70 %, 80 % 절대 에탄올, 5 분 각 탈수. </li><li> 형광 호환 Permount 매체에 마운트 슬라이드. </li></ol></li></ol> 3. 공촛점 현미경 이미지를 수집. <ol><li> 바이오 - 래드 MRC 1000 공촛점 현미경, 또는 Epi2 - 블루 반사 장치와 다른 공촛점 현미경으로 ISTH 이미지를 캡처합니다. </li><li> (LCMV 용) 붉은 tetramer fluorochrome, 더 그린 CD8 fluorochrome에 대한 Epi2 - 522 DF32, 그리고 은색 곡물에 대한 Epi2 - 블루 리플렉션 (개발 radioautographs에 이쉬 신호) 20x에서 (SIV) 또는 60x에 대한 Epi1 - 605을 사용하여 </li><li> 순차적으로 각 필드의 세 채널에서 1 마이크론 간격으로 Z - 시리얼 이미지를 수집합니다. </li><li> 왼쪽에서 각 섹션에서 이미지를 획득엑셀 파일에 해당 행 및 열에 따라 오른쪽과 아래쪽 맨, 이름과 각 이미지. </li><li> 복원 몬티지 이미지의 격차를 방지하기 위해 이웃 이미지와 함께 ~ 20 %의 중복 각 이미지를 캡처합니다. </li></ol> 4. 이미지 분석 : 몽타주 이미지 재건, 세포 중심 계산 및 공간적 분석. <ol><li> 공촛점 길잡이 (버전 4.02.) 각 채널에 대해 하나의 이미지로 프로젝트 Z - 시리얼 이미지. </li><li> 자동으로 포토샵 7.0 작업 절차를 사용하여 하나의 RGB 이미지로 3 채널의 예상 이미지를 병합합니다. </li><li> 포토샵 7.0에서 레이어에 함께 병합된 이미지를 바느질하여 몽타주 이미지를 생성합니다. </li><li> 연결 개별 실버 입자와 tetramer는 세포와 얼룩, 그리고 X를 지정, Y는 MetaMorph (버전 7.1.3.) 또는 포토샵을 (저자에서 제공)를 사용하여, SIV RNA +와 tetramer + 세포의 센터 (centroids)의 좌표 </li><li> 각 셀에 대해 숫자 숫자로 Excel 파일에 중심 데이터를 내보냅니다. E : T 비율이 섹션의 tetramer의 총 숫자 +와 바이러스 RNA + 세포에서 Excel 파일에서 결정됩니다. </li></ol> 빨간색과 파란색 tetramer + SIV RNA 사이의 공간적 관계 + 세포는 포토샵 문서에 엑셀 파일에서 각각의 플롯을 복사 및 붙여넣기에 의해 캡처됩니다. 그들이 색상을 선택하고 복사와 푸른 RNA + 세포의 위치 새 레이어에 붙여넣기, 일치 있도록 그리드를 정렬하고 확장할 수있는 레이어의 불투명도 후 그리드를 정렬하는 데 사용 폐기 레이어의 위치를​​ 감소 후 tetramer의 +와 바이러스 RNA의 + 세포는 평평 이미지에 공개됩니다. 5. 추가 정보 감염 조직을 절단하는 경우 : BSL2.5 연구소에서 작동합니다. 면도날과 특별한 예방 조치를 가져가라. 포셉로 vibratome 블레이드 마운트에 면도칼을 넣어. 당신이 집게로 칼날을 세울 수 없을 경우에는 목욕에 조직을 추가하기 전에 그것을 넣어 칼날을 교체하지 않습니다. 완료 절단 때 집게와 블레이드를 제거합니다. 사전 제거 70 % EtOH 또는 DMQ로 스프레이 블레이드. 언제나처럼, 샵스 컨테이너에 블레이드 처분. 외부 장갑을 변경 또는 조직이나 탱크에 오염된 PBS 각 연락 후 살균제에 린스. 완료되면, 전염성 물질과 함께 일하고있다면, 탱크에 PBS로 DMQ의 살균제를 추가하고 제거하기 전에 몇 분 앉아 보자. 하수구 소독 PBS의 배출. 그런 다음 소금과 살균제를 제거하는 물 탱크를 씻어. DMQ로 클린 작업 공간 및 주방기구. 물을 식기를 씻어. biotinylated MHC 단량체에서 tetramers을 만들려면 : 나 같은 분자 biotinylated MHC 클래스를 구하는 HLA - A * 0201 / B 2m / 중 개그 (SLYNTVATL) 베크맨 쿨터에서 폴 (ILKEPVHGV) 또는없는 마트 펩타이드 (ELAGIGILTV) 펩티드와 펩티드 분자 생산. Biotinylated HLA - A * 중 개그 (KIRLRPGGK) 또는 NIAID tetramer 시설에서 NEF (QVPLRPMTYK)와 생산된 0301 / B 2m / 펩티드 분자. Tetramers이 분류 FITC 6 aliquots를 추가하여 생성됩니다 biotinylated Mamu에 ExtraAvidin (시그마) * 01 / B 2m / 4.5:1의 마지막 어금니 비율 8 시간 코스 이상의 펩타이드 단량체. Extravidin 추가 뒤에 근거 천천히 초기 시간 지점 동안 Extravidin의 모든 바운드 네 가지 비오틴 사이트를 얻을 수 추가한 보장 모노머의 넘쳐나는있다는 것입니다. ExtrAvidin가 바운드 모든 4 사이트를하지 않을 가능성이 덜 모노머 왼쪽보다가 있기 때문에 나중에 반응으로,이 과정은 덜 효율적이다. 한번에 ExtrAvidin 모두를 추가한 경우 반응은 덜 효율적인 것입니다 더 Extravidin 분자는 2 또는 3 단량체가 첨부된 것이다.

