트렌스 제닉 Zebrafish의 여러 가지 빛깔의 시간 저속 영상 : 타겟의 연결을 세포 절제에 의해 활성화 떠올리 망막 줄기 세포

형질전환 동물에서 형광 리포터의 발현은 살아있는 질병 모델에서 실험적 조작에 대한 세포 반응을 추적할 수 있게 합니다. 여기서, 선택적 세포 손실은 제브라 피쉬에서 약리학적으로 유도되며, 고해상도 다색 공단입니다. 표적 세포와 바로 직후의 이미지를 획득하며, 약물 치료 이미지 분석 후 간격을 두고 나타난 간격은 내인성 줄기세포 집단의 활성화와 회복 단계에서 표적 세포의 후속 교체를 보여줍니다.

이 방법은 다음과 같은 재생 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다: 신중한 세포 유형을 재생하는 데 사용되는 세포 및 분자 메커니즘은 무엇입니까?, 짝짓기에서 수집한 형질전환 난자를 수정 후 16시간에 0.3 x danio 용액이 포함된 페트리 접시로 옮기는 것으로 시작합니다. 관심 조직에서 색소 침착의 증거가 나타나기 전에 티로신 ACE 활성을 억제하기 위해 PTU를 추가합니다. 배아가 백색증이 아닌 경우 섭씨 28.5도에서 배아를 배양합니다.

기자가 확인되면 페트리 접시를 형광 스테레오 줌 현미경 아래에 놓고 원하는 형질전환 유전자 발현을 분류합니다. 이미징 전에. 배아 배지에 0.5% 저용융 에어로스 마운팅 용액을 준비하고 섭씨 40도에서 보관합니다.

필요한 경우 trica 및 PTU를 추가합니다. 부드럽게 섞어 섭씨 40도로 되돌립니다. 물고기를 trica를 함유한 배아 배지에 넣어 마취합니다.

약 3분 동안 물고기는 반응이 없습니다. 마이크로 피펫을 사용하여 만지려면 약 30마이크로리터의 마취 용액 부피에 담긴 트리밍된 피펫 팁으로 개별 물고기를 끌어들입니다. 다음으로 피펫을 뒤집어 생선이 바닥에 가라앉도록 합니다.

팁을 장착 솔루션에 접촉하고 중력에 의해 전달되도록 합니다. 재사용할 수 있도록 어그로를 희석하지 않도록 주의하십시오. 마이크로 피펫에 남아 있는 마취액을 버립니다.

그런 다음 같은 팁을 사용하여 생선을 페트리 접시에 옮깁니다. 약 30마이크로리터의 장착 용액에서 관심 영역이 에어로스 액적의 중앙에 오도록 물고기의 방향을 부드럽게 지정합니다. 에어로스가 굳을 때까지 물고기가 원하는 방향을 유지하는지 확인하십시오.

원하는 경우 단일 페트리 접시에 여러 물고기를 장착할 수 있습니다. 에어로스가 응고된 후 물고기를 컨포칼 현미경 단계로 옮기고 물고기가 완전히 잠길 때까지 트리카 플러스 또는 마이너스 PTU를 포함하는 배아 배지를 접시에 부드럽게 추가합니다. 이미징 소프트웨어를 열고 관심 영역에 집중하여 세포 및/또는 분자 세부 사항의 최적 이미징을 수행합니다.

소프트웨어에서 높은 개구수를 가진 긴 작동 거리 대물렌즈를 사용하십시오. 다이얼 목록에서 적절한 플로라 포를 선택합니다. 스펙트럼 설정을 클릭하고 방출 범위를 조정합니다.

리포터 신호를 깔끔하게 분리하고 신호 대 잡음비를 최대화합니다. 드롭다운 메뉴에서 적절한 목표를 선택하여 소프트웨어 정의 사전 설정이 적절하게 조정되었는지 확인합니다. 레이저에 초점을 맞추고 전력 수준을 설정하려면 조회 테이블에서 각 채널의 픽셀 채도를 나타내는 출력을 선택합니다.

다음으로, 원하는 이미지 품질을 얻기 위해 검출기 감도를 설정하고 이미지 강도가 허용 가능할 때까지 레이저 출력을 점차적으로 높입니다. 관심 영역의 픽셀 채도를 피하고 레이저 레벨을 가능한 한 낮게 유지하십시오. 광표백 및 광독성 문제를 줄입니다.

모든 이미징 채널을 모니터링하면서 수동으로 레이저를 켜고 꺼서 각 레이저 라인이 적절한 채널에서만 감지 가능한 신호를 생성하는지 확인합니다. 누화가 뚜렷하지 않으면 모든 채널을 동시에 획득할 수 있습니다. 다음으로, zoom 및 rotation 기능을 사용하여 관심 영역의 구도를 잡습니다.

그런 다음 더 빠른 스캔 속도를 사용하여 스캔 속도와 이미지 크기를 설정하고 레이저 체류 시간을 최소화하며 시간 해상도를 높입니다. 실험 요구 사항에 따라 Z 차원 단계 크기를 설정합니다. 여기서 10미크론의 스텝 크기는 망막 조직의 7개 광학 부분을 이미지화하는 데 사용됩니다.

적절한 설정이 결정되면 Zack 이미지를 획득하고 저장합니다. 그런 다음 다음 물고기로 이동합니다. 연속 캐치 및 릴리스 이미징을 수행하여 함께 제공되는 서면 문서의 지침에 따라 연속적인 며칠 동안의 세포 변화를 추적할 수 있습니다.

다중 리포터 이미징 실험을 수행할 때는 스펙트럼이 잘 분리된 바닥 바닥을 사용하는 것이 가장 좋지만 항상 실용적인 것은 아닙니다. 여기에서는 오픈 소스 소프트웨어 이미지 J를 사용하여 여기(excitation) 및 방출 프로파일이 겹치는 바닥 바닥을 분리하는 간단한 이미지 빼기 방법을 보여줍니다. 우리의 경우 GFP와 YFP.

