이분자 형광 보완의 유세포 분석 : 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 높은 처리량 정량 방법

이 절차의 전반적인 목표는 ACAP LBC와 PDE 4 D 3의 상호 작용 사이트를 매핑하는 것입니다. 유세포 분석을 사용하여 biomolecular, fluorescence, complementation 또는 BC의 평균 형광 강도를 측정합니다. 이를 위해 세포는 형광 리포터 단백질의 N 또는 C 말단 부분에 융합된 ACAP LBC 및 PDE 4개의 D 3 단편으로 transfection됩니다.

그런 다음 Venus Flow cytometry를 수행하여 단백질 단편이 Venus와 상호 작용하고 형광이 완료되고 형광이 이루어지면 형광을 평가합니다. 단백질 단편이 상호 작용하지 않으면 형광이 검출되지 않습니다. 상대적인 단백질 발현 수준을 결정하기 위해 무료 서양 혈액 분석이 수행됩니다.

그런 다음 단백질 단백질 상호 작용의 강도를 단백질 발현 수준에 따라 YFP 평균 형광 강도를 정규화하여 계산합니다. 결과 데이터는 ACAP LBC에 대한 PDE(43)의 결합이 PDE(43) 내의 여러 영역, 주로 상류 보존 영역 1 또는 UCR 1을 통해 매개됨을 나타낸다. 현미경을 사용한 co-immunoprecipitation(공동면역침전) 및 BP C와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 상대적으로 간단하고 민감하며 많은 수의 세포를 신속하게 스크리닝할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 단백질-단백질 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 약물 발견을 위해 단백질-단백질 상호 작용을 조절하는 요인을 스크리닝하는 데에도 사용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 선형 B 응답을 결정해야 하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 구성의 발현은 결과가 서로 다른 단백질 단편을 비교할 수 있도록 유사해야 합니다.

여기에 기술된 실험에서, 세포는 YFP 유도체의 N 말단 단편, 전체 길이 ACAP LBC에 융합된 금성 및 다음 중 하나에 융합된 금성의 C 말단 단편, 전장 PDE E 43, 상류 보존 영역 1 UCR PDE E43 중 하나 또는 상류 보존 영역 2 플러스 촉매 영역 UCR R 2 및 PDE 43의 CAT로 형질주입 전날 에 요람 형질주입 6. 음, 조직 배양 플레이트는 웰 당 5 번째 HEC 2 9 3 T 세포에 1.2 배 10을 파종하여 2 밀리리터의 완전한 성장을 이룹니다. 중간 종자, 3개의 대조군 우물 및 각 테스트에 대한 3개의 우물.

Cotran은 하룻밤 동안 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소에서 배양합니다. 다음날에는 BS C 구조체를 마커로 transfection한 BC plasma DNA 구조체 및 CFP 벡터의 transfection을 준비합니다. 각 조건에 대해 250마이크로리터의 Optum M1 무혈청 배지에 적절한 양의 DNA를 추가합니다.

멸균 튜브에서 하나의 튜브는 3개의 웰을 transfection하기에 충분합니다. 그런 다음 희석된 DNA 혼합물에 3마이크로리터의 운송 LT, 1마이크로그램당 1개의 시약을 추가하고 부드럽게 피펫으로 혼합하여 실온에서 30분 동안 배양합니다. 250 마이크로 리터의 형질 주입 혼합물에서 세포로 적가한 후 섭씨 37도, 24 시간 동안 5 % 이산화탄소에서 배양한다.

epi 형광 현미경에서 transfection check 형광을 확인한 후 세포는 BC 신호에 대해 노란색 형광을 발현하고 형질 주입 효율을 보고하기 위해 CFP 형광을 발현해야 합니다. 유세포 분석을 위해 세포를 준비하려면 먼저 2ml의 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 세척한 다음 섭씨 37도에서 2-5분 동안 250마이크로리터의 0.05% 트립신을 배양하여 세포를 분리합니다. 그런 다음 현미경을 사용하여 세포 박리를 확인합니다.

세포가 분리되면 1ml의 DMEM으로 트립신을 중화합니다. 다음으로, 1ml의 세포를 하나의 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴 다음 0.25ml의 세포를 두 번째 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 치즈 500개에서 튜브를 5분 동안 돌립니다.

250 μL 샘플은 유세포 분석을 위해 추가 처리됩니다. 서양 혈액 분석을 위해 1mL 샘플을 얼음 위에 따로 보관하고, 스핀 Resus를 수행한 후 병렬로 수행해야 합니다. 250 마이크로 리터의 팩스 버퍼에 세포를 현탁시키고 얼음 세포에 놓으십시오 : 세포는 PBS의 1 % 파라 폼 알데히드로 고정 할 수도 있습니다 : 유세포 분석이 즉각적이지 않은 경우, 488 나노 미터, 405 나노 미터 및 642 나노 미터 고체 상태 레이저가 장착 된 DP 인 Beckman Coulter cyan을 사용하여 유세포 분석을 수행합니다 summit 소프트웨어는 표준 비드를 사용하여 유세포 분석기를 보정 한 후 수집 및 분석에 사용됩니다. 선형 스케일에서 전방 산란 또는 FSC 대 측면 산란 SSC를 플롯하고 살아있는 세포 집단에서 보행합니다.