<ol><li>Altman, J. D., Moss, P. A. H., Goulder, P. J. R., Barouch, D. H., McHeyzer-Williams, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274, 94-96 (1996).</li>
<li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+Edge%3A+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting Edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> Journal of Immunology. 165, 617-61 (2000).</li>
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<li>Li, Q., Duan, L., Estes, J. D., Ma, Z. M., Rourke, T., Wang, Y., Reilly, C., Carlis, J., Miller, C. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peak+SIV+replication+in+resting+memory+CD4+T+cells+depletes+gut+lamina+propria+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Peak SIV replication in resting memory CD4 T cells depletes gut lamina propria CD4 T cells.</a> Nature. 434, 1148-1152 (2005).</li>
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</ol>

저자들은 공개할 이해관계가 없음을 밝힙니다.

바이러스 RNA는이 보고서에서 바이러스에 감염된 세포에 대한 표지로 사용되기 때문에, 하이브리드화하기 전에 모든 시약은 RNAase 무료로해야합니다. 현장 하이브 리다이 제이션 절차는 여기에 설명된은 현장 tetramer의 얼룩에의 형광 신호를 보존하기 위해 수정되었습니다. 현장 하이브 리다이 제이션에 의해 감지된 바이러스에 감염된 세포에서 radioautographic 신호가 한 셀 직경 약의 깊이에 있기 때문에 현장 tetramer의 얼룩에 사용되는 두께 섹션 5 - 8 - 미크론 두께 섹션으로 recut해야합니다. 현장 tetramers 및 현장 하이브리드화 (ISTH)의 결합이 소설 기법은 바이러스에 특정한 CD8 + T 세포와 바이러스 감염 대상 세포의 공간적 관계의 동시 시각화, 매핑 및 분석을 가능하게 여기에서 설명한. 이 방법은 CD8 + T 세포 기반 백신을 평가 적용 및 기타 비 바이러스 병원체 및 호스트 상호 작용 인치 수 있습니다 이미지 분석 방법은 여기에서 설명한 것이 아니라 원래의 장소에 상호 작용하는 두 세포 인구의 공간적 관계를 연구 적용할 수 있습니다, 우리는 최근 유인원 면역 결핍의 nonhuman 영장류 모델에서 HIV - 1 성적 전송의 공부의 중심 매핑 절차를 사용하는 예 붉은 털원숭이의 바이러스 감염 6 원숭이

