Name: Hastalar ve İnsan endotel hücrelerinden türetildiği Prostat dolaşımdaki tümör hücrelerinin arasında E-selektin aracılı Etkileşimleri gözlemleyin vitro Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Keşfedin, prostat kanserinde dolaşımdaki tümör hücreleri ile endotel hücreleri arasındaki E-selektin aracılı etkileşimleri mikro akış sistemi kullanarak incelemeyi. Bu yöntem metastaz mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Bölümü Savunma-Prostat Kanseri Araştırma Programı (W81XWH-12-1-0124) fon tarafından desteklenen, Ulusal Kanser Enstitüsü, ve Robert McCooey Genitoüriner Onkoloji Araştırma Fonundan U54CA143876. Biz HUVECler sağlamak için VE-kaderin antikorları sağlamak için Dr Annarita Lorenzo (Patoloji Anabilim Dalı) teşekkür etmek istiyorum, ve Dr Marco Seandel (Cerrahisi Anabilim Dalı) olacaktır.

Gözlem CTC-endotel Etkileşimleri Lam 1. Ekimi HUVEC&#39;ler <ol><li> Doku kültürü kaputu altında, ilk olarak, PBS ile 1 mm kanal genişliğini mikroslayd durulayın. Yavaşça kat 50 ug / ml fibronektin (PBS içinde çözülmüş) bir 1 ml&#39;lik luer-lock şırınga kullanılarak 200 ul Mikroslayd. </li><li> Kapak ile Mikroslayd örtün ve 30 dakika boyunca doku kültürü kaputu içine tutun. Mikroslayd içindeki sıvının yavaş dağıtım kanalında kabarcık oluşumunu engeller. </li><li> Ilık (37 ° C) HUVEC büyüme ortamında 200 ul serpmek (M199 ortamı, 1 M HEPES,% 20 FBS, 5 mg / ml heparin, 100 ug / ml endotelyal hücre büyüme faktörü ve L-glutamin) Mikroslayd üzerinden ve boyunca inkübe Oda sıcaklığında 20 dakika. Perfüzyon sırasında HUVEC hücre süspansiyonu hazırlamak. </li><li> PBS ile durulayın HUVECler ve oda sıcaklığında 1-2 dakika boyunca% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin. 5 dakika boyunca 180 x g &#39;de 2 ml büyüme ortamı içinde santrifüj HUVECler. </li><li> Bir neuba kullanarak hücre konsantrasyonunu ölçünuer hemositometre ve büyüme ortamı ul 10 7 HUVEC hücre/100 hazırlamak. Daha sonra, dikkatli bir şekilde 200 ul pipet kullanarak Mikroslayd girişinden orta çıkarın. </li><li> Göz seviyesine mikroslayd ve 1 ml luer-lock şırınga kullanılarak getirmek, yavaşça kanal içine HUVEC&#39;lerin hazırlanmış konsantrasyonu 200 ul serpmek. Dikkat kabarcık oluşumunu önlemek için bu adım gereklidir. Kabarcıklar görünüyorsa, kabarcıklar çıkış kanalını girmek kadar biraz daha uzun bir süre için sızdırılmasını tutun. </li><li> Giriş ve çıkış Mikroslayd hem HUVEC ortamının eşit bir hacmi (~ 80 ul) koyun. Bu, her iki yönde hücrelerinin akışını engeller. </li><li> Slayt örtün ve 1.5 saat için inkübatör (37 ° C) tutun. </li></ol> Bir mikro Gecelik HUVEC Kültür Akış Odası Meclis 2.. Hazırlanması <ol><li> 15 mi boyunca inkübatör içinde bir steril 20 ml şırınga, dişi ve erkek Luer bağlantıları, boru ve bir şırınga pompası yerleştirinn. </li><li> Minimum ölü hacmi için, 0.04 inç iç çaplı boru kullanın. Daha küçük boru çapı baloncuk oluşumunu engeller. </li><li> Ilık (37 ° C) HUVEC ortamı (12 mi) ile 20 ml şırınga doldurun. Şırınga üzerine konnektörleri ile tüp takın. Kabarcıklarını çıkarın. Mikroslayd Bu montaj bağlayın. </li><li> Tamamen HUVEC medya ile Mikroslayd giriş doldurun. Yanındaki mikroslayd için konnektöre bağlı doldurulmuş 20 ml şırınga getirin. Yavaşça mikroslayd için bağlacı takın. </li><li> Kuvöz içine set-up getirmek ve 10 ul / dk kesme hızında ayarlanmış şırınga pompası, bağlanın. 