Hastalar ve İnsan endotel hücrelerinden türetildiği Prostat dolaşımdaki tümör hücrelerinin arasında E-selektin aracılı Etkileşimleri gözlemleyin vitro Yöntemi

Bu prosedürün genel amacı, nadir prostat kanseri hücreleri ile e selektin eksprese eden endotel hücreleri arasındaki etkileşimleri bir mikro slayt akış düzeneği kullanarak incelemektir. Bu, önce bir mikro slaytın fibronektin ile kaplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, insan göbek damarı, endotel hücreleri veya VE'nin dinamik bir akış sisteminde, küçük bir kanal genişliğine sahip bir mikro slayt üzerinde kültürlenmesidir.

Daha sonra, prostat kanseri hücreleri, içselleştirilen bir anti prostat spesifik membran antijeni veya PSMA insanlaştırılmış monoklonal antikor ile etiketlenir. Son adım, anti PSMA işaretli prostat kanseri hücrelerini, ve'yi eksprese eden e selektin üzerine perfüze etmektir. Sonuç olarak, prostat kanseri hücreleri ile endotel hücreleri arasındaki etkileşimleri göstermek için video mikroskobu kullanılır.

Bu tekniğin paralel plaka akış odası ve diğer dinamik düzenekler gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bu teknikle, dolaşımdaki tümör hücreleri ve dinamik bir akış sisteminde kültürlenmiş endotel hücreleri gibi nadir prostat kanseri hücreleri arasındaki etkileşimleri inceleyebilmenizdir. Bu yöntem, metastaz alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin prostat tümörü hücreleri kan vasküler sistemi yoluyla nasıl metastaz yaparlar? Lökositlerin izasyonu sırasında kullandıkları mekanizmanın aynısını mı kullanıyorlar?

Genel olarak, bu tekniğe yeni olan bireyler, doku kültürü başlığı altında perfüzyon altında dar bir kanalda tek katmanlı bir endotel hücresi tabakasının kültürlenmesini içerdiğinden mücadele edeceklerdir. İlk olarak, mikro slaytı fosfat tamponlu salin veya PBS ile durulayın. Ardından, bir mililitrelik yem kilit şırıngası kullanarak mikro slaytı mililitre fibronektin başına 200 mikrolitre 50 mikrogram ile nazikçe kaplayın.

Mikro slaytı kapakla kapatın ve 30 dakika boyunca doku kültürü başlığının içinde tutun. Daha sonra, mikro lam üzerine 200 mikrolitre ılık qve büyüme ortamı perfüze edin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Mikro sürgü içindeki sıvının yavaş dağıtılması, kanalda kabarcık oluşumunu önler.

Perfüzyon sırasında, vex'i PBS ile durulayarak ve oda sıcaklığında bir ila iki dakika boyunca PBS'ye% 0.1 kollajenaz ve.% 0.05 EDTA ekleyerek vex süspansiyonunu hazırlayın. Sahip olduğunuz iki mililitre büyüme ortamında 180 kez G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Daha sonra bir hemo sitometre kullanarak hücre konsantrasyonunu ölçün ve 100 mikrolitre büyüme ortamı başına 10 milyon hücre hazırlayın.

Ardından, ortamı mikro sürgünün girişinden dikkatlice çıkarın. 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak, mikro slaytı göz hizasına getirin ve bir mililitrelik yem kilit şırıngası kullanarak, hazırlanan vex konsantrasyonunun 200 mikrolitresini kanala nazikçe püskürtün. Kabarcıklar ortaya çıkarsa kabarcık oluşumunu önlemek için bu adımda dikkatli olunmalıdır, kabarcıklar çıkış kanalına girene kadar biraz daha uzun süre perfüze etmeye devam edin.

Ardından, mikro slaytın hem girişine hem de çıkışına eşit hacimde yaklaşık 80 mikrolitre VE ortamı pipetleyin. Bu, hücrelerin her iki yönde de akışını önler. Slaytı örtün ve 1,5 saat boyunca 37 santigrat derece inkübatörde tutun.

Akış odası montajına başlamak için, minimum ölü hacim için inkübatöre 15 dakika boyunca steril 20 mililitrelik bir şırınga, dişi ve erkek yem konektörleri, bir şırınga pompası ve hortum yerleştirin. İç çapı 0,04 inç olan kullanılmış boru. Daha küçük boru çapı kabarcık oluşumunu önler.

Daha sonra, 20 mililitrelik şırıngayı 12 mililitre ılık VE ortamı ile doldurun. Kabarcığı şırıngadan tamamen çıkarın. Mikro slaytın girişini VE ortamı ile doldurun.

Bu düzeneği mikro kızağa bağlayın. Çıkış konektörünü yavaşça mikro kızağa takın. Kurulumu inkübatöre getirin ve şırınga pompasına bağlayın.

Ardından, hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede inkübatörde bırakmadan önce pompayı dakikada 10 mikrolitrelik bir kesme hızına ayarlayın. Ertesi gün, mikro sürgünün girişine takılı konektörü çıkararak kurulumu sökün. Ardından, endotel hücrelerinde e selektin ekspresyonunu yukarı regüle etmek için çıkış konektörünü iki çıkarın.

İnterlökin bir beta içeren taze büyüme ortamı hazırlayın. Ortamı 10 mililitrelik bir şırıngada aspire edin. Kalan ortamı slaydın girişinden çıkarın, ardından girişi tamamen dolduran taze, orta ekleyin.