솔루션 및 시약 : <ul><li> PBS - H 인산이 RNASes을 억제하기 위해 호수가 포함된 헤파린을 (100ug/ml 또는 18.7U/ml) 버퍼 </li><li> 헤파린이 포함된 RPMI 조직 문화 미디어 (100ug/ml 또는 18.7U/ml) RNASes을 억제하기 위해 </li><li> 4퍼센트 PBS에서 낮은 용해 아가로 오스 </li><li> PBS 2% 정상 염소 혈청 (또는 형광단 복합 항체가 만들어진하는 종 혈청). </li><li> PBS 2% 정상 염소 혈청과 0.3 % 트리톤 X - 100 </li><li> MHC 클래스 I은 FITC에 복합 tetramers </li><li> 방지 FITC 항체, 예를 들어 BioDesign 토끼 방지 FITC </li><li> 매우 여러 레이블, 예를 들어 염소 - 안티 - 토끼 Cy3와 함께 사용하기위한 다른 종의 IgG에 adsorbed 교차되었습니다 형광단 복합 안티 - 토끼 IgG </li><li> 매우 여러 라벨와 함께 사용하기위한 다른 종의 IgG에 adsorbed 교차되었습니다 형광단 복합 안티 - 마우스 IgG </li><li> 신선한 PBS는 4 % paraformaldehyde를 버퍼 </li><li> 0.01M 요소 </li><li> 글리세롤 / 젤라틴이 포함된 4mg/ml N - 프로필 gallate </li></ul> 특수 장비 <ul><li> Vibratome </li><li> 외과용 메스 </li><li> 면도날 </li><li> 외과 가위 </li><li> Loctite 빠른 설정 인스턴트 접착제 (제품 # 46551) </li><li> 집게 </li><li> # 2 낙타의 머리 페인트 붓. 원하는 두께 면도날과 트림 수 </li><li> 24 잘 평면 바닥 조직 배양 플레이트 예 팰컨 카탈로그 # 353226 </li><li> 조직 챔버스 </li><li> 틴 호일 </li><li> 판지 슬라이드 폴더 예 : 피셔 카탈로그 # 12-587-10 </li><li> 공촛점 현미경 </li></ul> 인도 표준시의 시약 빠른 참조 할 PBS - H (인산 헤파린과 생리 버퍼) <ul><li> 450 ML 1X PBS </li><li> 50 ML 1X PBS + 10X 헤파린 </li></ul> 1X PBS + 10X 헤파린 <ul><li> 500 ML 1X PBS </li><li> 500 MG 헤파린 분말 (건조 화학 스토리지 선반에있는) </li></ul> PBS - H / 2 % NGS (정상 염소 혈청) <ul><li> 49 ML 팔콘 튜브 PBS - H </li><li> 1 ML의 NGS (-20 냉장고 1 ML의 aliquots에서 발견) </li></ul> PBS - H / 2 % NGS / 0.3 % 트리톤 X - 100 <ul><li> 팔콘 튜브 49 ML PBS - H / 0.3 % 트리톤 X - 100 </li><li> 1 ML의 NGS (-20 냉장고 1 ML의 aliquots에서 발견) </li></ul> PBS - H / 0.3 % 트리톤 X - 100 <ul><li> 500 ML PBS - H </li><li> 1.5 ML 트리톤 X - 100 (이것은 건조 화학 스토리지 선반에있는 두꺼운 액체이다) </li></ul> 4퍼센트 LMP 아가로 오스 <ul><li> 2g LMP 아가로 오스 분말 </li><li> 50 ML PBS </li><li> 가루가 해소 때까지 혼합, 전자 레인지까지 흔들. </li></ul> GG - NPG (N - 프로필 galate과 젤라틴 글리세린 <ul><li> 녹기 50도 물을 욕조에서 글리세롤 젤라틴의 병을 플레이스 </li><li> 프로필 galate의 0.06 g을 (테리스 선반에있는) 추가, 잘 흔들 </li><li> 녹아 때까지 가끔 떨고, 물 목욕에 보관. </li><li> 1 ML 튜브 (갈색 튜브)로 나누어지는 </li></ul> 4 % paraformaldehyde <ul><li> 4g의 paraformaldehyde 분말 (건조 화학 스토리지 선반에있는) </li><li> ML 눈금 실린더에 PBS - H는 PF 분말을 추가 약 10 올려 </li><li> 볼륨이 약 70 ML에 도달할 때까지 물을 추가 </li><li> NaOH 중 하나 스포이트를 추가합니다. </li><li> (일반적으로 약 20-30분) 해산까지 저어 </li><li> 산도가 7-8 사이에 도달할 때까지 HCL을 추가합니다. </li><li> 물 100 ML에 볼륨을 가져와. </li></ul> 우레아 0.01 M <ul><li> 0.3 g 요소 (건조 화학 스토리지 선반에있는) </li><li> 500 ML 물 </li></ul>