37 ° C&#39;de inkübatör hücreleri O / N bırak </li><li> Bir sonraki gün, Mikroslayd girişine bağlı soketi kaldırarak kurulumu sökülmesi. </li><li> EC&#39;lere on E-selektin ekspresyonunu için 4 ml medyada ng / ml 10 IL-1β içeren yeni büyüme ortamı hazırlamak. 10 ml şırınga içinde ortam aspire. T Kaldıro Mikroslayd girişinden ortam ve slayt için şırınga bağlayın. </li><li> Kuluçka makinesi içinde, 4 saat boyunca 10 ul / dak kesme oranında şırınga pompası ayarlayın. </li></ol> 3. Anti-PSMA&#39;nm Hazırlama (J591-488) Etiketli Prostat Kanseri Hücreleri <ol><li> HUVEC IL-1β İnkübasyon sırasında, anti-J591 PSMA-Alexa488 etiketli PCa hücrelerini hazırlamak. 1 dakika boyunca MDA hücreler% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin. Bu, hücre yüzeyi üzerinde mevcut olan peptidi etkileyebilir gibi uzun süreler boyunca tripsin üzere hücrelerin maruz bırakılmamalıdır. Enzim hücre ayrışma reaktif yerine de tripsin kullanılabilir. 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüj. </li><li> 1 ml H / H tamponu (Hanks dengeli tuz solution/0.1% HSA/10 mM HEPES / 1 mM CaCI2) içinde MDA hücre pelletini. Karanlık bir yerde, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 20 ug / ml &#39;de anti-J591 PSMA-Alexa488 antikor ekleyin. Inkübasyon sırasında hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> 30 dakika sonra, 5 dakika boyunca 800 x g&#39;de santrifüj hücre çözümü. Aspihızı ve 1 ml H / H tampon içinde pelletini. Etiketlenmiş MDA hücre sayımı ve 1x10 6 hücre / ml nihai konsantrasyona getirin. J591-488 etiketli MDA hücreleri ile 5 ml şırınga doldurun ve kabarcıkları giderin. </li></ol> 4. PCa&#39;nın Hastalarda Anti-PSMA&#39;ya (J591-488) Etiketli KTC Zenginleştir hazırlanması <ol><li> (Sodyum sitrat ihtiva eder), bir mavi kapak tüp içinde prostat kanseri hastalarından alınan 7.5 ml kan toplamak. Yavaşça% 0.1 BSA / 1 mM EDTA / PBS içinde kan 1:01 seyreltin. </li><li> 5.3 ml Ficoll-Paque Plus 50 ml konik bir tüp içinde ekleyin. Katman Ficoll Paque üstünde kan seyreltilmiştir. 30 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj. </li><li> Ön kaplama, tüm tüpler veya uçlarına% 2 FBS/RPMI-1640 / 1 mM CaCl 2/4 mM MgCI2 yüzeylerine kapalı zaman eğrileri non-spesifik bağlanma önlemek için (R / S tamponu) ile kapalı zaman eğrileri ile temas. Kapalı zaman eğrileri ile temas eden ortam ve tampon içinde, 4 ° C sıcaklığı muhafaza edin. </li><li> Periferal kan tek çekirdekli hücre (PBMC) fraksiyonu toplamak30 ml R / S tampon ihtiva eden bir 50-ml konik bir tüp içinde arabirimden CTCS ihtiva etmektedir. 8 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj. </li><li> Pelet yeniden süspanse edin ve 8 dakika boyunca 400 x g&#39;de R / S tampon maddesi içinde tekrar yıkayın. Santrifüj işleminden sonra H / H tampon içinde pelletini. Karanlık bir yerde, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 20 ug / ml &#39;de anti-J591 PSMA-488 antikor ekleyin. </li><li> 30 dakika sonra, 5 dakika boyunca 800 x g&#39;de J591-488 etiketli CTCS içeren PBMC santrifüj. H / H tamponunda süspanse. Numune ile bir 1 ml şırınga (R / S tampon maddesi ile önceden