이 비디오에 설명된 타임라인 이미징 기술은 망막 양극성 뉴런의 절제 및 재생 중에 GFP 표지된 망막 줄기세포를 모니터링하는 데 사용되었으며, 스펙트럼 분리를 수행하기 위해 순차적 이미징 모드 및 가변 장벽 필터 설정을 사용하여 이미지를 수집하여 겹치는 4층을 각각 독립적으로 그리고 부분적으로 분리할 수 있습니다. 이미지를 획득하면 ImageJ loci bio formas 가져오기를 사용하여 이미지 파일을 열고 가져오기 도구를 시작합니다. 관심 있는 파일을 이미지 J 창으로 드래그합니다.

가져오기 창의 split channels 확인란을 사용하여 채널을 개별 스택으로 분할하여 align three TP 플러그인을 시작합니다. 플러그인을 클릭한 다음 스택을 정렬합니다. 그런 다음 3 tp를 정렬합니다.

적절한 빼기를 위해 스택을 정렬해야 합니다. 첫 번째 드롭다운 상자에서 참조 스택을 선택하고 두 번째 드롭다운 상자에서 잘못 정렬된 스택을 선택합니다. XY 상대 원점 사용 및 Z 상대 원점 사용 상자를 선택하고 확인을 클릭합니다.

정렬 프로세스를 시작하려면 볼륨 등록 버튼을 클릭합니다. 정렬 매개변수가 포함된 새 창이 나타납니다. 확인을 클릭합니다.

이 섹션은 플러그인 배포자에 의해 최적화되었으므로 수정할 필요가 없습니다. 완료되면 정렬된 스택 창이 나타납니다. 정렬된 창에서 출력을 선택하여 출력 창을 엽니다.

이 창도 최적화되어 있으며 수정할 필요가 없습니다. 확인을 클릭합니다. 파일 제목의 끝에 정렬이 추가된 새 스택이 작업 공간에 나타납니다.

이미지 계산기를 사용하여 누화를 제거하려면 프로세스를 클릭한 다음 이미지 계산기를 클릭하십시오. 이미지 1 드롭다운 상자에서 뺄 스택을 선택하고 뺄 때 사용할 스택을 선택합니다. 이미지 2 드롭다운 상자의 작업 드롭다운 상자에서 빼기를 선택하고 확인을 클릭합니다.

이미지 J는 스택 처리를 요청합니다. 예를 선택합니다. 겹치는 채널 간의 누화를 제거한 새 스택이 나타나야 합니다.

스택을 병합하여 정렬 및 빼기 전에 동일한 이미지 구조를 다시 만듭니다. 채널 도구 창에서 병합된 채널을 선택하면 이 도구를 사용하여 최대 4개의 스택을 하이퍼 스택으로 병합할 수 있습니다. 마지막으로, 채널을 채색하고, 밝기와 대비를 조정하고, 파일을 tiff로 저장하여 니트로 환원효소의 목표 손실 및 재생을 검사합니다.

M 체리는 망막 양극성 세포를 발현합니다. 처리 전에 개별 제브라피시에서 컨포칼 이미지의 시계열을 촬영했습니다. 조절된 양극성 세포에서 멤브레인 태그가 지정된 YFP 리포터의 모자이크 발현이 있으며, 이는 노란색으로 표시되며, 니트로 환원효소 체리 융합 단백질은 빨간색으로 표시된 표적 양극성 세포에서 나타납니다.

시안색으로 표시된 멤브레인 태그 CFP 전이유전자는 대부분의 다른 망막 세포에 대한 맥락 정보를 제공하여 명확성을 더합니다. CFP 신호가 없는 동일한 이미지가 메트로니다졸 처리 후에 표시됩니다. 양극성 세포를 발현하는 적색 니트로 환원효소는 소실되는 반면 황색 제어 양극성 세포는 살아남습니다.

이는 이 절제 방법론의 매우 구체적인 특성을 보여줍니다. 다시 말하지만, 명확성을 위해 CFP가 없는 동일한 이미지가 표시됩니다. 메트로 NIAZ가 제거되면 NTR 발현 세포가 여기로 돌아갑니다.

G-F-P-Y-F-P 빼기 방법의 예가 Mueller라고 표시된 GFP가 표시된 이 그림에 나와 있습니다. GL 세포는 녹색으로 표시되고 YFP 표지 양극성 세포는 자주색으로 표시됩니다. 둘 사이의 겹침은 빼기를 수행하기 위해 흰색을 생성합니다.

먼저 GFP 및 YFP 이미지를 정렬해야 합니다. 그런 다음 빼기 과정을 통해 GFP 이미지에서 YFP 표지된 양극성 세포를 제거할 수 있으므로 GFP 표지된 Mueller ggl을 명확하게 표현하고 더 조광하는 Mueller 세포를 검출할 수 있습니다. 빨간색으로 표시된 dim Mueller, ggl 및 M cherry 표지된 양극성 세포 간의 중복을 이제 확인할 수 있습니다.

여기에 표시된 데이터는 양극성 세포 절제가 mullar ggl을 트리거하여 손실된 세포를 대체한다는 것을 시사합니다. 이러한 해석은 망막 재생에 대한 최근의 연구와 일치하는데, 이 연구는 Mueller Ggl을 포유류와 어류 모두에서 손상에 의한 전구 인자로 연루시킨다. 이 기술을 통해 연구자들은 제브라피시의 줄기세포 시각화를 통해 특정 세포 유형의 재생을 조절하는 메커니즘을 탐구할 수 있습니다.