Name: Een gevoelige en specifieke kwantificering Methode voor het bepalen van Serum cardiale myosine bindend eiwit C door elektrochemiluminescentie-Immunoassay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-08T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Leer een gevoelige elektrochemiluminescentie-immunoassay voor het kwantificeren van cardiale myosine-bindend eiwit C en troponine I in serum. Deze methode verbetert de diagnose van myocardinfarct in klinische settings.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd gefinancierd door de National Institutes of Health beurzen R01HL105826 en K02HL114749 (Dr Sadayappan), en de American Heart Association Midwest Fellowships; 11PRE7240022 (Mr Barefield) en 13POST14720024 (Dr Govindan). De auteurs zeer erkentelijk voor de hulp van Dr Jimmy Page, Jill Clampit en Dr John Hudson, MSD, voor hun uitstekende technische en literatuur ondersteuning bij de ontwikkeling van de test.

1. Uniplex cMyBP-C Assay <ol><li> De dag voor het experiment, de vacht van de 96-well MSD kale standaard plaat met invangantilichaam. Voor cMyBP-C is een 30 gl volume van muizen monoklonaal anti-cMyBP-C-antilichaam (gelatinevrije) bij een concentratie van 5 ug / ml verdund in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Omdat het goed is hydrofoob, pipet de oplossing in de rechter benedenhoek van de put; tik op de zijkanten van de plaat aan de oplossing over de gehele goed verspreid. </li><li> De plaat is bedekt met een plaat sealer en gedurende O / N bij 4 ° C zonder schudden. </li><li> Verwijder de invangantilichaam oplossing door te tikken op de oplossing uit over een wastafel en vervolgens op een stapel papieren handdoeken. Niet-specifieke binding aan de plaat wordt door toevoegen van 150 pi van een 5% (w / v) blocker A (hoogwaardig BSA) oplossing in PBS aan elk putje. </li><li> Sluit de plaat en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder schudden bij 700 rpm. </li><li> Tijdens de blokkering stap, de voorbereiding van de normen en samples. Voeg de standaardreeks door verdunning recombinant cMyBP-C proteïne fragment (aminozuren 1-271) een beginconcentratie van 2,000 ng / ml in 1% (w / v) blocker A / PBS. Vervolgens serieel verdund met een factor 5 in 1% (w / v) blocker A / PBS. Totaal 7 normen + 1 blank (1% (w / v) blocker A / PBS alleen) gebruikt. </li><li> Verwijder de blokkering oplossing en was de plaat 3x met 150 pi 0,05% (v / v) Tween-20/PBS. Elke keer, verwijder de wasoplossing door het omkeren van de plaat boven een gootsteen. Na de derde wasstap, krachtig flick de plaat over een wastafel en dep de plaat krachtig op een laag van papieren handdoeken totdat het volledig droog is. Dit is een cruciale stap, zoals volumes incubatie klein, en de overgebleven wasoplossing de volgende incubatie sterk verdunnen. </li><li> Pipetteer 25 ul van standaarden en monsters in de putjes. Sluit de plaat en incubeer bij kamertemperatuur onder schudden bij 700 rpm gedurende 1 uur. </li><li> Bereid de detectieantilichaam oplossing bij 1 ug / ml in 1% blocker A / PBS. A custom gemaakt cMyBP-C-antilichaam (epitoop aminozuren 2-14) met MSD SULFO-TAG etikettering dient als de detectie antilichaam. Kits zijn beschikbaar voor SULFO-TAG etikettering, waardoor het een relatief eenvoudige procedure om het etiket elk antilichaam. </li><li> Herhaal de wasstap zoals beschreven in stap 1.4. </li><li> Voeg 25 ul van detectieantilichaam oplossing in elk putje, sluit de plaat en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur op een plaat schudder ingesteld op 700 rpm. </li><li> Tijdens de incubatieperiode, draaien MSD&#39;s demo-plaat (plaat met LED-verlichting) voor een goede werking van de sector Imager en software (zie paragraaf reagens) zorgen. Ook verdunnen read-buffer, die wordt verzorgd door MSD, door toevoeging van 5 ml van 4x lees-buffer en 15 ml gedestilleerd water. </li><li> Herhaal de wasstap zoals beschreven in stap 1.4. </li><li> Voeg 150 ul van lees-buffer aan elk putje met behulp van een multichannel pipet. Zorg ervoor dat u luchtbellen (reverse pipetteren is een geschikte methode) te vermijden. Na toevoeging van de lees-buffer onmiddellijk de plaat in de sector scannenImager. </li></ol> 2. 