Name: 使用调频染料培养的小脑颗粒神经突触小泡池补充的定量分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 学习使用调频染料活细胞荧光成像技术定量分析小脑颗粒神经元突触小泡池的补充与动员，通过监测两轮突触小泡循环实现精确量化，为神经传递研究提供可靠方法。

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本工作获得了惠康基金会（Wellcome Trust）的资助（编号：084277）。

1. 小脑颗粒神经元的制备
<ol>
 <li>高压灭菌约100个直径为25 mm的盖玻片（表1）。</li>
 <li>将盖玻片置于含有无菌多聚赖氨酸溶液（表2）的50 ml无菌管中，在旋转平台上孵育2 h以包被盖玻片。</li>
 <li>在超净工作台中，将涂有干燥涂层的盖玻片置于无菌滤纸上（表1）。</li>
 <li>将盖玻片放入无菌的6孔板中，并在CO₂培养箱中预温2 培养箱（表1）。 盖玻片可在 4°C 使用前.</li>
 <li>根据当地伦理委员会指南，处死一只出生7天的Sprague Dawley大鼠幼鼠。我们采用颈椎脱位法处死幼鼠。</li>
 <li>解剖小脑并将其置于含有磷酸盐缓冲盐溶液（溶液B，表3）的无菌培养皿中。</li>
 <li>对4–6只新生大鼠重复步骤1.5和1.6。</li>
 <li>小脑随后置于McIlwain组织切片机（表1）的无菌台面上。组织在以下条件下进行切片： 375 μm 旋转载物台前的间隔时间 90° 并重复该过程。</li>
 <li>将切碎的小脑组织转移至已预热至 37 °C.</li>
 <li>孵育小脑组织于 37 °C 20 分钟内每隔约 5 分钟轻轻振荡一次。</li>
 <li>在胰蛋白酶消化过程中，使用本生灯火焰对三支无菌玻璃移液管（表1）进行火焰抛光。利用火焰分别在各移液管的管口处制备出细孔、中等孔径和粗孔。</li>
 <li>在溶液T中孵育20分钟后，向小脑悬液中加入20 ml胰蛋白酶/DNA酶抑制剂溶液（溶液W，表5），并在1,000 × g条件下离心收集细胞 g 在台式离心机中离心1分钟（表1）。</li>
 <li>弃去上清，用最大孔径的移液管将细胞沉淀重悬于1.5 ml浓缩胰蛋白酶/DNase抑制剂（溶液C，表6）中。</li>
 <li>使用宽口移液管、中口移液管，最后使用窄口移液管依次吹打细胞，直至细胞悬液均匀。 这是关键步骤，此时悬浮液必须均匀。.</li>
 <li>将细胞悬液铺在10 ml预热的37°C) 在无菌15 ml离心管中加入含牛血清白蛋白的Earles平衡盐溶液（表7）。</li>
 <li>将悬液在1,500 × g下离心5分钟g 并将细胞沉淀重悬于 2 ml 预热的（37°C) 培养基（表8）。</li>
 <li>使用血细胞计数板（表1）估算细胞数量，并将细胞悬液稀释至终浓度为3.3 × 106 每毫升细胞数</li>
 <li>将细胞接种至培养板中 75 μl 将细胞悬液接种至多聚-D-赖氨酸包被的盖玻片中央（终密度为 2.5 x 105).</li>
 <li>含有盖玻片的培养板被放置于 CO2 孵育60分钟，使细胞贴壁。</li>
 <li>向每个孔中加入 1.5 ml 培养基，注意不要扰动已接种的细胞，并将培养板放回 CO₂ 培养箱中2 培养箱</li>
 <li>次日，将培养基更换为新鲜的培养基，并补充有丝分裂抑制剂阿糖胞苷（Table 8）。 这会抑制培养中胶质细胞的增殖.</li>
</ol>
2. 实验设置
<ol>
 <li>基本实验装置应包括以下部分（具体使用的设备和软件见表1和表9）：
 <ul>
 <li>倒置落射荧光显微镜</li>
 <li>冷却型CCD相机</li>
 <li>荧光光源（单色器或滤光轮）</li>
 <li>重力灌流装置</li>
 <li>带有平行铂电极的成像室</li>
 <li>电刺激器</li>
 <li>计算机</li>
 <li>图像采集软件</li>
 </ul>
 </li>
 <li>实验应在黑暗或红光条件下进行，并尽量减少对样品的荧光照射，以避免FM染料漂白。</li>
 <li>实验在室温下进行。若需要生理温度，可使用温度控制的灌流系统。</li>
</ol>
3. 样品制备
<ol>
 <li>培养物应在培养 8–12 天后使用 体外.</li>
 <li>将单个盖玻片转移至生理盐水溶液（表10）中，室温下孵育10分钟，以使其在新培养基中稳定。</li>
 <li>移除盖玻片，用一小块纸巾或吸水纸擦干其底面及附着细胞周围的区域。</li>
 <li>使用硅脂（表2），将盖玻片粘附于成像室的底面。细胞应位于两根平行导线之间。需使用足量硅脂以完全密封成像室，但避免硅脂进入浴槽中心区域。</li>
 <li>轻柔地向浴槽中注入约 ~260 μl 生理盐水溶液，然后用相同的溶液填充进液管。</li>
 <li>用硅脂将一块洁净的盖玻片粘接到腔室顶部以密封。可通过输入和输出管路去除腔室内 trapped 的任何气泡。 电路中不得有气泡导致断路.</li>
