Fabrication et utilisation de puces à micro-environnement (MEArrays)

L’objectif général de l’expérience suivante est de mesurer les effets de différents microenvironnements sur les fonctions cellulaires des types de cellules adhérentes en les exposant en parallèle à une collection variée de microenvironnements Combinator. Ceci est réalisé en fabriquant d’abord des substrats d’impression pour favoriser l’absorption de mélanges de protéines microenvironnementales. Ensuite, des plaques maîtresses de protéines microenvironnementales sont préparées, qui sont utilisées pour imprimer des réseaux ME à l’aide d’une plume ou d’un robot d’impression de microréseaux à broches capillaires.

Ensuite, des plaques maîtresses de protéines microenvironnementales sont préparées. Ensuite, les cellules adhérentes sont cultivées sur la matrice ME avec la possibilité de limiter le nombre de cellules. Les résultats obtenus montrent l’impact des différents microenvironnements sur les fonctions cellulaires telles que la différenciation ou la prolifération sur la base de l’analyse par immunofluorescence.

Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons voulu quantifier les effets des microenvironnements tissulaires sur les décisions de devenir des cellules souches à mémoire humaine, mais nous nous sommes rendu compte qu’il était impossible de travailler in vivo. Maintenant qu’il est développé, il a de nombreuses applications en biologie cellulaire, en recherche et en découverte de médicaments. Le PDMS est utilisé comme substrat qui imite les tissus plus rigides car il est peu coûteux, facile à préparer et facile à imprimer.

Cependant, l’hydrophobicité du PDMS peut le rendre incompatible avec certaines lignées cellulaires lorsque l’on travaille avec du PDMS. Gants sans latex car le latex peut inhiber la polymérisation PDMS. Pour commencer dans un gobelet en plastique jetable, combinez la base en élastomère de silicone du cigare 184 avec l’agent de durcissement dans un rapport de 10 pour un et mélangez-le vigoureusement avec un abaisse-langue en bois ou en plastique.

Ensuite, dégazez le mélange dans une cloche à vide à température ambiante pendant 30 minutes. Centrez maintenant une lame de microscope standard sur le mandrin à vide actionné d’un Coer de rotation, puis versez 0,5 millilitre de polymère élastomère mixte sur le centre de la surface de la lame et essorez la couche à 6 000 tr/min pendant 60 secondes. Faites durcir les lames revêtues de PDMS à 70 degrés Celsius pendant quatre heures à toute la nuit.

Les lames peuvent être stockées hermétiquement à température ambiante pendant plusieurs mois. Le PA est un hydrogel qui peut imiter les tissus plus mous dans la gamme des cellules PA ne se fixera qu’aux endroits où il y a des protéines qui favorisent l’adhésion cellulaire. Commencez par graver les lames avec de l’hydroxyde de sodium.

Placez les lames sur un bloc chauffant à 80 degrés Celsius. Déposez un millilitre d’hydroxyde de sodium normal 0,1 sur chaque lame. Assurez-vous de couvrir toute la surface de la diapositive, sinon le système de sonorisation tombera en panne.

Laissez l’hydroxyde de sodium s’évaporer en laissant une pellicule blanche. Répétez ce processus si la surface n’est pas complètement recouverte. La lame peut être stockée à température ambiante pendant plusieurs jours si nécessaire.

Ensuite, enduisez les lames d’un PES dans une hotte. Placer les lames dans un plat de 15 millilitres. Ajoutez 300 microlitres d’un PES sur chaque lame d’hydroxyde de sodium gravée.

Laissez le A PES réagir avec les lames d’hydroxyde de sodium pendant précisément cinq minutes. Pas plus. Lavez soigneusement l’A PES avec de l’eau déminéralisée deux à trois fois des deux côtés des lames.

Sinon, il s’oxydera pour former un dépôt brun sur les lames à l’étape suivante. Maintenant, aspirez toutes les solutions des surfaces de glissement dans chaque plat. Ajouter 25 millilitres de glutaraldéhyde à 0,5 % dans du PBS.

Placez les diapositives dans l’obscurité et attendez 30 minutes. Après 30 minutes, aspirez toute la solution de glutaraldéhyde de la surface de la lame. Ensuite, séchez soigneusement les lames à l’aide de papier absorbant non pelucheux.

Les lames peuvent maintenant être stockées à température ambiante pendant la nuit si nécessaire. Après avoir préparé et dégazé les mélanges de PA, placez-les sur de la glace pour ralentir leur polymérisation. Juste avant de préparer les lames à chaque mélange sur de la glace, ajoutez de l’ammonium par sulfate et témide et tritratez-les à l’aide d’une pipette pendant cinq à 10 secondes.

Maintenant, pipetez le mélange PA sur les surfaces des lames. La quantité de PA varie en fonction de la dureté du gel requise. Placez ensuite les lamelles de verre sur le PA sans appliquer de pression pour éviter la formation de bulles.

Laissez le gel PA polymériser pendant deux heures, puis retirez les lamelles sous l’eau déminéralisée. Lavez les lames de gel PA avec de l’eau dans de grands bocaux Coplan pendant la nuit. Pour éliminer les acrylamides non réactifs le lendemain, séchez les lames jusqu’à ce que le gel PA durcisse complètement.