3-plex cMyBP-C, CK-MB en troponine Assay <ol><li> Een 96-well plaat 3-plex en verdunningsmiddel oplossingen equilibreren tot kamertemperatuur vóór gebruik. Deze plaat is pre-coated met capture antilichamen voor cMyBP-C, CK-MB en troponine door MSD. </li><li> Voeg 25 ul van 1% (w / v) blocker A / PBS aan elk putje. Tik op de zijkanten van de plaat om ervoor te zorgen dat het gehele goed wordt gedekt door oplossing. </li><li> Seal de plaat met een plaatafdichter, plaatst u de plaat op een bord shaker en schud bij 700 rpm gedurende 30 minuten. </li><li> Intussen wordt een verdunningsreeks van afzonderlijke bereide kalibrators. Want elk heeft ook drie invangantilichamen drie ijkpunten moeten worden gemengd en serieel verdund vóór gebruik. Verdun recombinant cMyBP-C, CK-MB (MSD) en troponine (MSD) samen in 1% (w / v) blocker A / PBS om een ​​monster te maken met 2000 ng / ml cMyBP-C, 100 ng / ml CK- MB, en 25 ng / ml cTnI (monster A). </li><li> Een eindvolume van ten minste 100 pi bereid voor elke standaard. Naarvullen de standaard serie, serieel verdunnen de monsters met een factor 5. Gebruik 25 gl monster A in 100 gl 1% (w / v) blocker A / PBS monster B. maken dan gebruik van 25 gl monster B in 100 pl 1% (w / v) blocker A / PBS om monster C creëren , enzovoort. Menselijk serum monsters van 16 patiënten met MI en 16 controlepersonen werden gebruikt om cMyBP-C, CK-MB en troponine niveaus te meten. Deze monsters werden 2x verdund in 1% (w / v) blocker A / PBS. </li><li> Voeg 25 ul van de verdunde monsters en standaarden om de 25 ul reeds in de putjes van de 3-plex plaat. Het is belangrijk ook een blanco (alleen verdunningsmiddel) bevatten. Om de techniek vast te stellen, worden monsters geladen in technische drievoud. Anders duplicaten voldoende. </li><li> Weer sluiten, de plaat (plaatafdichter kunnen worden hergebruikt) en incubeer op een bord shaker (700 rpm) bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. </li><li> Vlak voor de incubatie is voltooid, wordt het detectie-antilichaam oplossing bereid. Het verdunningsmiddel is 1% (w / v) blocker A in PBS. Alle three SULFO-gemerkte detectie-antilichamen worden samen verdund tot een eindconcentratie van 1 ug / ml elk. Detectie antilichamen worden meestal verzorgd op een 50x voorraad concentratie. </li><li> Voor een volledige 96-well plaat, is 2.700 gl totale verdunde oplossing nodig (met pipetteren fout inbegrepen). Voeg 54 ul van elke detectieantilichaam 2,538 gl 1% (w / v) blocker A / PBS. </li><li> Na 2 uur, verwijder oplossingen door krachtig te vegen het bord boven een gootsteen. Was de putjes 3x met 150 ul 0.05% Tween-20 in PBS. Voeg 25 ul van detectieantilichaam oplossing in elk putje met een multichannel pipet en de zijkanten van de plaat worden onttrokken om aan dat de gehele put onder oplossing. </li><li> Seal de plaat en incubeer gedurende 1 uur onder schudden bij 700 rpm. </li><li> Tijdens de incubatieperiode, draaien MSD&#39;s demo-plaat (plaat met LED-verlichting) voor een goede werking van de sector Imager en software garanderen. Ook verdunnen de lees-buffer, die wordt verzorgd door MSD, door toevoeging van 5 ml van 4x lezenbuffer op 15 ml gedestilleerd water. </li><li> Herhaal de wasstap in stap 2.8 beschreven. </li><li> Voeg 150 ul van lees-buffer aan elk putje met behulp van een multichannel pipet. Het vermijden van luchtbellen is kritisch (omgekeerd pipetteren een geschikte werkwijze). Na toevoeging van de lees-buffer, meteen de plaat in de sector Imager scannen. </li></ol>