 <li>将成像腔室固定在不锈钢平台上，并通过向输入管路中轻柔灌注生理盐水检查是否泄漏。</li>
 <li>将组装好的腔室安装到倒置显微镜的载物台上，并将腔室连接至重力灌流系统，连接前应先用生理盐水溶液预充灌流入口。</li>
 <li>将腔室的连接导线接到电刺激器上。</li>
 <li>若使用油镜，请在物镜上滴加一滴浸油。使用明场照明，聚焦于腔室中央的细胞。</li>
</ol>
4. S1 期
<ol>
 <li>用1.5 ml FM染料（表2）稀释于生理盐水中对神经元进行灌流。</li>
 <li>使用连接的刺激器刺激神经元，以诱导染料摄取。</li>
 <li>刺激后，用新鲜生理盐水以7 ml/min的流速灌流神经元2分钟，以洗去多余的FM染料。CGN培养系统中的胶质细胞污染率低于5%14，因此该时间足以去除染料。</li>
 <li>让神经元静置8分钟。</li>
 <li>在此期间，使用荧光素波长（激发波长480 nm；发射波长&gt; 550 nm）定位可观察到单个FM染料标记的神经末梢的轴突网络。避免选择细胞成簇的区域。此步骤应尽量减少光照，因为强激发可能导致染料光毒性。明显的光毒性表现为轴突出泡及染料无法释放（由于染料固定）。</li>
 <li>由于静置期间可能发生轻微漂移，在图像采集前立即重新对焦。</li>
 <li>以每4秒1帧的速率开始时间序列图像采集。</li>
 <li>采集5–10张基础图像后，通过施加30 Hz、持续2秒的刺激（60个动作电位）8，诱发RRP的胞吐。在帧图像捕获后立即手动开始刺激。</li>
 <li>再采集10张图像后，使用三次40 Hz、持续10秒（400个动作电位）的刺激，每次间隔30秒8，诱发RP的突触小泡胞吐。</li>
 <li>再采集5–10张图像，然后暂停图像采集。</li>
</ol>
5. 恢复阶段（见图2）
<ol>
 <li>让神经元恢复至少 20 分钟。</li>
 <li>可选 - 若需检测某种药物对内吞作用的影响，可在该期间用药物溶液灌注神经元（图 2b）3,8。</li>
</ol>
6. S2 期
<ol>
 <li>使用与S1阶段相同的视野，重复S1阶段的实验方案（第4节），以进行对照实验。</li>
 <li>可选 - 若需检测药物对内吞作用的影响，可用含有FM染料的药物溶液灌注神经元（图2b）3,8。</li>
 <li>可选 - 若关注药物对胞吐作用的影响，可在RRP和RP卸载刺激前及期间，用药物溶液灌注神经元（图2c）3。</li>
</ol>
7. 数据分析
<ol>
 <li>使用 ImageJ 和 Microsoft Excel 或类似软件进行数据分析。</li>
 <li>进行分析时，需要以堆栈格式存储的图像序列。某些成像软件可能将序列导出为单张图像。若如此，请使用 ImageJ 内置功能将图像转换为堆栈格式 图像&gt;堆叠&gt;待叠加的图像.</li>
 <li>调整图像栈的亮度和对比度，以最大化动态范围。 图像&gt;调节&gt;亮度/对比度 （图3a）。</li>
 <li>如果实验过程中出现了显著的水平漂移，请运行 StackReg (<a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/">http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</a>）和 TurboReg (<a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/">http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</a>) 使用 ImageJ 插件对图像堆栈进行对齐（图 3b）。</li>
 <li>运行时间序列分析器插件（<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html</a>)（图 3c）。</li>
 <li>在至少90个神经末梢上定义感兴趣区域（ROIs）。这些区域应完全相同（圆形ROIs，其 1.5 μm 直径）切换染料卸载前后图像有助于识别活跃的神经末梢（或者可将刺激前图像从刺激后图像中减去）。 理想的ROI大小应略大于典型的神经末梢 （图3c）。</li>
 <li>随时间获取每个 ROI 的总/积分荧光强度，并导出至 Microsoft Excel（图 3d 和 4a）。</li>
 <li>通过将S1和S2阶段第一次卸载刺激时的Y轴平面内信号轨迹对齐，将ROI轨迹归一化至相同的任意数值（图4b-c）。 这是为了控制背景荧光强度的微小变化.</li>
 <li>以任意荧光单位测量每个卸载刺激在S1和S2中诱发的荧光绝对减少量，方法如下（图4d）：
 <ul>
 <li>RRP = 由30 Hz 2 s刺激引发的荧光变化（ΔF）</li>
 <li>RP = 由3次40 Hz、10秒刺激引发的ΔF总和</li>
 <li>总回收池 = RRP + RP</li>
 </ul>
 </li>
 <li>针对7.9中的每个相关参数，计算单次实验中所有神经末梢的平均值。</li>