동시에 바이러스 특정 cd8 + t 세포 바이러스에 감염된 세포를 시각화하는 기술 현장에서</em

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

의 숫자와 위치 바이러스 특정 CD8 + 세포들은 감염 대상의 번호와 위치에 상대적인 T 세포가 통관에서 만성 감염 영구 해당 범위의 결과를 결정하는 중요한 것으로 생각됩니다. 우리는 여기서 면역 효과기 (E) 바이러스에 특정한 CD8 + 바이러스에 특정한 CD8 + T 세포를 감지하는 현장 tetramer (인도 표준시) 얼룩에 결합하여 T 세포 감염 대상 (T)이 및 현장 사이의 공간과 양적 관계를 평가하는 방법을 설명 면역 방어 및 감염 사이의 전투가 이루어지는 조직에서 바이러스 - RNA + 세포를 감지하는 하이브 리다이 제이션 (봐야죠). T 비율 : 인도 표준시의 얼룩과 이쉬, 약식 ISTH의 조합이 면역 효과기 세포와 목표, 그리고 E의 손쉬운 결정의 위치의 시각화 및 매핑이 가능합니다. 차례로 이러한 매개 변수는 다음 공간적 근접 사이의 관계를 결정하는 데 사용하고, 초기 감염의 결과를 예측하는 면역 반응의 타이밍과 규모. 수 있습니다

현장 tetramer의 얼룩과 현장 하이브리드화 (ISTH)의 결합 기술은 시각화, 매핑 및 분석들은 바이러스에 감염된 대상으로 바이러스에 특정한 CD8 + T 세포의 공간적 근접의 이러한 면역 effectors와 대상 사이의 양적 관계의 결정을 가능하게 감염 결과 수 있습니다.

동시에 바이러스 특정 CD8 + T 세포 바이러스에 감염된 세포를 시각화하는 기술 현장에서</em

감염된 표적 세포의 수 및 위치 대비 바이러스 특이적 CD8+ T 세포의 수와 위치는 바이러스 제거부터 만성 지속 감염에 이르는 결과 결정에 결정적인 역할을 하는 것으로 생각됩니다. 본 논문에서는 면역 방어와 감염 사이의 상호작용이 일어나는 조직 내에서 바이러스 특이적 CD8+ T 세포를 검출하는 인시투 테트라머(in situ tetramer, IST) 염색과 바이러스-RNA+ 세포를 검출하는 인시투 하이브리드 형성(in situ hybridization, ISH)을 결합하여, 면역 작동 세포(E)인 바이러스 특이적 CD8+ T 세포와 감염된 표적 세포(T) 간의 공간적 및 정량적 관계를 평가하는 방법을 설명합니다. IST 염색과 ISH를 결합한 ISTH 기법을 통해 면역 작동 세포와 표적 세포의 위치를 시각화 및 매핑하고 E:T 비율을 용이하게 결정할 수 있습니다. 이러한 파라미터는 결과적으로 공간적 근접성과 면역 반응의 시점 및 규모 사이의 관계를 규명하는 데 사용되어, 초기 감염의 경과를 예측할 수 있게 합니다.