<ol><li>Thygesen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third+universal+definition+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Third universal definition of myocardial infarction.</a> Eur. Heart J. 33, 2551-2567 (2012).</li>
<li>Leng, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+and+multiplex+technologies+for+cytokine+measurement+in+inflammation+and+aging+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gerontol.+A.+Biol.+Sci.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research.</a> J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63, 879-884 (2008).</li>
<li>Thompson, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+electrochemiluminescence+wash+and+no-wash+immunoassays+for+detection+of+serum+antibodies+to+smooth+Brucella+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Competitive electrochemiluminescence wash and no-wash immunoassays for detection of serum antibodies to smooth Brucella strains.</a> Clin. Vaccine Immunol. 16, 765-771 (2009).</li>
<li>Kingsmore, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+measurement%3A+technologies+and+applications+of+protein+and+antibody+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug.+Discov%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 5, 310-320 (2006).</li>
<li>Altan, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long-acting+tumor+necrosis+factor+alpha-binding+protein+demonstrates+activity+in+both+in+vitro+and+in+vivo+models+of+endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">A long-acting tumor necrosis factor alpha-binding protein demonstrates activity in both in vitro and in vivo models of endometriosis.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 334, 460-466 (2010).</li>
<li>Patel, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+cytokine+detection+in+acute+coronary+syndrome+reveals+up-regulation+of+interferon+gamma+and+interleukin-10+post+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">High sensitivity cytokine detection in acute coronary syndrome reveals up-regulation of interferon gamma and interleukin-10 post myocardial infarction.</a> Clin. Immunol. 133, 251-256 (2009).</li>
<li>Fu, Q., Zhu, J., Van Eyk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+multiplex+immunoassay+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparison of multiplex immunoassay platforms.</a> Clin. Chem. 56, 314-318 (2010).</li>
<li>Mahajan, V. S., Jarolim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+interpret+elevated+cardiac+troponin+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">How to interpret elevated cardiac troponin levels.</a> Circulation. 124, 2350-2354 (2011).</li>
<li>Govindan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+myosin+binding+protein-C+is+a+potential+diagnostic+biomarker+for+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac myosin binding protein-C is a potential diagnostic biomarker for myocardial infarction.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 52, 154-164 (2012).</li>
<li>Barefield, D., Sadayappan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+and+function+of+cardiac+myosin+binding+protein-C+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation and function of cardiac myosin binding protein-C in health and disease.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 48, 866-875 (2010).</li>
<li>Kuster, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+myosin+binding+protein+C+phosphorylation+in+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Muscle+Res.+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Cardiac myosin binding protein C phosphorylation in cardiac disease.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 43-52 (2012).</li>
<li>Sadayappan, S., de Tombe, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+myosin+binding+protein-C%3A+redefining+its+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cardiac myosin binding protein-C: redefining its structure and function.</a> Biophys. Rev. 4, 93-106 (2012).</li>
<li>Sadayappan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+myosin+binding+protein-C%3A+a+potential+early-stage%2C+cardiac-specific+biomarker+of+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Med%22%5BJournal%5D)">Cardiac myosin binding protein-C: a potential early-stage, cardiac-specific biomarker of ischemia-reperfusion injury.</a> Biomark Med. 6, 69-72 (2012).</li>
<li>Fichorova, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+technical+variables+affecting+immunoassay+recovery+of+cytokines+from+human+serum+and+simulated+vaginal+fluid%3A+a+multicenter+study%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biological and technical variables affecting immunoassay recovery of cytokines from human serum and simulated vaginal fluid: a multicenter study.</a> Anal. Chem. 80, 4741-4751 (2008).</li>
<li>Malekzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+multi-plex+and+mono-plex+platforms+for+the+discovery+of+inflammatory+profiles+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Challenges in multi-plex and mono-plex platforms for the discovery of inflammatory profiles in neurodegenerative diseases.</a> Methods. 56, 508-513 (2012).</li>
</ol>

Een volledige octrooiaanvraag is in behandeling (met serienummer 13/464, 466, Pub No US 2012/0282618 A1 en Datum:. 05/04/12) aan de risicofactoren die samenhangen met cMyBP-C degradatie en het vrijkomen in het menselijk lichaam vocht vast en kwantificeren van het niveau van cMyBP-C in menselijke lichaamsvloeistof.