 <li>进行统计分析时，可对多次独立实验获得的平均值进行平均。统计学中的 n 值应使用盖玻片的数量，而非神经末梢的数量。</li>
</ol>
8. 代表性结果：
图5展示了颗粒神经元（CGNs）经历两轮相同加载和卸载步骤的对照实验。在开始一系列实验时，每天必须进行此类对照实验，以确认在第二阶段（S2）改变实验条件之前，S1和S2具有可比性。
在本示例中，使用 80 Hz 持续 10 秒的刺激，将 CGN 加载 10 μM FM1-43（图 5a）。图 5b 显示了由荧光斑点表示的 FM1-43 标记的神经末梢。如图 5c 所示，在 90 个神经末梢上定义了感兴趣区域（ROI）。同一组 ROI 用于 S1 和 S2 两组。在两次卸载过程中，首先以 30 Hz（2 秒）刺激卸载 RRP，随后通过 3 次连续的 40 Hz（10 秒）刺激卸载 RP（图 5a）。每次刺激期间的荧光下降均可清晰观察并量化（图 5d-e）。经检测，S1 与 S2 中对应 RRP、RP 及总回收池的荧光下降程度相似。此外，在 S1 和 S2 中，20% 的回收突触小泡位于 RRP，80% 位于 RP。
<img alt="FM染料摄取过程示意图：加载、洗脱、释放、荧光下降量化的图表。" src="/files/ftp_upload/3143/3143fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1"> 
图1 典型FM实验的示意图。A) 在FM染料（以绿色表示）存在的情况下触发突触小泡内吞作用。染料被内陷的膜结构（单个突触小泡或大分子内吞体）摄取。B) 通过灌流洗去质膜上未内化的染料。C) 施加卸载刺激后，已标记并可释放的突触小泡与质膜融合，导致荧光信号下降。D) 荧光变化量（ΔF）与释放的标记突触小泡数量成正比，可据此进行定量分析。
<img alt="使用FM染料和刺激在三种设置中检测突触囊泡内吞和外排的流程图" src="/files/ftp_upload/3143/3143fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2 可能的实验方案示意图。A) 对照实验的流程图，其中细胞经历两轮FM染料的加载与卸载（S1和S2）。可通过多种不同的刺激方式进行染料加载。卸载步骤保持一致：首先以30 Hz持续2秒卸载再释放池（RRP），随后以3次40 Hz、每次10秒卸载储备池（RP）。RRP与储备池的卸载刺激之间间隔40秒，其余刺激之间间隔30秒。S1与S2之间细胞恢复20分钟。B) 和 C) 还展示了用于检测某种物质对内吞或外排过程影响的可能实验修改方案。相应的测试药物可在指定时间段内灌注到记录室中。
<img alt="荧光显微分析、图像处理步骤、软件界面、数据可视化、图表。" src="/files/ftp_upload/3143/3143fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3 Image J 中数据分析的截图。图中展示了在 Image J 中进行 A）亮度与对比度调整、B）帧对齐、C）感兴趣区域（ROI）选择，以及 D）强度值提取的操作截图。
<img alt="软件界面中的数据分析结果，包含表格和图表，突出显示用于比较的数值。" src="/files/ftp_upload/3143/3143fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4 Microsoft Excel 中的数据分析截图. 截图显示了以下步骤：A）从 Image J 导入原始数据（1st 列 = 帧编号，其余各列 = 来自单个神经末梢的数据；B）将S1基线值（第10帧）调整为第一个刺激开始时的任意值（200）；C）使用与S1相同的方案，在第55帧处调整S2基线值；D）使用Microsoft Excel测量荧光下降幅度。注意，D中所示的平均轨迹用于定义每次下降前后的时间点。每个ROI的荧光下降幅度应根据C中表格所示数值确定。
<img alt="显微镜下的神经元活动；30Hz-40Hz频率对细胞的影响；分析示意图。" src="/files/ftp_upload/3143/3143fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 
图5 ．代表性对照实验。A）对照实验的流程图，其中颗粒神经元（CGNs）在80 Hz（10 s）刺激下加载10μM FM1-43。S1和S2阶段完全相同。RRP和储备池卸载刺激之间间隔40秒，其余刺激间隔均为30秒。B）显示加载了FM1-43的神经末梢的图像。C）与B相同的图像，显示为分析选定的90个编号的ROI（感兴趣区域）。D）B图中红色方框所示区域在选定时间点的图像。Basal = 刺激前；30 Hz = 30 Hz 2 s刺激后；40 Hz 1,2,3 = 每次40 Hz 10 s刺激后。这些图像以伪彩形式呈现，以显示荧光变化（右侧显示光谱条）。E）从C图中90个神经末梢获得的平均值±标准误（SEM）曲线。各个刺激以水平条形表示。比例尺 = 10 μm。