ISTH라고 알려진 기술로 인시튜 하이브리다이제이션(in situ hybridization)과 테트라 염색(tetra staining)을 결합함으로써, 바이러스 항원 특이적 면역 작동 세포와 바이러스에 감염된 세포 및 조직 간의 상대적 수와 공간적 관계를 결정할 수 있습니다. ISTH는 신선한 SIV 감염 조직을 agros에 매몰하는 것으로 시작합니다. 조직은 vibrato를 사용하여 200 micron 두께의 절편으로 절단하며, 바이러스 항원에 대해 염색합니다.FITC 표지 MHC 테트라머를 사용하여 특정 CD8 양성 세포를 염색합니다. 동결 후, 이 염색 섹션들을 크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 8 µm 두께의 섹션으로 추가 절단하고, 인시튜 하이브리다이제이션(in situ hybridization)을 수행하여 바이러스에 감염된 세포의 위치를 확인합니다. 공초점 현미경을 사용하여 이중 염색 섹션의 이미지를 획득하고, 최종적으로 원래의 두꺼운 섹션을 재구성함으로써 면역 작동 세포와 표적 세포 간의 관계를 밝힙니다.SIV 초기 감염을 조사하기 위해 이 절차를 사용하는 것은 이후 발생하는 질병의 중증도를 예측하는 좋은 방법임이 입증되었습니다. 안녕하세요, 미네소타 대학교 미생물학과의 Ashley HA 교수 연구실 소속 Chinen Lee입니다. 안녕하세요, 미네소타 대학교 수의 생명과학과의 조교수 Pam Skinner입니다.오늘은 인시튜 테트라머 염색과 인시튜 하이브리다이제이션을 결합한 ISTH 과정에 대해 보여드리겠습니다. 오늘 시연하는 인시튜 테트라머 염색과 인시튜 하이브리다이제이션의 조합 외에도, 저희는 항원 특이적 CD8 T 세포의 위치, 풍부도 및 단백질 발현 프로파일을 인시튜에서 결정하기 위해 인시튜 테트라머 염색과 면역조직화학 염색을 결합하여 일상적으로 사용하고 있습니다. 오늘 두꺼운 절편을 이용한 인시튜 테트라머 염색을 도와주실 분들은 Heon Kim 박사와 Terry Matala이며, 얇은 절편 준비와 인시튜 하이브리다이제이션을 도와주실 분은 So입니다. 그럼 시작하겠습니다.이 절차를 시작하려면, 멸균된 PBSH가 담긴 Vibram bath를 2°C까지 냉각하십시오. 진동 블레이드 각도를 27도로 설정하십시오. 가능한 경우, 신선한 조직은 얼음 위에서 냉각 상태로 유지하고 조직 수확 후 24시간 이내에 절차를 시작하십시오.냉각으로 인한 분해를 최소화하기 위해, 진동기(vibram)를 사용하여 신선한 조직을 절단하고, 결합 조직을 다듬어낸 뒤 메스로 검체를 작은 조각으로 자릅니다. 이 조각들을 웨이 보트(whey boat)에 넣고, 약 40°C에서 녹인 PBS 내 4% low melt agarose로 덮습니다. 조직이 디시 바닥에 접촉해 있는지 확인하고, 조직 조각이 떠 있다면 아래로 눌러준 뒤 얼음 위에서 3~5분간 응고시킵니다.여기서는 비장 조직을 사용하고 있지만, 메스를 사용하여 림프절, 질, 자궁경부, 자궁 또는 다른 신선한 조직을 사용할 수도 있습니다. 조직 주변의 아가로스(agros)를 절단하고, 핀셋을 사용하여 아가로스에 매립된 조직을 조직 블록으로 조심스럽게 옮깁니다. 이어서 Vibram 조직 블록에 Loctite 접착제를 도포합니다.조직 조각을 조직 블록에 고정시킨 후에는 움직이지 마십시오. 얼음 위에서 약 10분 동안 건조시킵니다. 다음으로, 조직 블록을 진동 절편기(vibrator)에 장착하고 매우 느린 전진 속도와 상대적으로 높은 진폭을 사용하여 조직을 200 µm 두께의 절편으로 자릅니다.붓을 사용하여 절단된 조직 절편을 1 mL의 냉각된 PBSH가 미리 채워진 24웰 조직 배양 플레이트의 웰에 설치된 전용 조직 챔버로 옮깁니다. 각 조직 챔버에 최대 4개의 조직 절편을 넣습니다. 바이러스 특이적 T 세포를 염색하기 위해 샘플에 라벨을 붙이고 고무줄로 플레이트의 뚜껑을 고정합니다.ZI 결합 테트라머를 먼저 블로킹 버퍼에 희석하여 0.5 micrograms per milliliter 농도로 만듭니다. 이 용액을 24웰 플레이트에 웰당 1 milliliter씩 피펫으로 분주합니다. 갓 절단한 조직을 플레이트의 조직 챔버로 옮긴 후 4 degrees Celsius에서 하룻밤 동안 쉐이킹하며 반응시킵니다.후속 단계에서 용액의 교차 오염을 방지하기 위해 서로 다른 샘플을 포함하는 조직 챔버 사이에 빈 웰을 하나 둡니다. 이 단계에서 세포 외 또는 세포 표면 단백질을 표적으로 하는 항체를 추가할 수 있습니다. 