In deze studie tonen we de toepassing van een multiplex immunoassay voor de detectie van meerdere cardiale biomarkers in serum van patiënten. Deze techniek heeft vele voordelen ten opzichte van traditionele ELISA. Eerst ECL in de testkit wordt gebruikt in plaats van colorimetrische detectie. In ECL, een elektrisch signaal stimuleert de lokale productie van de gemeten eigenschap (licht), waardoor het ontkoppelen van de stimulatie gebeurtenis het signaal, waarbij die 14 vermindert. Dit maakt hoge gevoeligheid, ...

Het meten van lage hoeveelheden eiwit in complexe biologische monsters, zoals serum, wordt steeds klinisch belang voor patiëntbehandeling, alsmede fundamentele wetenschap. Bijvoorbeeld, een de serumniveaus van cardiale biomarkers, zoals troponine I, in een klinische setting is met acuut myocardiaal infarct (MI) 1. Om eiwitten in serummonsters detecteren standaard enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is de meest gebruikte techniek omdat het hogere gevoeligheid en maakt absolute kwantificering van de analyt. Echter, traditionele ELISA een betrekkelijk grote hoeveelheid monster (meestal 100 pl), hoge achtergrondsignaal in sommige biologische vloeistoffen, en zijn beperkt tot het meten van slechts een analyt per ELISA 2. Onlangs werd een nieuwe immunoassay techniek leidt dat veel van deze nadelen omzeilt. Deze gemodificeerde test, ontwikkeld door MSD, gebruikt electrochemiluminesclingen (ECL) voor signaaldetectie, die zorgt voor een zeer lage achtergrond en een verhoogde gevoeligheid, waardoor het gebruik van kleine monstervolumes. Electrochemiluminescence is gebaseerd op het reportermolecuul ruthenium (II) trisbipyridal, die is bevestigd aan de detectie-antilichamen. Het reportermolecuul zendt licht bij 620 nm van de elektrische stimulatie van de bodem van de 96-well plaat die koolstof elektroden geïntegreerd in deze 3 heeft. Ook, door spot coating, verschillende capture antilichamen kunnen worden aangebracht in een putje (tot 10 op een 96-well plaat), waardoor gelijktijdige kwantificering van verschillende eiwitten in een monster 4. Deze techniek Onlangs is een pro-inflammatoire cytokine profielen 5,6 serum meten. De multiplex platen van MSD gunstig in vergelijking met andere multiplex assay platformen 7. Met behulp van MSD als de primaire-test platform, hebben we verder een op maat gemaakte 3-plex plaat ontwikkeld dat cEen gelijktijdig kwantificeren van het niveau van cardiale myosine bindend eiwit C (cMyBP-C), creatine-kinase MB (CK-MB) en cardiaal troponine I (cTnI) en de resultaten werden vergeleken met monoplex detectie van cMyBP-C. CK-MB en troponine zijn gevestigde biomarkers voor MI. Echter, toename van deze biomarkers worden veroorzaakt door andere dan MI pathologieën, zoals myocarditis of nierfalen 8. Dit pleit voor het toevoegen van extra biomarkers om de specificiteit van de MI diagnose te verhogen. We hebben onlangs aangetoond dat cMyBP-C is ook een potentiële biomarker voor MI 9. cMyBP-C is een dikke filament geassocieerd eiwit dat tot expressie gebracht in het hart, 10-12 maar niet in skeletspieren en gladde spieren. Dus het verhoogde niveau van cMyBP-C in de bloedsomloop is een specifieke indicator van hartschade 13. In deze studie vergeleken we Uniplex detectie van cMyBP-C met behulp van een aangepaste 3-plex assay voor serumniveaus van metencMyBP-C, CK-MB en troponine in het serum van patiënten met MI. In de toekomst zou deze handtekening techniek worden gebruikt om MI te diagnosticeren bij patiënten met pijn op de borst in de spoedafdeling. De instelling Review Board (IRB) van de Loyola University Chicago ingestemd met de studie voor het gebruik van deidentified menselijke populaties en het gebruik van de immunoassay (LU # 20392).