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</ol>

我们没有需要披露的内容。

FM染料被广泛用于研究多种神经元标本中神经末梢的功能。这些染料主要被用来监测突触囊泡内吞作用的程度、突触囊泡周转情况或胞吐作用的动力学6。本描述的实验方案扩展了这些研究，以检测特定突触囊泡池的差异性卸载。这为进一步了解突触囊泡池的再补充及其动员程度提供了额外信息。 
FM染料可用于在同一神经末梢内标记多轮突触小泡（SV）的循环过程。我们利用这一特性设计了实验方案，可在同一神经末梢中对每个末梢内的SV周转过程进行两次监测。这种方法提供了精确的内部对照，这对于并行神经末梢中SV循环的异质性而言至关重要11。通过将S1时相作为内部对照，可可靠且直接地比较在药物存在条件下RRP、RP以及总SV池的重新填充情况。 
除了提供在不同刺激条件下回收池、RRP池和RP池的绝对大小信息外，本方案还可提供以下数据：1）S1和S2中突触囊泡在RRP与RP之间的分配情况与回收池的关系；2）S2中RRP和RP池的相对大小与S1总回收池的关系；3）S2中任意定义的突触囊泡池的相对大小与S1中对应池的关系。然而，该特定方案无法提供卸载动力学信息，因为图像采集时间过慢（动力学测量要求采集时间尽可能快，并且卸载过程需与图像采集自动同步）。
我们的 30 Hz 2 s 刺激引发的 RRP 释放程度与高渗蔗糖8相当。由于 RRP 的大小由高渗蔗糖引发的释放量来定义15，因此可以认为该方案能够完全释放所有 RRP 中的突触囊泡（SVs），这与海马神经元中的研究结果一致16。通过三组 400 次刺激（每组 40 Hz 10 s）几乎可完全耗尽储备池，因为该刺激方案释放的染料量与一种可耗尽 95% 染料标记突触囊泡的范式（2 次刺激，50 mM KCl）相当8,17。对 RRP 和储备池大小的精确量化还依赖于在 CCD 相机的线性动态范围内获取数据。
该简单方案还可进一步修改。可通过改变加载刺激的强度，来确定神经元活动和不同内吞模式对突触囊泡（SV）池补充的影响。此外，根据需要还可进行两次以上的加载与卸载循环。本方案也可用于转染了过表达载体或shRNA载体的细胞。由于原代神经元培养物的转染效率较低，因此所表达的蛋白质必须标记荧光蛋白。这些荧光标签必须不干扰FM染料信号（例如使用青色或红色荧光蛋白）。在此情况下，还可以在同一视野内比较转染细胞与未转染细胞的神经末梢，作为额外的对照8。在这些实验中，S1与S2加载程度之间的比较价值有限，因为干扰因素在两次加载过程中均存在。然而，染料在不同突触囊泡池间的分布仍可被可视化观察8。
一类名为pHluorin的遗传报告分子也可用于监测原代神经元培养中突触小泡（SV）的胞吐和胞吞过程。这些探针利用一种对pH敏感的绿色荧光蛋白，来反映被标记的突触小泡蛋白（如VAMP、突触素和VGLUT1）腔域内的pH环境18。当与囊泡ATP酶抑制剂联合使用时，pHluorin能够报告突触小泡池动员的动力学过程及其程度19。本文所述的基于FM染料的方法相较于pHluorin技术具有一些优势：首先，FM染料可提供关于哪种突触小泡胞吞模式补充了可立即释放池（RRP）和储备池的信息8；其次，可利用具有不同光谱特性的FM染料特异性地标记不同的突触小泡池20；最后，该方法无需转染操作。然而，FM染料无法提供静息池与可循环池之间突触小泡运输的信息（与pHluorin相反19），因为根据定义，只有在胞吞过程中被染料标记的突触小泡才可被检测到。因此，FM染料与pHluorin各有优缺点，当在独立实验中用于回答同一科学问题时，二者最具研究价值。
高质量的图像对于有效的分析和可重复的结果至关重要。虽然水平漂移可以轻松校正，但对于发生Z轴漂移的实验则无法补救。因此，在开始S1和S2卸载前，重新对焦图像是十分重要的。当出现明显的荧光衰减时，可进行衰减校正（通常通过从无刺激条件下FM负载细胞记录的先前轨迹中减去当前信号来实现）。然而，建议仅在图形展示时进行衰减校正，不应将其用于任何定量分析。