Şırıngayı slayta bağlayın. Şırınga pompasını, vex'in interlökin bir beta inkübasyonu sırasında inkübatörde dört saat boyunca dakikada 10 mikrolitre kesme hızına ayarlayın, anti PSMA Alexa 4 88 antikor etiketli prostat kanseri hücreleri hazırlayın. İlk olarak, MDA prostat kanseri hücrelerine bir dakika boyunca% 0.05 tripsin EDTA ekleyin.

Hücre yüzeyinde bulunan glikopeptitleri etkileyebileceğinden hücreleri daha uzun süre tripsine maruz bırakmayın. Hücreleri beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra, MDA hücre damağını bir mililitre Hank's Buffer içinde yeniden süspanse edin ve anti PSMA antikor inkübatını oda sıcaklığında karanlık bir yerde 30 dakika inkübe edin, inkübasyon sırasında hücreleri tekrar askıya alın.

30 dakika sonra, hücre çözeltisini beş dakika boyunca 800 kez G'de santrifüjleyin. Peletleri Hank'in tamponunun bir mililitresinde aspire edin ve yeniden süspanse edin. Etiketli MDA hücrelerini sayın ve son konsantrasyonu mililitre başına 1 milyon hücreye getirin.

Beş mililitrelik bir şırıngayı etiketli MDA hücreleri ile doldurun ve kabarcıkları çıkarın. Ters çevrilmiş mikroskobu açın ve kıvırıcı aydınlatmasını 10 x objektife ayarlayın. Şırınga pompasını mikroskobun numune aşaması ile aynı seviyeye getirin ve santimetre kare kesme gerilimi başına bir kuruş olarak ayarlayın.

Ardından, Zeiss Axio vision yazılımını açın. Bilgisayar ekranında reklam verme amacını seçin. Yazılımdaki araçlar seçeneğinin altında yeni bir klasör oluşturun.

Axio vision'da akıllı deneyler seçeneğini açın ve 32 dakika boyunca kısa 30. videoları kaydetmek için ayarları yapın Canlı floresan video için görüntü seçeneklerini ayarlayın. Bu parametreler, bilgisayar ekranında 10 x objektifte akış kanalının tam genişliğini görselleştirmek için Zeiss MRM kamera ile video kare hızına yakın videolar elde etmeye yardımcı olur, şırıngayı ve hücreleri içeren konektörü şırınga pompasına yerleştirmeden önce cıva lambasındaki bir CM montaj adaptör anahtarını kullanın. Daha sonra, konektörü interlökin bir beta uyarımlı balta içeren mikro sürgünün doldurulmuş giriş kanalına takın.

Çıkış kanalını boruya bağlı konektör ile bağlayın. Akışı toplamak için boruyu bir tabağa veya 15 mililitrelik konik bir tüpe koyun. İnfüzyonu dakikada 10 mikrolitre olarak mikro slayttan başlatın.

Endotel hücreleri ile etiketli MDA hücreleri veya 488 nanometrenin altındaki hastalardan türetilen etiketli CTC'ler arasındaki etkileşimleri gözlemleyin. Epi floresan mikroskobu üzerinde filtre. Deneyi 32. kısa video olarak kaydetmeye başlayın.

Oynatma analizi sırasında yuvarlanma hızını ölçün. Yuvarlanma hızı, hücrelerin zaman içinde kat ettiği mesafenin bölünmesiyle ölçülür. Burada gösterilen, tek katmanlı bir endotel hücresinin gece boyunca kültürüdür.

Mikro slaytta. Ölçeklemeler, mikro slaytın %100'ünün beş x objektif kullanılarak görünür olduğunu, %70'inin ise seçilen aracılı etkileşimler için 10 x objektif kullanılarak görünür olduğunu, kenarlarda yuvarlanan hücrelerin dikkate alınmadığını gösterir, bu da mikro slaytın %70'inden fazlasını video kaydı ve oynatma analizi için kullanılabilir hale getirir. Kutu grafiği, farklı kesme gerilimi koşullarında interlökin bir beta ile uyarılmış endotel hücreleri üzerinde hem etiketlenmemiş hem de anti PSMA, etiketli MDA hücrelerinin yuvarlanma hızlarının dağılımını göstermektedir.

Santimetre kare başına 10 kuruşluk daha yüksek streste bir ve beş dines santimetre karedeki yuvarlanma hızlarında önemli bir fark gözlenmedi. Etiketlenmemiş ve anti PSMA, etiketli MDA hücrelerinin yuvarlanma hızları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlendi, Bir prostat kanseri hastasından alınan kan kullanılarak çekilen zaman dikişli bir video, etiketli prostat CTC'leri ile lektin eksprese eden endotel hücreleri arasında üç tür etkileşim gösterir: CTC'lerin bağlandığı ve yeniden bağlandığı, CTC'lerin 30 saniye sonra bile ayrılmadığı ve etkileşime girmeyen CTC'ler görüş alanına girerken hiçbir etkileşimin olmadığı stabil yapışma. Mikro slaytlar kolayca immüno-boyama yapılabilir ve anti PSMA, etiketli MDA hücrelerinin sıkı yapışmasını floresan olarak görüntüleyebilir.

İnterlökin üzerinde füzyondan sonra burada bir beta ile uyarılmış endotel hücresi görülebilir. Bu videoyu izledikten sonra, dolaşımdaki prostat tümör hücreleri gibi nadir hücreler ile bu prosedürü takiben S selektin eksprese eden endotel hücreleri arasındaki etkileşimleri nasıl inceleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. S selektinin varlığı gibi ek soruları yanıtlamak için immünofloresan gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Ligandlar.

Bu gibi teknikler, araştırmacıların metastaz ile ilgili farklı adımları anlamalarına yardımcı olabilir.