세척을 위해, 1차 배양 후 사용할 차가운 PBSH가 담긴 24웰 조직 배양 플레이트를 준비합니다.조직 챔버를 미리 채워둔 플레이트로 옮겨 각 20분씩 두 번 세척하며, 옮기기 전에 조직 챔버에서 액체를 최대한 배출하십시오. 또한, 조직 챔버를 이동할 때 한 샘플의 내용물이 다른 샘플로 떨어지지 않도록 주의하고, 조직 챔버 내의 절편이 벽면에 달라붙지 않는지 확인하십시오. 고정 후에는 PBS에 희석된 신선한 4% paraldehyde를 사용하여 상온에서 2시간 동안 절편을 고정하십시오.테트라머의 신호를 증폭시키기 위해 차가운 PBSH로 5분씩 두 번 세척합니다. 블로킹 버퍼 내에서 1:10,000의 비율로 rabbit anti fitzy 항체를 처리하여 절편을 1~3일 동안 배양합니다. 이 단계에서 세포 내 에피토프에 대한 항체를 추가할 수 있습니다.항체를 첨가하기 전에 세포를 투과화하고 비특이적 결합 부위를 차단해야 합니다. 신호를 증폭하기 위한 두 번째 장시간 배양 후에 항원 회복 과정이 필요할 수도 있습니다. 각 세션마다 PBSH로 절편을 최소 20분에서 최대 수 시간 동안 3회 세척하십시오.적절한 형광 표지 항체를 사용하여 최종 배양을 수행합니다. 예를 들어, rabbit anti fitzy 항체에 결합하여 테트라머 염색 세포가 적색 형광을 띠게 하려면 goat anti rabbit SI three를 사용할 수 있습니다. 킬러 T 세포를 시각화하기 위해 CD eight와 같은 관심 단백질을 대조 염색하는 데 마우스 항체를 사용했다면, goat anti-US Alexa 488를 사용하여 마우스 항체에 결합시킴으로써 항체 염색 세포가 녹색 형광을 띠게 할 수 있습니다. 각 항체의 희석 배수는 실험적으로 결정해야 합니다.1~3일 동안 배양하며, 빛이 형광을 소멸시키므로 배양 중 및 그 이후에도 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸 섹션이 빛에 노출되지 않도록 보호하십시오. 마지막으로 섹션을 다시 고정하여 테트라머와 항체가 제자리에 고정되도록 합니다. 세척 후 4 mg/mL의 N-propyl gallate가 포함된 글리세롤 젤라틴을 사용하여 현미경 슬라이드에 마운팅하고, in-situ hybridization을 위한 박절 단면을 준비할 때까지 -20 °C에서 보관하십시오.이제 공초점 현미경을 통해 in situ tetramer 염색 절편을 분석하여 항원 특이적 CD8+ T 세포의 국소적 분포, 풍부도 및 단백질 발현 패턴을 결정할 수 있습니다. 제시된 이미지에서는 SIV에 감염된 rhesus macaque의 비장 조직 절편을 gag tetramer로 염색하여 SIV 특이적 CD8+ T 세포를 표지하였으며, CD20 항체와 CD3 항체로 대조 염색하였습니다. 항체를 이용한 대조 염색 결과는 다음 단계에서 소실되므로, 다음 단계로 진행하기 전에 in situ tetramer 분석을 수행하는 것이 중요합니다.슬라이드에서 두꺼운 절편을 떼어내기 위해 200 µm 두께의 절편을 히트 블록에서 70 °C로 5분 동안 가열하여 박절 절차를 시작합니다. 절편이 분리되면, 먼저 플라스틱 몰드 바닥에 OCT를 채운 후 드라이아이스 위에서 OCT에 절편을 포매합니다. 그다지 조직을 OCT 위에 놓고 다시 OCT로 덮어줍니다.크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 OCT에 매립된 시료로부터 8 µm 두께의 절편을 제작하고, 이 8 µm 절편을 실로나이즈드 슬라이드(siloized slides)에 부착합니다. 이후 슬라이드는 밀폐 용기에 담아 -80 °C에서 보관하여 추후 in situ hybridization을 수행할 수 있습니다. S 35로 표지된 바이러스 특이적 리보 프로브(rib probes)를 이용한 표준 in situ hybridization법으로 바이러스 감염 세포를 검출합니다.이 절차에는 핵 트랙 에멀젼(nuclear track emulsion) 코팅 및 슬라이드 마운팅 과정이 포함됩니다. 형광 호환 파라마운트 매질(paramount medium) 내에서, 에피 튜브 블루 반사 장치가 장착된 BioRad MRC 1000 공초점 현미경을 사용하여 공초점 이미지를 획득합니다. 인시투 테트라 염색(insitu tetra staining)의 경우, 적색 테트라 형광색소에는 EPI one 605를, 인시투 하이브리다이제이션(insitu hybridization)의 녹색 CD8 형광색소에는 EPI 2 522 DF 32를 사용하여 시각화합니다.