<table><tbody><tr><td>AxioCam MRm Rev. 3 数字相机</td><td>卡尔·蔡司股份有限公司</td><td>4265099901000</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer.A1 显微镜</td><td>卡尔·蔡司股份公司</td><td>4310040000000</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养板（6 孔）</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>离心机（Universal 32R）</td><td>Hettich 离心机</td><td>1610</td><td></td></tr><tr><td>一氧化碳&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Heraeus Instruments</td><td>51014042</td><td></td></tr><tr><td>Falcon管（15/50 ml）</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271/210261</td><td></td></tr><tr><td>Fluar 20X /0.75 &amp;#8734;/0.17 目的</td><td>卡尔·蔡司股份公司</td><td>4401459901000</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片（25 mm）</td><td>VWR国际</td><td>631-1584</td><td></td></tr><tr><td>玻璃巴斯德吸管（230 nm）</td><td>Greiner Bio-One</td><td>612-1799</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>VWR 国际</td><td>15170-170</td><td></td></tr><tr><td>成像室</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-21 BRFS</td><td></td></tr><tr><td>层流罩</td><td>BIOHIT</td><td>VLF BHS 1200</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain 组织切片机</td><td>米克尔实验室工程有限公司</td><td>MTC/2</td><td></td></tr><tr><td>汞灯</td><td>卡尔·蔡司股份公司</td><td>HBO 103</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://digitimer.com/products/research/stimulators/digitimer-d330-multistim-system/" target="_blank"&gt;MultiStim 系统电刺激器（100 mV，1 ms 脉冲宽度）&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.digitimer.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Digitimer Ltd.</a></td><td>&lt;a href="http://digitimer.com/products/research/stimulators/digitimer-d330-multistim-system/ " target="_blank"&gt;D330&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>灌流泵</td><td>Watson-Marlow 泵业集团</td><td>313S</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管（5/10/25 ml）</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606180/607180/760180</td><td></td></tr><tr><td>快门控制器</td><td>卡尔·蔡司公司</td><td>MAC5000</td><td></td></tr><tr><td>注射器（20 ml）</td><td>BD 生物科学</td><td>ST01-B002</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器（Minisart -&amp;#8211; 0.20 &amp;微米</td><td>Sartorius AG</td><td>16532</td><td></td></tr><tr><td>VC-6 六通道阀控制器</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0135</td><td></td></tr><tr><td>YFP滤光片组（46号滤光片组）</td><td>卡尔·蔡司公司</td><td>1196-681</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">表1. 使用的特定设备和仪器</td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>剑桥生物科学</td><td>BT70021</td><td>10 &amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>FM2-10</td><td>剑桥生物科学</td><td>BT70044</td><td>100 &amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7886</td><td>15 &amp;微克/毫升</td></tr><tr><td>硅脂</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>85403</td><td>-</td></tr><tr><td colspan="4">表2. 使用的特定试剂</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>A4503</td><td>0.3%</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>0.25%</td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td>1.5 mM</td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>21300</td><td>960 毫克/100 毫升</td></tr><tr><td colspan="4">每次制备时新鲜配制 100 ml&lt;br/&gt;- 使用前经无菌过滤</td></tr><tr><td colspan="4">表3. CGN制备用溶液B</td></tr><tr><td>溶液B</td><td></td><td></td><td>19 毫升</td></tr><tr><td>胰蛋白酶（5 mg/ml 储液，-20&amp;摄氏度</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9201</td><td>1 毫升</td></tr><tr><td colspan="4">表4. CGN制备用溶液T</td></tr><tr><td>溶液 C</td><td></td><td></td><td>3.2 毫升</td></tr><tr><td>溶液B</td><td></td><td></td><td>16.8 毫升</td></tr><tr><td colspan="4">表5. CGN制备用溶液W</td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶（DNase，500 U/0.5 ml 原液，-20&amp;摄氏度</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>D5025</td><td>0.5 毫升</td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183; 7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;好的，我将严格遵循您的所有要求，将源文本翻译为符合出版级质量的中文简体学术译文。