kaplanmış) doldurun. </li></ol> 5. Mikroskop hazırlanması, Şırınga pompası ve Akış Odası Meclis <ol><li> Ters mikroskop açın ve 10X objektif de Kohler aydınlatma ayarlayın. Mikroskop örnek aşaması ile aynı seviyede şırınga pompası getirin ve 1 din / cm 2 kesme stresi (~ 10 ul / dak) olarak ayarlayın. </li><li> Zeiss Axiovision yazılımını açın. Bilgisayar ekranında hedefi seçin. Yeni Oluşturyazılım araçları seçeneği altında klasör. </li><li> Axiovision akıllı deneyler seçeneğini açın ve 30 dakika boyunca kısa 30 sn video kayıt ayarlarını. </li><li> Canlı floresan video, görüntü seçenekleri-12 msn Pozlama, 2 x 2 bin, 5 Kazancı ayarlayın. Bu parametreler Zeiss MRM kamera ile video kare oranı (~ saniyede 23 kare) yakın videoları ulaşmada yardımcı olur. </li><li> , Bilgisayar ekranında 10 X objektif de akış kanalı tam genişliğini görselleştirmek bir C-mount adaptörü (0.63 xf/60 mm Arayüz) kullanın. </li><li> Cıvalı lamba açın. </li><li> Şırınga pompa üzerine şırınga ve hücreleri ihtiva eden konektörü yerleştirin. </li><li> Bring IL-1β inkübatör HUVECler uyarılır. HUVECler içeren Mikroslayd doldurulmuş giriş kanalı için bağlayıcı takın. </li><li> Boru bağlı bir bağlantı parçası ile çıkış kanalı bağlayın. Yoluyla akışını toplamak için bir çanak ya da 15 ml konik bir tüp içine boru koyun. </li><li> Infusi başlayın10 ul / dk &#39;da Mikroslayd aracılığıyla. Endotel hücreleri ve MDA etiketli hücreler veya epifloresans mikroskopta 488-nm filtre altında hastalardan türetilen etiketli kapalı zaman eğrileri arasındaki etkileşimi dikkate alınmalıdır. </li><li> 30 sn kısa videolar gibi deney kaydetmeye başlayın. Oynatma analiz sırasında, haddeleme hızını ölçmek. Haddeleme hız zamanla hücreler tarafından kat edilen mesafenin bölünmesiyle ölçülür. </li></ol> Mikroslayd 6. Immün <ol><li> 10 dakika boyunca, IL-1β uyarımlı HUVEC hücreleri MDA perfüze sonra Mikroslayd giriş ve çıkışından Ortamı çıkarın. </li><li> 200 ul ucunu kullanarak, 5 dakika boyunca Mikroslayd girişine kalsiyum ve magnezyum ihtiva eden ılık (37 ° C) PBS koydu. Bankta bir pervane gibi onun kapağını kullanarak mikroslayd eğin. İmmunosteyn sırasında tüm inkubasyon için bir eğik pozisyonda mikroslayd tutun. </li><li> Girişine sıcak% 2 formaldehit delinmesiyle HUVECler Fix </li><li&gt; oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. 5 dakika her biri için iki kez PBS ile yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içerisinde% 5 BSA içinde triton-X-100 (% 0.1) ilave edin. </li><li> 5 dakika her biri için iki kez PBS ile yıkayın. 30 dakika boyunca PBS içerisinde% 5 BSA ile bloke edin. </li><li> Birincil antikor, keçi anti-inkübe VE-cadherin (1:100),% 2.5 BSA O / N 4 ° C&#39;de </li><li> Ertesi gün, her biri 5 dakika boyunca PBS ile iki kere yıkayın. 45 dakika boyunca ikinci eşek anti-keçi 647 antikor ekleyin. 5 dakika her biri için iki kez PBS ile yıkayın. </li><li> 1 saat boyunca insanlaştırılmış J591-Alexa488 konjüge edilmiş antikor ile oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 5 dakika her biri için iki kez PBS ile yıkayın. 5 dakika için DAPI ekleyin. 5 dakika için damıtılmış su ile yıkayın. </li><li> PBS ekleyin (veya uzun süreli depolama için Mowiol). Konfokal mikroskop altında Mikroslayd görselleştirmek. </li></ol>