현상된 방사선 사진에서 인시츄 하이브리다이제이션(in-situ hybridization) 신호로 인해 생성된 은 입자를 관찰하기 위해 EPI two blue reflection을 사용하십시오. 이미지 획득을 시작하려면, 각 섹션의 이미지를 왼쪽에서 오른쪽으로, 위에서 아래로 순서대로 획득하고, 각 이미지가 인접한 이미지와 약 20% 중첩되도록 캡처하십시오. 재구성된 몽타주 이미지에 빈틈이 생기는 것을 방지하기 위해, Excel 파일에 각 이미지의 행과 열에 따라 이름을 지정하십시오.슬라이드의 데이터 수집이 완료되면, 저자로부터 제공받은 Photoshop 7 액션 절차를 통해 공초점 어시스턴트 소프트웨어를 사용하여 각 채널의 Z-시리즈 이미지를 단일 이미지로 투영하고, 세 채널의 투영된 이미지를 하나의 RGB 이미지로 자동 병합하십시오. 그다음, 병합된 이미지들을 레이어별로 스티칭하여 전체 섹션의 몽타주 이미지를 생성하십시오. Metamorph 또는 Photoshop을 사용하여 몽타주 내의 개별 은 입자와 테트라머 염색물을 세포와 연관시키십시오.바이러스 RNA 양성 및 테트라머 양성 세포의 중심점 XY 좌표 또는 OID를 할당합니다. OID 데이터를 각 세포에 대한 숫자 형태로 Excel 파일로 내보내고, Excel 파일에 수집된 데이터를 사용하여 섹션 내의 전체 테트라머 양성 및 바이러스 RNA 양성 세포 수로부터 면역 작동 세포(e 세포) 대 바이러스 표적(T 세포)의 비율을 결정하여 테트라머 양성 세포와 RNA 양성 세포 사이의 공간적 관계를 파악합니다. Excel 파일에서 각각의 플롯을 복사하여 Photoshop 문서에 붙여넣습니다.레이어의 불투명도를 낮추어 격자를 정렬하고 크기를 조정하여 색상이 일치하도록 한 뒤, 선택하여 새 레이어에 복사하고 붙여넣습니다. 파란색 RNA 양성 세포의 위치를 확인한 후 격자 정렬에 사용한 레이어를 삭제하면, 평탄화된 이미지에서 테트라머 양성 세포와 바이러스 RNA 양성 세포의 위치가 나타납니다. 여기에 제시된 ISTH 방법을 사용하여, 질 내 접종을 통한 진입 경로 및 감염이 확산되는 림프 조직에서의 SIV 감염에 대한 면역 반응을 추적할 수 있습니다.감염 후 10일째에 이 조직 부위에는 다수의 감염된 세포들이 존재하지만, 3일이 더 지난 시점에서도 녹색으로 염색된 CD A 양성 세포들은 관찰되는 반면, 적색으로 염색된 SIV 특이적 tetra 양성 세포들은 아직 나타나지 않았습니다. 따라서 면역 반응이 너무 늦어 감염을 제거하지 못하는 상태입니다.하지만 감염 3주 후에는 특히 유입 경로에서 감염된 세포의 감소가 뚜렷하게 관찰됩니다. 우리는 ISTH를 사용하여 이러한 감소 정도가 테트라머 양성 면역 작동 세포의 공간적 근접성 및 상대적 수와 상관관계가 있음을 보여주었습니다. N-S-I-V-R-N-A 양성 표적 세포, 우리는 이를 생체 내 E 대 T 비율이라고 부릅니다.이 방법을 통해 감염된 림프절 내의 이펙터 세포는 빨간색으로, 바이러스 표적 세포는 파란색으로 표시하여 공간적 관계를 쉽게 시각화할 수 있습니다. 많은 이펙터 세포와 표적 세포가 서로 근접해 있으며, 일부 영역에서는 많은 이펙터 세포가 단일 S-I-V-R-N-A 양성 세포를 둘러싸고 있는 반면, 다른 영역에서는 S-I-V-R-N-A 양성 세포가 단독으로 존재합니다. 세포의 위치를 결정하고 Excel 파일에 각각의 수를 기록하면 E:T 비율을 간단히 계산할 수 있습니다.바이러스 감염의 최적의 제어는 녹색 표적 대비 적색 작동 세포의 비율이 43:1로 크게 상회하는 것과 상관관계가 있습니다. 이 경우, 감염이 시작된 자궁경부와 질에서 E:T 비율은 림프절보다 낮았습니다. 높은 E:T 비율과 정점 대비 바이러스 수치 감소 사이의 양의 상관관계는 진입 지점에서의 더 강력한 면역 반응이 더 나은 감염 제어로 이어진다는 것을 나타냅니다.지금까지 in situ에서 매우 특이적인 CDAT 세포와 바이러스 감염 세포를 동시에 검출하는 방법을 보여드렸습니다. 이 기술을 통해 조직 내에서 항원 특이적 T 세포와 바이러스 감염 세포를 동시에 시각화할 수 있습니다. 본 절차를 수행함으로써 이 기술은 CD8+ T 세포 기반 백신 평가 및 기타 비백신 병원체와 숙주의 상호작용 연구에 적용될 수 있습니다.in situ 하이브리다이제이션을 수행하기 전, 모든 시약에 RNA가 포함되지 않도록 유지하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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연구