源文本：
O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td>1.5 mM</td></tr><tr><td>溶液B</td><td></td><td></td><td>10 毫升</td></tr><tr><td>大豆胰蛋白酶抑制剂（SBTI，0.5 mg 每 0.5 ml 储液，-20&amp;摄氏度</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9003</td><td>0.5 ml</td></tr><tr><td colspan="4">表6. 制备CGN用溶液C</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td>4%</td></tr><tr><td>厄尔&amp;rsquo;Earle平衡盐溶液（EBSS）</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>24010</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183; 7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;JoVE 教育与科学内容</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td>3 mM</td></tr><tr><td colspan="4">表7. CGN制备用EBSS溶液</td></tr><tr><td>胞嘧啶 &amp;#946;-D-阿糖呋喃糖苷（Ara-C）*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td>10 &amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>F&amp;#8211;胎牛血清</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>10106</td><td>10 %</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>30 mM</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3126</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>P5405</td><td>25 mM </td></tr><tr><td>最低限度必需培养基（MEM）</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>21090</td><td>500 毫升</td></tr><tr><td>青霉素（P）/链霉素（S）</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>15140</td><td>100 U/ml（P） 100 &amp;微克/毫升 (S)</td></tr><tr><td colspan="4">从1 DIV开始，应将Ara-C加入培养基中</td></tr><tr><td colspan="4">表8. CGN制备用培养基</td></tr><tr><td>AxioVision Rel.</td><td>卡尔·蔡司股份有限公司</td><td>4.8</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>1.42q</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>微软</td><td>2003</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">表9. 使用的特定计算机软件</td></tr><tr><td>氯化钙&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;#183; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>1.3 mM</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>3.5 mM</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>0.4 mM</td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;源文本：</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>M0250</td><td>1.2 mM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fluka</td><td>71378</td><td>170 mM</td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fluka</td><td>71627</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>钠&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;**SO**&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>VWR</td><td>10264</td><td>1.2 mM</td></tr><tr><td>TES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1375</td><td>20 mM</td></tr><tr><td colspan="4">表10. 生理盐水溶液（pH 7.4）</td></tr></tbody></table>