<ol><li>Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rolling+of+human+bone-metastatic+prostate+tumor+cells+on+human+bone+marrow+endothelium+under+shear+flow+is+mediated+by+E-selectin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin.</a> Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).</li>
<li>Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+selectins+and+selectin+ligands+in+inflammation+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Ther.+Targets%22%5BJournal%5D)">Targeting selectins and selectin ligands in inflammation and cancer.</a> Expert Opin. Ther. Targets. 11, 1473-1491 (2007).</li>
<li>Konstantopoulos, K., Thomas, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+in+transit%3A+the+vascular+interactions+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Cancer cells in transit: the vascular interactions of tumor cells.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 177-202 (2009).</li>
<li>Nagrath, S., Sequist, L. V., Maheswaran, S., Bell, D. W., Irimia, D., Ulkus, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rare+circulating+tumour+cells+in+cancer+patients+by+microchip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology.</a> Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).</li>
<li>Mannweiler, S., Amersdorfer, P., Trajanoski, S., Terrett, J. A., King, D., Mehes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+prostate-specific+membrane+antigen+%28PSMA%29+expression+in+prostate+carcinoma+with+distant+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol.+Oncol.+Res%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in prostate carcinoma with distant metastasis.</a> Pathol. Oncol. Res. 15 (2), 167-172 (2009).</li>
<li>Tagawa, S. T., Milowsky, M. I., Morris, M. J., Vallabhajosula, S., Christos, P. J., Akhtar, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+II+study+of+lutetium-177+labeled+anti-prostate-specific+membrane+antigen+%28PSMA%29+monoclonal+antibody+J591+for+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Phase II study of lutetium-177 labeled anti-prostate-specific membrane antigen (PSMA) monoclonal antibody J591 for metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Cancer Res. , (2013).</li>
<li>Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+and+their+use+in+the+study+of+neutrophil+transmigration+under+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions.</a> J. Vis. Exp. (66), 10-3791 (2012).</li>
<li>Moss, M. A., Zimmer, S., Anderson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+metastatic+potential+in+the+adhesion+of+human+breast+cancer+cells+to+endothelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Role of metastatic potential in the adhesion of human breast cancer cells to endothelial monolayers.</a> Anticancer Res. 20, 1425-1433 (2000).</li>
<li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+physiologic+E-selectin-mediated+leukocyte+rolling+on+microvascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium.</a> J Vis Exp. 24, (2009).</li>
<li>Gebauer, F., Wicklein, D., Stubke, K., Nehmann, N., Schmidt, A., Salamon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectin+binding+is+essential+for+peritoneal+carcinomatosis+in+a+xenograft+model+of+human+pancreatic+adenocarcinoma+in+pfp--%2Frag2--+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Selectin binding is essential for peritoneal carcinomatosis in a xenograft model of human pancreatic adenocarcinoma in pfp--/rag2-- mice.</a> Gut. 62 (5), 741-750 (2013).</li>
<li>Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rolling+and+adhesion+of+human+tumor+cells+on+vascular+endothelium+under+physiological+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions.</a> J. Clin. Invest. 92 (6), 3038-3044 (1993).</li>
<li>Remuzzi, A., Giavazzi, R. Adhesion of tumor cells under flow. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRemuzzi%2C+A+%22Adhesion+Protein+Protocols%22">Adhesion Protein Protocols</a>. Dejana, E., Corada, M. 96, Humana Press. 153-157 (1999).</li>
<li>Liu, H., Moy, P., Kim, S., Xia, Y., Rajasekaran, A., Navarro, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+to+the+extracellular+domain+of+prostate-specific+membrane+antigen+also+react+with+tumor+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium.</a> Cancer Res. 57 (17), 3629-3634 (1997).</li>
<li>Jung, B., Obinata, H., Galvani, S., Mendelson, K., Ding, B. S., Skoura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-regulated+endothelial+S1P+receptor-1+signaling+sustains+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Flow-regulated endothelial S1P receptor-1 signaling sustains vascular development.</a> Dev. Cell. 23 (3), 600-610 (2012).</li>
<li>Yin, X., Rana, K., Ponmudi, V., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+fucosyltransferase+III+disrupts+the+adhesion+of+circulating+cancer+cells+to+E-selectin+without+affecting+hematopoietic+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Knockdown of fucosyltransferase III disrupts the adhesion of circulating cancer cells to E-selectin without affecting hematopoietic cell adhesion.</a> Carbohydr. Res. 345 (16), 2334-2342 (2010).</li>
<li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transmigratory+cup+in+leukocyte+diapedesis+both+through+individual+vascular+endothelial+cells+and+between+them%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them.</a> J Cell Bio. 167 (2), 377-388 (2004).</li>
</ol>