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>MSD Read-Buffer T (4X) met oppervlakteactieve stof</td><td>Meso Scale Discovery</td><td>R92TC-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Acros</td><td>9005-64-5</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MSD Blocker A</td><td>Meso Scale Discovery</td><td>R93BA-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing, 10X</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP399-4</td><td>Filter voor gebruik</td></tr><tr><td>Myosine binding eiwit C antilichaam, muis monoklonaal (E7), gelatine vrij</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-137180L</td><td>Voor coating, antilichaam moet gelatine vrij zijn</td></tr><tr><td colspan="4">Platen en apparatuur</td></tr><tr><td>Multi-Array 96-well standaard plaat</td><td>Meso Scale Discovery</td><td>L15XA-3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Een prototype 3-plex, vier-spot, 96-well plaat met cMyBP-C, cTnI en CK-MB</td><td>Meso Scale Discovery</td><td>N452A-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ThermaSeal sealing film</td><td>Life Science Products Inc.</td><td>ST-3098</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MSD SECTOR Imager 2400A</td><td>Meso Scale Discovery</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MTS 2/4 digitale microtiter shaker</td><td>IKA</td><td>3208001</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

een gevoelige en specifieke kwantificering methode voor het bepalen van serum cardiale myosine bindend eiwit c door elektrochemiluminescentie-immunoassay

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers worden steeds belangrijker in de klinische besluitvorming, evenals fundamentele wetenschap. Diagnose van myocardiaal infarct (MI) wordt grotendeels bepaald door het detecteren van cardiaal-specifieke eiwitten in serum of plasma van patiënten als indicator van myocardiale schade. Onlangs hebben aangetoond dat cardiale myosine bindend eiwit C (cMyBP-C) detecteerbaar is in het serum na MI, hebben we voorgesteld als potentiële biomarker voor MI. Biomarkers worden typisch gedetecteerd door traditionele sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. Deze techniek vereist een groot monstervolume, een klein dynamisch bereik, en kan slechts een eiwit meten tegelijk. Hier laten we een multiplex immunoassay waarbij drie cardiale eiwitten gelijktijdig worden gemeten met een hoge gevoeligheid. Meten cMyBP-C in Uniplex of samen met creatine kinase MB en troponine I toonde vergelijkbare gevoeligheid. Deze techniek maakt gebruik van de Meso Scale Discovery(MSD) methode van multiplexen in een 96-wells plaat in combinatie met electrochemiluminescence voor detectie. Terwijl slechts kleine steekproef volumes nodig zijn, worden hoge gevoeligheid en een groot dynamisch bereik gerealiseerd. Met deze techniek, hebben we gemeten cMyBP-C, creatine kinase MB, en cardiale troponine I niveau in het serum monsters van 16 patiënten met MI en vergeleken de resultaten met 16 controlepersonen. We waren in staat om alle drie de markers te detecteren in deze monsters en vond alle drie biomarkers worden verhoogd na MI. Deze techniek is daarom geschikt voor de gevoelige detectie van cardiale biomarkers in serummonsters.

De basisprincipes en workflow van de 3-plex assay worden getoond in figuur 1, en ​​de algehele werkstroom wordt beschreven in Tabel 1. Uniplex assays werken volgens hetzelfde principe, behalve dat de gehele onderkant goed bekleed met een capture-antilichaam. Signaaldetectie uitgevoerd door ECL waarbij een elektrisch signaal wordt toegevoerd aan de bodem van de put. Dit op zijn beurt, initieert een lokale productie van licht door een chemische reactie van de lees-buffer met SULFO TAG-lab...

Het meten van biomarkers in complexe biologische monsters wordt in toenemende mate leidend klinische besluitvorming. We beschrijven een zeer gevoelige methode voor het gelijktijdig meten cardiale myosine bindend eiwit C, creatine kinase MB, troponine I en in serummonsters van patiënten met myocardiaal infarct en gezonde controlepersonen.