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Biology

생물학

이 시각 실험 라이브 공촛점 이미징 실험에 대한 HIV의 형광 분자 클론을 활용을위한 가이드입니다.

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이 프로토콜은 림프절의 조각에 소개 이미지 형광 T 세포 수있는 방법을 설명합니다. 이 기술은 전통적인 위드 형광 또는 공촛점 현미경과 T 세포의 마이 그 레이션의 실시간 분석을 수 있습니다.

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2. 핵 염색: 면역염색 후 핵을 대조 염색한다. PBST를 따라내고 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole) 또는 선택한 핵 염색제를 실온에서 1분 동안 처리한다. 슬라이드를 PBS로 실온에서 흔들어주며 10분 동안 2회 세척한다. Shah, R., 등바이러스 핵산 및 단백질 시각화와 HIV, HTLV, HBV, HCV, 지카 바이러스 및 인플루엔자 감염 모니터링을 위한 단일 세포 다중 형광 이미징. J. Vis. Exp. (2020)이 영상에서는 분지형 DNA 하이브리다이제이션과 면역형광법을 사용하여 감염된 인간 림프구 내의 HIV-1 DNA, RNA 및 캡시드 단백질을 동시에 시각화함으로써, 개별 세포 내에서 바이러스 복제 단계에 대한 상세한 분석이 가능함을 보여줍니다.

감염된 인간 림프구 내 바이러스 핵산 및 단백질의 다중 형광 이미징

이 비디오는 인간 폐 종양 절편 내에서 형광 결합 항체로 표지된 상주 종양 침투 CD8 T 세포의 이미징을 설명합니다. 이 기술을 사용하면 컨포칼 현미경을 사용하여 CD8 T 세포 이동을 실시간으로 분석할 수 있습니다.

컨포칼 현미경을 사용한 다양한 종양 영역에서의 상주 T 세포 이동에 대한 실시간 분석

이 동영상은 종양 조직에 침투하는 T 세포의 다양한 하위 집단을 분석하기 위한 현장 형광 다중 스펙트럼 이미징 기술을 보여줍니다. 신세포암 조직 동결절제술은 특이적 억제 수용체를 발현하고 면역요법 내성 표현형을 나타내는 CD8+ T 세포를 표지하는 항체로 처리됩니다. 표지된 섹션은 뚜렷한 CD8+ T 세포 하위 집단을 식별하기 위해 다중 스펙트럼 현미경을 사용하여 시각화됩니다.

면역요법 내성 T 세포 하위 집단을 분석하기 위한 다중방향 면역형광 이미징

이 비디오는 단순 포진 바이러스-1 감염에서 감염된 세포 단백질 0, ICP0 이동을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. Post-de novo synthesis, ICP0는 핵으로 전위되었다가 나중에 감염이 진행되는 동안 세포질로 이동합니다. 면역형광 현미경 검사는 단백질의 세포 내 국소화를 밝히고 분석하여 감염 단계 전반에 걸친 단백질의 이동에 대한 통찰력을 제공합니다.

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전 비보 인간의 폐 종양에 거주 CD8 T 림프 톨의 이미징 조각 사용 하 여 Confocal 현미경 검사 법

여기, 우리가 immunohistochemistry 지역화, 표현 형, 및 조직에서 항 원 특정 T 세포의 양을 결정 하에 현장에서 MHC tetramer 얼룩 결합 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 다른 세포 유형 및 조직 구조 항 원 특정 CD8 T 세포의 공간 및 phenotypic 특성을 결정 하는 데 사용 됩니다.

제자리에서 MHC tetramer 얼룩 및 정량 분석 위치, 풍부, 및 조직에서 항 원 특정 CD8 T 세포의 표현 형을

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배우세요 ISTH 기술을 사용하여 바이러스 특정 CD8+ T 세포와 감염된 세포의 공간적 관계를 시각화하는 방법을. 이 면역학 기법은 조직 내 면역 반응을 정량적으로 분석하여 감염 결과를 예측하는 데 활용됩니다.

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