Dr Bander Bu makalede kullanılan J591 antikor için Cornell Araştırma Vakfı (&quot;CRF&quot;) atanan patentleri mucididir. Dr Bander için bir danışman ve BZL Biologics, patentler daha fazla araştırma ve geliştirme için KBY tarafından lisanslı olduğu şirketin hisselerini sahibi.

Nedeniyle kan hücreleri arasında kapalı zaman eğrileri düşük sayıda, bu hücre popülasyonu olarak saf CTCS izole etmek güçtür. CTC / EC etkileşimleri çalışmak için, kapalı zaman eğrileri nadir ve saf olmayan nüfus iki büyük zorluklar teşkil etmektedir: Kan hücrelerinin arasında kapalı zaman eğrileri a) belirlenmesi; b) CTC / EC etkileşimlerinin Gözlem. Kan hücreleri arasında prostat CTCS belirlenmesi ilk sınırlamasını aşmak için, hemen hemen tüm prostat tümörü hücr...

Metastaz az anlaşılmaktadır karmaşık çok-adımlı bir işlemdir. E-selectin/selectin ligand ekseni vasküler endotel ve kanser hücrelerinin 1,2 arasında birinci yapışkan etkileşimi teşvik ederek tümör metastazında önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Farklı E-selektin ligand (lar), tümör hücreleri tarafından eksprese 3 ise endotel (E)-selektin, aktive edilmiş endotel hücreleri tarafından eksprese edilen bir transmembran proteindir. Çok sayıda in vitro yaklaşımların başarılı bir tümör hücrelerinin ve endotel hücreleri arasındaki E-selectin/selectin ligand etkileşimlerini (EC) 1 Modele kullanılmıştır. Bu etkileşimleri çalışmak için, farklı akış odası sistemleri, kan damar sistemini simüle etmek için istihdam edilmektedir. Akış odası montajları arasında, EC&#39;ler ile bağlantılı olarak paralel plaka akış bölmesi (PPFC) rutin olarak vivo kesme stresi koşulları simüle eden bir in vitro modeli olarak kullanılır. Bu bağlamdayöntemi, EC 35 mm çanak üzerinde yetiştirilen ve bir tek tabaka elde sonra, EC PPFC bağlı olan ve kayma gerilme tabanlı deneyleri yapılmaktadır. Bununla birlikte, PPFC ve mevcut sistem hasta ve EC&#39;ler türetilen tümör hücrelerinin (kapalı zaman eğrilerinin), dolaşımdaki arasında yapışma etkileşimleri incelemek için pek çok sınırlamalar mevcut temel olarak, kapalı zaman eğrilerinin kan hücrelerinin milyonlarca arasında dolaşan, primer tümörden döken hücre nadir nüfus, çünkü (1 CTC 9 kan hücreleri başına 10) 4. Bu nedenle, kültürlenmiş hücre çizgileri sınırsız kaynağı aksine, düşük CTC sayısı çalma analiz için etkileşimleri kaydetmek için uygun bir akış kanalı genişliği gerektiren, çok az ve nadir CTC / EC etkileşimleri yol açar. Hasta kapalı zaman eğrilerinin elde edilen saf olmayan bir nüfus olduğu ek olarak, bu nedenle tanımlama işareti özel olarak CTCS izlemek için gereklidir. Bu sorunu çözmek için, biz (PCA) CT prostat kanseri tespit etmek için yeni bir yöntem geliştirdiCs neredeyse tüm bu kapalı zaman eğrileri, kendi hücre yüzeyinde 5,6 prostat spesifik zar antijeni (PSMA) belirtisi göstermesi gerçeğinden yararlanarak. Bu raporda, biz sonunda metastaz mekanizmasını anlamak için, EC &#39;ile prostat CTC etkileşimleri çalışmak için yeni sistemin potansiyel yarar göstermek için, prostat kanseri hücre hattı MDA PCa2b (MDA) kullanılır. Metodoloji vivo vasküler sistemde 7-9 taklit çeşitli kesme bazlı deneyler için uygulanabilir. PKa CTC / EC etkileşimleri incelemek Bunun yanı sıra, akım odası sistemi kolayca periferal kan tek-çekirdekli hücreleri ya da analiz EC&#39;ler ile tümör hücrelerinin etkileşimleri için adapte edilebilir. Sökülmesi ve akış odasının Reassembling kolaylığı, bir mikroslayd III (0.1) (bundan sonra mikroslayd olarak anılacaktır), perfüzyon ve pr ikna etmek için farklı sitokinler ile ECS uyarıcı altında kültür ECS sağlarifadesini otein. Bunun yanı sıra, kültürlü EC, örneğin E-ve P-selektin, rekombinant proteinleri, tümör hücreleri ile Mikroslayd ve etkileşimler üzerine kaplanabilir laminar akış koşulları altında 10 gözlenebilir.