Een gevoelige en specifieke kwantificering Methode voor het bepalen van Serum cardiale myosine bindend eiwit C door elektrochemiluminescentie-Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

Het algemene doel van deze procedure is om cardiaal myosin-bindend eiwit C en cardiaal troponine I gelijktijdig te kwantificeren in serummonsters. Dit wordt bereikt door eerst een 96-wells plaat te coaten met cardiaal myosin-bindend eiwit C-antilichamen voor een plex-assay, of door gebruik te maken van een vooraf gecodeerde threeplex-assay. In de tweede stap worden de gecoate platen geïncubeerd met calibratoren en serummonsters.In de laatste stap worden vervolgens gelabelde detectie-antilichamen toegevoegd, waarna een chemiluminescentiesignaal wordt gegenereerd dat door de platreader wordt gedetecteerd. Uiteindelijk kunnen de concentraties van de cardiace eiwitten van belang in serummonsters worden bepaald via single- of multiplex-immunoassays. Pipetteer de dag vóór het experiment 30 µL gelatinevrij muis monoklonaal anti-cardiac myosin binding protein C antilichaam in de onderste hoek van elke well van een 96 Well Meso Scale Discovery bare standard plate.Tik vervolgens tegen de zijkanten van de plaat om de antilichaamoplossing over de bodem van elke well te verspreiden. Incubeer de plaat na het afsluiten gedurende de nacht bij vier graden Celsius zonder te schudden. Tik de volgende ochtend de oplossing af in een gootsteen en vervolgens op een stapel papieren handdoeken.Voeg vervolgens 150 µL van 1% blocker A in PBS toe aan elke put om aspecifieke binding te blokkeren. Incubeer de afgesloten plaat gedurende één uur bij kamertemperatuur onder schudden bij 700 RPM tijdens de blokkeringsstap; verdun het recombinante fragment van cardiac myosin binding protein C tot een beginconcentratie van 2000 ng/mL in 1% blocker A in PBS. Voer vervolgens een seriële verdunning van deze oplossing uit met een factor vijf voor een totaal van zeven standaarden.Verwijder nu de blokkeringsoplossing zoals zojuist gedemonstreerd en was de plaat vervolgens drie keer met 150 µL 0,05% Tween 20 in PBS. Schud de plaat na de derde wasbeurt krachtig boven een gootsteen en dep de plaat vervolgens stevig op een laag keukenpapier tot deze volledig droog is. Pipetteer daarna 25 µL van elke standaard en elk monster in de juiste wells.Terwijl de afgesloten plaat een uur bij kamertemperatuur op de schudmachine incubeert, wordt het op maat gemaakte, met sul oag gelabelde detectieantilichaam tegen cardiaal myosin-bindend eiwit C verdund tot 1 µg/mL in 1% blocker A in PBS. Nadat de plaat zorgvuldig is gewassen zoals zojuist gedemonstreerd, worden 25 µL van de detectieantilichaamoplossing aan elke well toegevoegd; vervolgens wordt de afgesloten plaat een uur bij kamertemperatuur geïncubeerd onder constant schudden. Voer tijdens deze incubatieperiode de demoplaat uit met LED-verlichting om de juiste werking van de sector imager en de software te controleren; verdun op dit moment ook de Reid Buffer. Nadat de plaat zorgvuldig is gewassen zoals eerder gedemonstreerd, wordt een meerkanaalpipet gebruikt om 150 µL Reid Buffer aan elke well toe te voegen, waarbij luchtbellen zorgvuldig worden vermeden. Scan de plaat daarna onmiddellijk in de sector imager voordat de threeplex-assay wordt gestart.Laat de 96-wells threeplex-plaat en de verdunningsoplossingen acclimatiseren naar kamertemperatuur. Voeg vervolgens 