다음으로, 응집되지 않은 살아있는 세포 집단에 대한 전압 펄스 폭 및 보행에 대한 SSC를 플롯합니다. 그런 다음 405 FL에서 CFP 형광과 CFP 형광을 비교하여 선형 스케일로 플롯하고, 이 기기에서 로그 스케일로 표시하고, 응집되지 않은 살아있는 CFP 양성 세포에서 보행을 합니다. 마지막으로, 488나노미터 FL에서 선형 스케일로 FSC와 YFP 형광을 플롯하고 이 기기에서 로그 스케일로 플롯하여 BC 강도를 시각화합니다.

그런 다음 Y-F-P-C-F-P 이중 네거티브 샘플을 실행하고 F-S-C-S-C FL 1 및 FL 6 광 증배관 또는 PMT 전압을 조정하여 각 신호의 임계값을 설정합니다. 다음으로, 향후 오프라인 보상을 위해 YFP 및 CFP 단일 양성 샘플을 모두 실행합니다. 최소 10, 000개의 게이트 이벤트를 획득해야 합니다.

마지막으로, 데이터 수집 후 실험 샘플에 대한 데이터를 수집합니다. 살아 있는 세포에 대한 FS CSC 점도표에서 게이트 1을 사용하여 전파하여 획득에 따라 분석 프로토콜을 설정합니다. 응집되지 않은 살아있는 세포에 대한 게이트 1의 점도표가 있는 FSC 펄스의 게이트 2 및 응집되지 않은 ccfp 양성 살아있는 세포에 대한 게이트 2의 ccfp FSC 점도표의 게이트 3.

YFP 및 CFP 단일 양성 세포를 사용하여 Y fp CFP 점도표에서 YFP 및 CCFP 신호를 보상한 후 CFP 및 YFP 양성 세포에 대한 컷오프 라인을 결정합니다. CFP 양성 세포의 YFP 평균 형광 강도 또는 MFI를 데이터 플로팅을 위해 Excel로 내보낸 다음 Excel에서 Y-F-P-M-F-I를 ACAP LBC PDE E 43 및 웨스턴 블로팅에 의해 결정된 로딩 제어 알파 튜불린의 발현 수준으로 정규화하여 YFP 평균 형광 강도의 선형 범위를 결정합니다. CFP는 HEC 2 93 세포에서 VN ACAP L BBC 및 다양한 양의 VC PDE E 43으로 간이 침대에 transection하고 이 비디오에 설명된 대로 bif 유세포 분석을 사용하여 상호 작용을 평가했으며, 이 플롯은 VC PDE E 43 형질 주입의 함수로서 VC PDE E 43의 발현에서 상대적인 접힘 변화를 보여줍니다.

파란색 사각형으로 표시된 CFP 양성 세포에서 금성의 평균 형광 강도는 VCDE 43 발현과 상관관계가 있었으며 빨간색 삼각형으로 표시된 서쪽 블롯의 이미지 분석에 의해 결정된 발현 수준과 일치했습니다. 녹색 사각형으로 표시된 바와 같이 샘플에서 유사한 CFP 평균 형광 강도가 관찰되었으며 세포 변이를 제한하기 위한 음성 대조군으로 사용되었습니다. 이러한 결과는 BS e의 평균 형광 강도를 측정하여 ACAB LB C PDE 43 상호 작용을 정량화하기 위한 유세포 분석의 사용을 검증하는 동시에 PDE E 43 BIC 분석 내에서 ACAP LBC 결합 부위를 매핑하기 위해 스크리닝에 사용되는 BIC 구성의 적절한 양을 결정합니다.

PDE 43의 UCR 1 영역과 PDE 43의 UCR 1 영역과 PDE 43의 CAT 영역은 여기에서 볼 수 있듯이 이 방법을 사용하여 평가되었습니다. vn ACAP LBC 및 VC PDE 43 UCR two plus CAT의 발현은 VC PDE 43 FL 및 VC PDE 43 UCR과 비교할 때 BC 신호가 더 낮았으며, 모든 유동 샘플에서 하나의 유사한 단백질 발현이 관찰되었으며 평균 형광은 ACAP LBC PDE 43 및 알파 튜불린의 상대 발현 수준으로 정규화되었습니다. 따라서 정규화된 B-C-M-F-I는 ACAP LBC PDE 43 FL과 ACAP LBC PDE 43 UCR R one 사이의 형광 강도에 차이가 없지만 ACAP LBC PDE 43 UCR 2 플러스 CAT 상호 작용에 대해서는 훨씬 낮은 신호를 나타냅니다.

이러한 결과는 PDE 43에 ACAP LBC와 상호 작용하는 여러 영역이 있으며 PDE 43 UCR R one이 ACAP LBC와 상호 작용하는 주요 영역임을 시사합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 BP C의 유세포 분석 분석을 통해 단백질, 단백질 상호 작용을 연구하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.이 절차를 시도하는 동안 유사한 단백질 발현 및 선형 BP C 반응을 얻는 데 사용되는 BP C 구조체의 정확한 양을 결정하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 펩타이드 또는 위험과 같은 다른 방법을 수행하여 PDE 40 D 3 내의 어떤 아미노산이 원인인지 확인할 수 있습니다.

ACAP RBC 상호 작용.