<table><tbody><tr><td>Microslide</td><td>Ibidi</td><td>80331</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>Plastik boru</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-96115-08</td><td></td></tr><tr><td>Erkek Luer adaptörü</td><td>GlycoTech</td><td>31-001</td><td></td></tr><tr><td>Dişi Luer adaptörü</td><td>GlycoTech</td><td>31-001</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga pompası</td><td>Chemyx Inc</td><td>Fusion 100</td><td></td></tr><tr><td>Luer kilitli şırınga</td><td>BD Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>M199 ortamı</td><td>Sigma</td><td>M7653</td><td></td></tr><tr><td>Endotelyal Mitojen</td><td>Biyomedikal Teknolojiler</td><td>BT-203</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H9269</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PSMA J591-488</td><td>Weill Cornell Tıp Fakültesi-Ürolojik Onkoloji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratuvarı İnterlökin-1 beta</td><td>Peprotech</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Millipore</td><td>SM-2002-C</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H-3149</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC'ler</td><td>Weill Cornell Tıp Fakültesi-Marco</td><td>Seandel</td>VE-Cadherin Santa Cruz sc-5648 tarafından sağlanan Cerrahi <td></td> Bölümü</tr><tr><td>10x objektif</td><td>Zeiss Planı Neofluar</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enzim içermeyen hücre ayrışma reaktifi</td><td>Millipore</td><td>S-004-C</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Lonza</td><td>12-702-F</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-paque plus</td><td>GE healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr></tbody></table>

hastalar ve İnsan endotel hücrelerinden türetildiği prostat dolaşımdaki tümör hücrelerinin arasında e-selektin aracılı etkileşimleri gözlemleyin vitro yöntemi

In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

Metastaz tümör hücrelerinin ikincil bir niş damar dışına ve form erişim sağlamasını ve böylece, birincil tümör intravasate kan vasküler ve lenf sistemi için tutacak edildiği bir süreçtir. Kan damar sistemi için tümör hücrelerinin ekstravazasyon farklı hücre hatlarından elde edilen endotelyal hücreleri (EC) ve tümör hücreleri kullanılarak incelenebilir. İlk çalışmalar, statik koşullar kullanılarak yapılmıştır ancak iyi EC fizyolojik akış koşulları altında farklı davranır olduğu belgelenmiştir. Bu nedenle, farklı akım odası düzenekleri henüz EC&#39;ler ile kanser hücresi etkileşimleri incelemek için kullanılmaktadır. Akım akışı odası takımları, farklı kesme stres koşullarında farklı hücre hatları veya sıvının kullanarak tekrarlanabilir sonuçlar sunuyoruz. Ancak, gözlemlemek ve bu tümör hücrelerini (KTC) dolaşan gibi nadir hücreleri ile etkileşimleri çalışmak için, bazı değişiklikler geleneksel akış odası montaj yapılacak gerekmektedir. KTCkan hücrelerinin milyonlarca arasında nadir bir hücre popülasyonu vardır. Sonuç olarak, kapalı zaman eğrileri saf bir popülasyonu elde etmek zordur. Normal olarak, dolaşımda bulunan farklı hücre tipleri ile kapalı zaman eğrileri kirlenmesi mevcut zenginleştirme ya da tükenme teknikleri kullanılarak kaçınılmazdır. Bu raporda, biz floresan etiket dolaşan prostat kanseri hücreleri için benzersiz bir yöntem tarif ve kendine monte akış odası sistemine EC&#39;lere olan etkileşimlerini araştırır. Bu teknik bundan başka, prostat kapalı zaman eğrileri ve ilgi duyulan herhangi bir protein arasındaki etkileşimi gözlemlemek için uygulanabilir.