使用fm染料对培养的小脑颗粒神经元中突触囊泡池再补充进行定量分析

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

中枢神经末梢释放神经递质后，突触小泡（SVs）会通过内吞作用被迅速回收。回收后的突触小泡重新填充神经递质，并重新进入可循环池，即可用于胞吐作用的突触小泡1,2。通常情况下，可循环池可进一步分为两个不同的亚池——即易释放池（RRP）和储备池（RP）。顾名思义，RRP包含可立即用于膜融合的突触小泡，而RP中的突触小泡仅在强烈刺激时才会被释放1,2。为了深入理解以下两个问题，建立一种能够可靠报告这两种突触小泡池差异性再补充情况的检测方法至关重要：1）在不同内吞模式（如网格蛋白依赖性内吞和活动依赖性大规模内吞）后，突触小泡的转运机制；2）在不同刺激条件下，RRP和RP动员的调控机制。
FM染料通常被用于定量报告中枢神经末梢突触小泡（SV）的循环周转3-8。这些染料具有一个疏水的烃链，可逆地插入脂双层中，同时带有亲水性头部基团，阻止其穿过膜结构。FM染料在水溶液中几乎不产生荧光，但当其插入膜中后，荧光量子产率显著提高9。因此，FM染料是追踪活跃循环突触小泡的理想荧光探针。FM染料的标准使用流程如下：首先将其施加于神经元，使其在内吞过程中被摄取（图1）；随后洗去未内化的染料，使已回收的突触小泡在循环池内重新分布；接着通过卸载刺激耗尽这些突触小泡（图1）。由于FM染料对突触小泡的标记具有量子化特性10，所观察到的荧光下降程度与释放的囊泡数量成正比。因此，可准确量化由上一轮内吞所生成的突触小泡的循环与融合过程。
本文介绍了一种经过改进的实验方案，可获得两个额外的信息要素。首先，采用连续卸载刺激，选择性地卸载再循环池（RRP）和储备池（RP），从而实现对特定突触囊泡（SV）池补充过程的定量分析。其次，每个神经末梢均接受两次相同的实验流程。因此，可将同一神经末梢在S1阶段的反应与S2阶段加入测试物质后的反应进行比较（图2），从而提供内部对照。这一点至关重要，因为不同神经末梢之间突触囊泡循环的程度具有高度变异性11。
任何贴壁的原代神经元培养物均可用于本方案，但铺板密度、溶液和刺激条件已针对小脑颗粒神经元（CGNs）进行了优化12,13。