Les lames peuvent ensuite être stockées à quatre degrés Celsius pendant un mois dans une boîte à lames scellée. Pour commencer, une chambre en plastique est installée pour entourer le réseau imprimé à partir d’une diapositive à deux chambres. Retirez les chambres et coupez-les en deux avec une lame de rasoir.

À l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre, appliquez une fine perle de silicone d’aquarium sur le bord d’une chambre et pressez-la sur la surface d’un réseau Emmy. Évitez de toucher le silicone à une partie quelconque des caractéristiques de l’ensemble. Il est crucial d’assurer une bonne fixation des baleines culturelles à la matrice Emmy, car les péria permettent aux baleines de s’échapper des chambres, ce qui peut entraîner une mort cellulaire généralisée.

Pour les lames revêtues de PDMS, bloquez les lames en les incubant dans du F 108 alique 1 % onique pendant 15 minutes sous vide pour l’un ou l’autre type de gel, rincez les matrices avec des milieux de culture cellulaire avec des antibiotiques trois fois pendant cinq minutes par lavage. Cela élimine les monomères non réactifs, qui peuvent être toxiques pour les cellules dans le cas des gels PA. Après le troisième lavage, laissez reposer 30 minutes supplémentaires dans le milieu pour réhydrater le gel.

Placez maintenant quatre à cinq matrices dans une boîte de Pétri stérile de 15 centimètres. Dans le plat, ajoutez la moitié du volume final du milieu avec les cellules d’intérêt à la concentration requise pour leur application. Les puces d’EM doivent être placées dans un incubateur approprié pour le maintien du type de cellule utilisé.

Vérifiez la fixation uniforme des cellules aux caractéristiques imprimées au microscope toutes les 15 à 20 minutes pendant l’observation. Secouez doucement les réseaux ME pour distinguer les cellules attachées et flottantes. Le temps de fixation varie, mais il est généralement terminé en deux heures sur un réseau ME codé PA.

Une fois que la saturation de l’attachement ou une limite de temps a été atteinte, aspirez les cellules non liées et remplissez la parabole jusqu’au volume final sur des réseaux ME revêtus de PDMS. L’ablation de tous les milieux tuera les cellules. Ainsi, pour tous les changements de support sur ces diapositives, remplacez successivement la moitié du volume du support, puis remplissez la parabole avec le volume final.

La culture peut se poursuivre pendant plusieurs jours avec des changements normaux de substrat. Les fixateurs courants tels que le paraform, l’aldéhyde et le méthanol-acétone sont compatibles avec les systèmes Emmy Array. N’oubliez pas que même lors de la coloration d’un revêtement PDMS, les matrices ME doivent rester humides.

Continuez donc avec la technique de remplacement d’un demi-volume pour préparer des lames des réseaux d’EM colorés. Utilisez une lame de rasoir pour retirer les chambres et montez les lamelles à l’aide de la flore. La protéine Mount G a été déposée sur une matrice ME imprimée codée PDMS à l’aide de broches en silicium à pointe carrée sur une goupille de plume.

Le dépôt de diverses protéines par robot d’impression de microréseaux a été vérifié par immunofluorescence à l’aide d’anticorps. Les dilutions des solutions protéiques dans la plaque maîtresse reflétaient la quantité qui se déposait sur les cellules de surface des substrats d’impression attachées aux caractéristiques imprimées de manière évidente. De même, le même schéma évident de fixation des cellules se produit lorsqu’un tableau Emmy est imprimé sur une échelle de 40 000 passes.

Les deux protéines du microenvironnement du gel PA ont induit des profils d’expression de kératine dépendants de la concentration dans une lignée cellulaire progénitrice épithéliale mammaire multipotente humaine. Le rapport logarithmique des signaux de kératine huit par rapport aux signaux de kératine 14 illustre la variation et la reproductibilité du signal. Après 24 heures de culture, les cellules non liées sont emportées dans une analyse de 12 matrices de me.

Une analyse statistique standard a été utilisée pour déterminer si les différentes dilutions du collagène de type 1 et de la p cadhérine humaine recombinante modifient l’expression de la kératine. Initialement, il n’y avait pas de variation par rapport à la moyenne entre les cellules sur les caractéristiques juste après l’attachement. Cependant, après 24 heures, des concentrations élevées de collagène de type 1 ont induit une expression significativement plus élevée de la kératine huit.

Alors que des concentrations élevées de PCA ont suscité un fort signal de kératine 14. Ce résultat est cohérent avec les rapports précédents sur les cellules progénitrices à mémoire bipotentes. En raison de la nature dynamique et réciproque de ces interactions avec les microenvironnements cellulaires, ces cellules peuvent elles-mêmes modifier la composition des microenvironnements imprimés.

Par conséquent, pour comprendre les impacts aigus des microenvironnements que vous avez imprimés, le temps d’exposition ne doit pas dépasser 48 heures après cette procédure. Tout processus théorique qui peut être mesuré, par fluorescence ou par inhalation, peut être un atout en fonction du microenvironnement afin de répondre à des questions supplémentaires telles que : comment différents microenvironnements modifient-ils les réponses aux médicaments dans les lignes cancéreuses ? C’est majeur par des changements dans la ptose et la prolifération.

Ou comment les microenvironnements modifient-ils la différenciation des progéniteurs.