Şekil 1, bu mikroslayd üzerinde EC&#39;ler bir tek tabaka bir O / N kültür gösterir. Şekil 1A döküntü Mikroslayd 100% 70% 10X objektif (Şekil 1B) kullanılarak görülebilir iken, 5X objektif kullanarak görünür olduğunu göstermektedir. E-selektin aracılık ettiği işlemleri için, kenarlarında haddeleme hücre video kayıt ve oynatma analiz için Mikroslayd% 70&#39;den fazlası mevcut kılan olarak kabul edilmez. Bizim tecrübelerimize göre, başlangıçta bu set-up montaj kültürüne m...

Bizim rapor fizyolojik akış koşulları altında prostat kanserinde CTC / EC etkileşimleri görselleştirmek ve analiz etmek için eşsiz bir yöntem açıklanır.

Hastalar ve İnsan endotel hücrelerinden türetildiği Prostat dolaşımdaki tümör hücrelerinin arasında E-selektin aracılı Etkileşimleri gözlemleyin vitro Yöntemi

Metastasis is a process in which tumor cells shed from the primary tumor intravasate blood vascular and lymphatic system, thereby, gaining access to ...

Bu prosedürün genel amacı, bir mikro slayt akış düzeneği kullanarak nadir prostat kanseri hücreleri ile E-selektin eksprese eden endotel hücreleri arasındaki etkileşimleri incelemektir. Bu işlem, öncelikle bir mikro slaydın fibronektin ile kaplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, insan göbek veni endotel hücrelerinin (HUVEC) dar kanal genişliğine sahip bir mikro slayt üzerindeki dinamik akış sisteminde kültüre edilmesidir.Ardından, prostat kanseri hücreleri, internalize olan anti prostat spesifik membran antijeni veya PSMA humanize monoklonal antikor ile işaretlenir. Son adım, anti PSMA işaretli prostat kanseri hücrelerinin e-selektin eksprese eden ve üzerinden perfüze edilmesidir. Son olarak, prostat kanseri hücreleri ile endotel hücreleri arasındaki etkileşimleri göstermek için video mikroskopi kullanılır.Bu tekniğin, paralel plaka akış odası ve diğer dinamik düzenekler gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bu teknik sayesinde dolaşan tümör hücreleri gibi nadir prostat kanseri hücreleri ile kültürlenmiş endotel hücreleri arasındaki etkileşimleri dinamik bir akış sisteminde inceleyebilmenizdir. Bu yöntem, prostat tümör hücrelerinin kan damar sistemi yoluyla nasıl metasta

in-vitro-method-to-observe-e-selectin-mediated-interactions-between

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu rapor, görsel bir tasviri lökosit leşimlerini kayma fizyolojik stres altında çalışmak için paralel plaka akış segment analizi sağlar. Bu yöntem, tetik lökosit endotel hücre yüzeyleri üzerinde yuvarlanan E-selektin, endotel (E)-selektin ve lökosit ligandlar rolünü araştırmak için özellikle yararlıdır.

Mikrovasküler Endotel Fizyolojik E-selektin aracılığı ile Lökosit Rolling Analizi

Dolaşımdaki tümör hücreleri hücresel hasara maruz kalmadan kanserli hastaların kandan izole edilir. Tümör hücrelerinin izolasyonu epiteliyal belirteçler karşı antikorların yanısıra E-selektin bir iki moleküllü yüzey kullanılarak gerçekleştirilir. Bir nanotüp kaplama özellikle yüksek yakalama saflık sonuçlanan kanser hücre adezyon teşvik etmektedir.

Hasta Kan Örneklerinden Canlı Dolaşımdaki Tümör Hücreleri Rapid İzolasyonu

Enfeksiyon bölgelerinde aktif endotele nötrofil bağlılık konağın inflamatuvar yanıt ayrılmaz bir bileşenidir. Için izin veren bir nötrofil bağlayıcı bir testtir Bu raporda...

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

İnsanlarda vasküler kan etkileşimlerini araştırmak için güvenilir modellerin erişilebilirliği eksiktir. Hem kandaki (ELISA) hem de vasküler kompartmandaki (mikroskopi) hücresel etkileşimleri araştırmak için insan tam kanı ile birleştirilmiş kültürlenmiş primer insan endotel hücrelerinin in vitro bir modelini sunuyoruz.