25 µL 1% blocker A in PBS toe aan de plaat, waarbij u er zeker van bent dat de gehele well is bedekt met de oplossing, en incubeer de afgesloten plaat 30 minuten bij kamertemperatuur onder schudden. Verdun ondertussen recombinant cardiac myosin binding protein C, CK-MB en cardiac troponin I samen in 1% blocker A in PBS om een standaard te maken die 2000 ng/mL cardiac myosin binding protein C, 100 ng/mL CK-MB en 25 ng/mL cardiac troponin bevat.Vervolgens verdun ik dit mengsel serieel met een factor vijf tot een eindvolume van ten minste 100 µL voor elke standaard; verdun de monsters twee keer met 1% blocker A in PBS. Voeg daarna 2 technische replica's van 25 µL van de standaarden en de monsters toe aan de 25 µL blokkeringsbuffer die al in de wells van de three plex plate aanwezig is, inclusief een blanco van enkel verdunningsvloeistof. Na incubatie van de afgesloten plaat onder schudcondities, verdun ik de drie SUL oag detectie-antilichamen samen tot een eindconcentratie van elk 1 µg/mL in een 1% oplossing van blocker A en PBS na twee uur. Was de plaat zoals zojuist gedemonstreerd, en gebruik vervolgens een multichannelpipet om 25 µL detectie-antilichaamoplossing aan elke well toe te voegen.Incubeer de afgesloten plaat gedurende één uur onder schudden bij 700 RPM tijdens de incubatieperiode. Gebruik de demoplaat en verdun de Reid-buffer zoals zojuist gedemonstreerd. Was vervolgens de plaat met 0,05% Tween 20 in PBS en gebruik de multichannelpipet om 150 µL Reid-buffer aan elke well toe te voegen, waarbij luchtbellen worden vermeden, en scan de plaat onmiddellijk in de sector imager.In deze figuur wordt de standaardcurve van cardiac myosin binding protein C in de plex-assay vergeleken met die van cardiac myosin binding protein C in de three-plex-assay. Beide assays vertonen een zeer hoge gevoeligheid en een groot dynamisch bereik. Het detectiegebied van de assay is in grijs weergegeven, zowel voor de plex- als de three-plex-assay.De standaardcurven voor cardiaal myosin binding protein C zijn vergelijkbaar. De onderste detectielimiet, de onderste kwantificatielimiet en de bovenste kwantificatielimiet zijn vergelijkbaar in zowel de plex- als de threeplex-assays. Deze grafieken tonen de standaardcurven van cardiaal troponine I en CKMB van de threeplex-plaat.Beide kalibratoren vertoonden een hoge gevoeligheid en een groot dynamisch bereik. Het detectiegebied van de assay is in het grijs weergegeven. De kruisreactiviteit van de detectie-antilichamen met de andere twee kalibratoren werd bestudeerd door de individuele standaardcurves van alle drie de kalibratoren te incuberen met enkelvoudige detectie-antilichamen; er werd slechts een geringe mate van kruisreactiviteit waargenomen tussen de CKMB-kalibrator en zowel de cardiac troponin I- als de cardiac myosin binding protein C-detectie-antilichamen.Hoewel er geen kruisreactiviteit werd waargenomen tussen de andere kalibratoren en detectie-antilichamen, wat het bewijs levert voor de toepasbaarheid van de assay voor de detectie van cardiale beschadiging, werden de serumspiegels van 16 proefpersonen met een myocardinfarct vergeleken met een controlegroep met behulp van de three plex plate serumspiegels van cardiaal myosin binding protein C-C-K-M-B en cardiaal troponine I. Er werd vastgesteld dat alle drie de biomarkers verhoogd waren bij de patiënten met een myocardinfarct in vergelijking met de controlegroep.