介绍了一种活体荧光成像技术，用于定量中枢神经末梢中特定突触小泡（SV）池的补充与动员过程。在同一神经末梢中监测两轮SV循环，以提供内部对照。

使用FM染料对培养的小脑颗粒神经元中突触囊泡池再补充进行定量分析

在中枢神经末梢释放神经递质后，突触小泡（SVs）通过内吞作用被迅速回收。回收后的突触小泡随后重新填充……

以下实验的总体目标是利用活细胞荧光成像技术，定量分析中枢神经末梢中特定突触囊泡池的补充与动员过程。该目标通过在同一神经末梢中使用 FM 染料监测两轮突触囊泡循环来实现，从而提供有效的内部对照。第二步，采用特定的卸载方案依次耗尽易释放池和储备池，以定量各囊泡池的相对大小。接下来，改变加载或卸载条件，以研究所选变量对突触囊泡、囊泡池补充或动员的影响。结果表明，基于诱发染料卸载的定量与分析，不同突触物理池的 FM 染料加载具有可重复性。该技术相较于现有方法（如荧光蛋白基因报告系统）的主要优势在于，该技术能够特异性地追踪经历内吞作用后的突触囊泡对囊泡池的补充过程。它还能够实现精确的定量分析。由于该方案在同一神经末梢中重复进行两次，从而提供了内部对照。该方法有助于回答突触、CLE、内吞和外排领域中的关键科学问题，例如，对特定内吞模式的调控如何影响总循环池及其内部的突触 CLE 池（如易再利用池和储备池）的补充。基本实验装置应包括倒置荧光显微镜、冷却 CCD 相机、荧光光源、重力灌流装置、带有平行铂电极的成像室和电刺激器，以及一台计算机。实验应在黑暗或红光条件下进行，并尽量减少对样品的荧光照射，以避免 FM 染料漂白。本实验程序首先使用出生七天的 spra dolly 大鼠幼崽制备小脑颗粒神经元的原代培养物。培养物制备完成后，将神经元接种于经多聚赖氨酸包被的25毫米盖玻片中央，形成液滴，一小时后液滴直径不得超过7毫米。七天后，向神经元中加入2毫升培养基。随后，将单个盖玻片置于室温下的生理盐水中10分钟，使其在新培养基中稳定。之后取出盖玻片，用一小块纸巾或吸水纸擦干其底面以及细胞附着区域周围的液体。随后，使用硅脂将盖玻片粘接到成像室的底部。细胞应位于两根平行导线之间。使用足量的硅脂将成像室完全密封，但不要侵入浴室中心区域。接下来，轻轻向浴槽室中加入约 260 µL 生理盐水溶液。然后用相同溶液填充输入和输出管路。使用硅脂将一块洁净的盖玻片粘合到顶部，以密封室腔。随后，使用进液和出液管路排除腔室中截留的任何气泡。然后将成像室固定在不锈钢平台上。通过进液管路缓慢灌注生理盐水，检查是否存在泄漏。下一步是将组装好的腔室安装到倒置显微镜的载物台上。用生理盐水溶液预充重力灌流系统的入口，然后将腔室连接到入口。接着将腔室的连接导线接到电刺激器上。用1.5毫升稀释的FM染料灌注神经元。随后使用连接的刺激器刺激神经元，以诱导染料内吞。刺激后，用新鲜的生理盐水溶液灌注神经元2分钟，以洗去多余的FM染料。然后将神经元在生理盐水中保持8分钟。在此期间，利用荧光素波长定位可观察到单个 FM D 荷载神经末梢的轴突网络，避开细胞成簇的区域。在图像采集前立即重新对焦，因为在休息期间可能发生轻微漂移。以每四秒一帧的速率开始延时图像采集。采集5到10个基础图像后，通过施加30赫兹、持续两秒的刺激，诱发易释放囊泡池的胞吐作用。再获取10张图像后，使用三次40赫兹、持续10秒的刺激（刺激间间隔40秒）诱发突触囊泡储备池的胞吐，随后再获取5到10张图像。然后暂停图像采集，让神经元恢复至少20分钟，并在S二相中重复此S一相实验方案，作为对照实验。进行数据分析时，将图像转换为堆栈。使用 ImageJ 内置功能，若出现明显的水平漂移，则调整堆栈的亮度和对比度以最大化动态范围。在实验过程中，在 ImageJ 中运行 StackReg 和 TurboReg 插件以对齐图像堆栈。然后使用时间序列分析插件。接下来，在至少90个神经末梢上定义感兴趣区域。在卸载染料前后的图像之间进行切换，有助于识别出活跃的神经末梢。理想的感兴趣区域大小应略大于典型的神经末梢。然后获取每个感兴趣区域随时间变化的总荧光强度。之后，导出至 Microsoft Excel。此处展示的流程图描述了一项对照实验，其中小脑颗粒神经元在 80 赫兹、持续 10 秒的刺激条件下，使用 10 微摩尔 FM 1 43 进行标记。这是一张显示被 FM 1 43 标记的神经末梢的图像。同一图像中标注了 90 个编号的感兴趣区域，这些区域是在识别出活跃的神经末梢后选定用于分析的，这些图像展示了在选定时间点的神经末梢情况。这些图像以伪彩色显示，以说明不同突触囊泡池耗竭时荧光信号的变化。最后，此处展示了这90个神经末梢归一化的荧光单位。在S1相和S2相中，可测量并比较每次连续刺激引起的荧光下降程度。在此对照实验中，S1 和 S2 均导致了相同大小的易释放池和储备池。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用活体荧光成像技术，定量分析中枢神经末梢中特定突触囊泡池的补充与动员过程。在实施该实验操作时，重要的是需牢记：在改变 S2 实验条件之前，应首先进行 S1 对照实验，以确认细胞的存活率和反应性。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

使用调频染料培养的小脑颗粒神经突触小泡池补充的定量分析

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使用FM染料标记法测量神经元中的胞吐作用

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量化突触：一种基于免疫细胞化学的突触数量检测方法

突触处聚集的神经递质受体丰度显著影响突触强度。该方法可在单个突触分辨率下，对秀丽隐杆线虫（C.

C. elegans 中突触荧光的自动化定量分析

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利用FM染料检测诱发性、自发性和微小突触活动期间的突触囊泡再循环

本文介绍了一种利用突触小泡蛋白2-pHluorin构建体和全内反射荧光显微镜技术研究神经母细胞瘤细胞中神经递质囊泡动态的方法。同时报道了图像处理与数据分析的策略。...

使用TIRFM和pH敏感型GFP探针评估SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中神经递质囊泡动态：细胞成像与数据分析

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在培养的海马神经元中测量突触囊泡内吞作用

突触小泡（SV）循环是神经元突触处细胞间通讯的核心机制。FM染料的摄取与释放是定量检测SV内吞和外吐的主要方法。本文中，我们比较了在果蝇（Drosophila）神经肌肉接头（NMJ）模型突触上驱动FM1-43循环的所有刺激方法。...

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描述了两种相关方法，用于可视化突触传递所需的亚细胞事件。这些方案通过活细胞成像技术，实现对突触前钙离子内流和突触囊泡膜融合动态过程的实时监测。 体外...

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使用FM染料对培养的小脑颗粒神经元中突触囊泡池再补充进行定量分析

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