A Novel In vitro İnsan Tüm Kan ve Endotelyumunun Arasındaki Etkileşimler incelenmesi için Model

Genetik olarak tasarlanmış fare modellerinden primer tümöre özgü endotel hücrelerini izole etmek ve kültürlemek için güvenilir bir yöntem bildiriyoruz.

Tümör spesifik Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü Genişleme

Bu makale, dolaşımdaki tümör hücrelerinden (CTC'ler) prostat kanseri hastasından türetilen ksenogreftler (PDX'ler) oluşturmak için kullanılan bir yöntemi detaylandırmaktadır. CTC'lerden PDX modellerinin oluşturulması, prostat kanserini incelemek için alternatif bir deneysel model sağlar; En sık teşhis edilen tümör ve erkeklerde kanserden sık görülen bir ölüm nedenidir.

Prostat Kanseri Hasta Üretimi Tümör Hücreleri Sirkülasyon gelen Xenograftlarında Modeller Türetilmiş

Biz matris jel fiş anjiyogenez testinin bir varyasyon kullanarak fare insan endotel-pericyte etkileşimleri incelemek için bir protokol mevcut.

Fare Matrix Jel Plug Test kullanma İnsan endotel-pericyte Etkileşim Vivo Çalışmasında

Endotelyal Ata Hücreler (EPC'ler) önemlisi, iskemik dokuların neovaskülarizasyonu katılmaktadırlar. Bu yöntem, periferal kandan alınan insan EPC izolasyonunu, hem de kalp cerrahi hastalarında serum örneklerinde karşı göç potansiyelinin belirlenmesi açıklanmaktadır.

Kalp Damar Cerrahisi sonra serum Örnekleri etkilenerek Sağlıklı Gönüllüler ve Bunların Göçmen Potansiyelden Endotel Ata Hücreleri İzolasyon

Bu iletişim kuralı, prostat kanseri hücreleri, sonraki kastrasyon içi Prostatik enjeksiyon göstermek için hedeftir. Orthotopic önceden klinik androjen bağlı ve kısırlaştırma dayanıklı prostat kanseri hastalığı klinik tümör microenvironment ve immün bir ana bilgisayar bağlamında incelemek için kritik modellerdir.

Kollarındaki ve floresan Orthotopic Syngeneic fare modeli androjen bağlı ve kısırlaştırma dayanıklı prostat kanseri

Tümör endotel hücrelerinin tümör microenvironment önemli belirleyicileri ve hastalığın seyrini vardır. Burada, saf ve uygun endotel hücre insan kolorektal karsinom ve uyuşturucu testi ve Patogenez araştırmalarda kullanılmak üzere normal kolon yalıtımı için bir protokol açıklanmıştır.

Yalıtım Normal kolon ve kolorektal Karsinom - gelişmiş bir iletişim kuralı üzerinden insan endotel hücrelerinin

Bu tahlil, filizlenen anjiyogenezi in vitro olarak kontrol eden biyolojik süreçleri analiz etmek için 3D-kollajen jel içinde kültürlenmiş embriyoid cisimlere farklılaştırılmış fare embriyonik kök hücrelerini kullanır. Bu teknik, ilaçları test etmek, hastalıkları modellemek ve embriyonik olarak ölümcül olan delesyonlar bağlamında spesifik genleri incelemek için uygulanabilir.

In Vitro Vasküler Hastalık Modellemesi ve İlaç Testi için Fare Embriyonik Kök Hücreleri Kullanılarak Anjiyogenezin Üç Boyutlu Filizlenme Testi

Keşfedin, prostat kanserinde dolaşımdaki tümör hücreleri ile endotel hücreleri arasındaki E-selektin aracılı etkileşimleri mikro akış sistemi kullanarak incelemeyi. Bu yöntem metastaz mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Hastalar ve İnsan endotel hücrelerinden türetildiği Prostat dolaşımdaki tümör hücrelerinin arasında E-selektin aracılı Etkileşimleri gözlemleyin vitro Yöntemi (Video) | JoVE Journal

Hastalar ve İnsan endotel hücrelerinden türetildiği Prostat dolaşımdaki tümör hücrelerinin arasında E-selektin aracılı Etkileşimleri gözlemleyin vitro Yöntemi

Daha fazla video keşfet