a-sensitive-specific-quantitation-method-for-determination-serum

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een protocol om trichothecenen (mycotoxinen van zorg voor de gezondheid van de mens) met behulp van een nieuw ontwikkelde screening methode gebaseerd op een competitief immunochemische methode en een laatste elektrochemische detectie te detecteren is aangetoond.

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Methode voor Mycotoxine Detection

De onderhavige methode biedt een manier om functioneel effectieve cardiotropic auto-antilichamen te detecteren in het plasma van patiënten met gedilateerde cardiomyopathie, ongeacht de specifieke antigen, door analyse van het effect van geïsoleerde patiënt immunoglobuline op cellulaire verkorten en intracellulair calcium transiënten in geïsoleerde cardiomyocyten van de rat.

Meting van antilichaam Effecten op cellulaire functie van geïsoleerde cardiomyocyten

In this video, we demonstrate the electrochemiluminescence immunoassay for the quantitation of target protein levels in different samples. This assay is based on the luminescence produced in the electrochemical reaction. The intensity of light emitted is proportional to the quantity of the target protein in the sample.

Electrochemiluminescence Assay for Quantification of Target Protein Levels in Brain Lysate

This video demonstrates a capillary electrophoresis immunoassay protocol for detecting a protein biomarker associated with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human blood platelets. Confirmation of the presence of the ALS biomarker protein is achieved through size-based separation of the platelet proteins followed by chemiluminescent detection.

A Capillary Electrophoresis Immunoassay for Protein Biomarker Detection

Dit document beschrijft een protocol dat de veranderingen in de myofilament Ca2+ gevoeligheid tijdens contractie in geïsoleerde hartspiercellen van rattenhart beoordeelt. Samen met cardiale elektrofysiologie, systolische/diastolische cytosol Ca2+ niveaus en contractie/relaxatie, is deze meting onmisbaar voor het onderbouwen van de mechanismen die de excitatie-contractiekoppeling in gezonde en zieke harten mediëren.

Beoordeling van Myofilament Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Gevoeligheid Onderliggende Cardiac excitatie-contractie Coupling

Dit werk beschrijft een nanoimprinting lithografie methode om kwalitatief hoogwaardige sensing matrices die op het principe van buitengewone optische transmissie werken. De biosensor is lage kosten, robuust, makkelijk te gebruiken, en kan detecteren cardiale troponine ik in serum op klinisch relevante concentraties (99th percentiel cutoff ∼10-400 pg/mL, afhankelijk van de test).

Met behulp van buitengewone optische transmissie te kwantificeren cardiale Biomarkers in menselijk Serum

Capillaire elektrisch gericht is een antilichaam gebaseerde, ultrasensitive, hoge doorvoer techniek, waardoor gedetailleerde karakterisering van eiwitten en hun isoforms van extreem kleine biologische monsters. Het volgende beschrijft een protocol voor de detectie en kwantificering van specifieke proteïnen en hun isoforms in een geautomatiseerd en gerobotiseerd wijze.

Zeer gevoelige en kwantitatieve detectie van eiwitten en hun Isoforms door capillaire elektrisch gericht methode

Hier voorgesteld hebben we de methoden voor het detecteren van menselijke islet autoantilichamen met behulp van electrochemiluminescence (ECL) testen. Het protocol, gebruikt voor het voorspellen van type 1 diabetes, kan worden uitgebreid om te detecteren autoantilichamen voor andere auto-immune ziekten.

Electrochemiluminescence testen voor menselijke Islet autoantilichamen

De elektrochemiluminescentie immunoassay (ECLIA) is een nieuwe benadering voor kwantitatieve detectie van endogene en exogenously toegepaste MeCP2 eiwitvarianten, die zeer kwantitatieve, nauwkeurige en reproduceerbare metingen produceert met een lage intra- en inter-assay-fout over een breed werkbereik. Hier wordt het protocol voor de MeCP2-ECLIA in een 96-well formaat beschreven.

Een op elektrochemiluminescentie gebaseerde test voor MeCP2-eiwitvarianten

Dit protocol meet cyclische guanosinemonofosfaat (cGMP)-concentraties in vaste weefsels met behulp van competitieve enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA). Het protocol beschrijft hoe vast weefsel moet worden verwerkt, competitieve ELISA moet worden uitgevoerd, extincties moeten worden omgezet in cGMP-concentraties in picomol per milliliter en de uiteindelijke concentraties moeten worden berekend als nanomol cGMP per gram weefsel.

Meting van cyclisch guanosinemonofosfaat (cGMP) in vaste weefsels met behulp van Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Leer een gevoelige elektrochemiluminescentie-immunoassay voor het kwantificeren van cardiale myosine-bindend eiwit C en troponine I in serum. Deze methode verbetert de diagnose van myocardinfarct in klinische settings.

Een gevoelige en specifieke kwantificering Methode voor het bepalen van Serum cardiale myosine bindend eiwit C door elektrochemiluminescentie-Immunoassay (Video) | JoVE Journal

Een gevoelige en specifieke kwantificering Methode voor het bepalen van Serum cardiale myosine bindend eiwit C door elektrochemiluminescentie-Immunoassay

Meer video's verkennen