Name: Bacterial Artificial Chromosomes: uno strumento Genomica Funzionale per lo studio di positivo-strand virus RNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Scopri come creare cromosomi artificiali batterici infettivi contenenti cDNA completo del virus dell'encefalite giapponese. Questo metodo consente di studiare la biologia virale e sviluppare vaccini geneticamente definiti.

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Gli autori desiderano ringraziare il fondo per la scienza, la tecnologia e la ricerca dello Utah per il sostegno di YML e le sovvenzioni della Korea National Research Foundation (2009-0069679 e 2010-0010154) per il sostegno di SIY. Questa ricerca è stata supportata dalla Utah Agricultural Experiment Station, Utah State University, e approvata come rivista numero UAES #8753. Inoltre, gli autori ringraziano la dottoressa Deborah McClellan per l'assistenza editoriale.

Gli autori hanno dichiarato di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il protocollo attuale è stata utilizzata con successo per generare full-length cDNA cloni infettive, per due diversi ceppi (CNU / LP2 27 e SA 14 -14-2 28) di ICE, un flavivirus cui cDNA funzionale ha dimostrato di essere di per sé difficile da costruire e propagare causa della tossicità cellula ospite e l&#39;instabilità genetica del cDNA clonato 8,74-76 Questo protocollo prevede tre componenti principali:. prime, massimizzando la sintesi / amplificazione del cDNA una copia fedele del RNA virale con alta fedeltà transcrittasi inversa / DNA polimerasi; secondo, la clonazione il PRM-E codificanti regione virale contenente sequenze tossiche (dati non pubblicati) 74,77,78 in un bassissimo copia numero vettore BAC del cDNA iniziale subcloning ai full-length fasi di montaggio cDNA finali; e in terzo luogo, utilizzando un tasso alcolemico di clonazione vettore che può ospitare un DNA estraneo con una dimensione media di 120-350 kb, 19-21 che tollera apparentemente più grande inse DNArts di quanto non facciano altri vettori di clonazione. Questo approccio clonazione sarà generalmente applicabile a molti altri virus a RNA positivi filamento, in particolare quelli con una grande genoma RNA del ~ 10 a 32 kb. Generazione di un clone di cDNA infettiva è un passo fondamentale nello sviluppo di un sistema di genetica inversa per virus a RNA, soprattutto per i virus a RNA positivi a filo, perché il suo genoma agisce come mRNA virale che si traduce in proteine ​​dai ribosomi della cellula ospite. Così, la replicazione virale può essere iniziato con l&#39;introduzione di un genoma lunghezza RNA molecola di cDNA derivato in una cellula ospite suscettibile. La disponibilità di un clone di infettiva ICE cDNA, quando combinato con la tecnologia del DNA ricombinante, ha aumentato la nostra comprensione dei vari aspetti del ciclo di vita virale a livello molecolare, come ad esempio l&#39;espressione genica 73,79 e replicazione del genoma. 63,64 Inoltre, un full-length ICE clone di cDNA ha dimostrato di essere uno strumento prezioso per lo sviluppo di vaccini antivirali 28 e vettori di trasferimento genico. &lt;sup&gt; 80,81 Come per tutti i virus RNA positivi fili, ci sono più passaggi critici nella costruzione di un cDNA funzionale affidabile per ICE da cui RNA altamente infettivi possono essere sintetizzate in vitro. Idealmente, la sequenza di RNA sintetici trascritti da un clone della intera lunghezza cDNA dovrebbe essere identica a quella del RNA genomico virale, in particolare i 5&#39;- e 3&#39;-terminale sequenze che sono necessari per l&#39;inizio della replicazione virale RNA . 60-62 Nel protocollo corrente, l&#39;autentica e 5&#39;-3&#39;-estremità erano assicurati mettendo la sequenza del promotore SP6 monte della prima adenina nucleotide del genoma virale e il posizionamento di un sito di restrizione Xba I artificiale unica valle dell&#39;ultimo timina nucleotide del genoma virale, rispettivamente. Capped RNA sintetici con l&#39;autentico 5 &#39;e 3&#39; estremità sono state prodotte dalla trascrizione run-off di un Xba I-linearizzato e MBN trattati cDNA template usando SP6 RNA polimerasi innescato con il m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) Un analogo cap. Questo protocollo può essere modificato in vari modi. Per la trascrizione in vitro, un&#39;altra RNA batteriofago polimerasi (ad esempio, T3 o T7) può essere utilizzato in combinazione con la sua sequenza promotore ben definita. 27 Come sito scolo, un sito di restrizione differente può essere utilizzata se non è presente in il genoma virale e se l&#39;RNA sintetico del cDNA linearizzato termina con l&#39;autentico 3 &#39;. L&#39;importanza della sequenza nucleotidica 3&#39;-end è stata dimostrata da una diminuzione ~ 10 volte in RNA infettività quando un RNA sintetico contiene tre o quattro nucleotidi virus non correlato alla sua &#39;estremità 3. 27 In una reazione di trascrizione in vitro, sia la m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) A e m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) G tappo analogico può essere utilizzato altrettanto bene, anche se queste ultime posti un estraneo G nucleotide supplementare monte del virale 5 &#39;-end, ma cheInoltre non altera l&#39;infettività o la replica di RNA sintetico. 27 Inoltre, la rimozione del cDNA da RNA trascritti di DNasi I digestione non è necessaria per le prove RNA infettività, poiché il modello cDNA sé non è infettiva. 27 La tecnologia BAC è stata ora applicata alla costruzione di cloni di cDNA infettivi per una manciata di virus a RNA positivo filamento, vale a dire, due JEVs, CNU / LP2 27 e SA 14 -14-2 28 (dimensione del genoma, ~ 11 kb); due virus dengue, BR / 90 26 e NGC 29 (~ 11 kb); il virus della diarrea bovina virale, SD1 (~ 12 kb); 25 due classici virus della febbre suina, C e Paderborn (~ 12 kb); 24 il virus della malattia di confine, Gifhorn (~ 12 Kb); 24 il suino virus sindrome riproduttiva e respiratoria , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb); 30 il virus gastroenterite trasmissibile, PUR46-MAD (~ 29 kb); 16 il felino virus della peritonite infettiva,DF-2 (~ 29 kb), 32 la grave sindrome acuta da coronavirus respiratorio, Urbani (~ 30 kb), 9 Medio Oriente sindrome respiratoria coronavirus, EMC / 2012 (~ 30 kb), 17 e coronavirus umano, OC43 (~ 31 kb) 31 Il principale vantaggio di utilizzare BAC per la costruzione di cDNA è l&#39;elevata stabilità genetica delle grandi, 1 o 2 copie plasmidi BAC.; tuttavia, la natura intrinseca del suo numero estremamente basso di copia è anche un grande svantaggio, a causa delle basse rese di DNA BAC e la conseguente riduzione della purezza del DNA BAC rispetto ospitare DNA cromosomico. Nel protocollo attuale, il rendimento del DNA BAC è massimizzata da una crescente E. coli DH10B trasformato con il contagioso BAC PBAC / SA 14 -14-2 in un mezzo ricco di sostanze nutritive, 2xYT. Nonostante questo sforzo, il rendimento medio è solo ~ 15 mg di DNA BAC da 500 ml di brodo 2xYT. Inoltre, la purezza del DNA BAC è meglio realizzato utilizzando CsCl-EtBr centrifugazione in gradiente di densità per la purificazione, Piuttosto che la colonna basata isolamento plasmide comunemente usato. Tuttavia, è importante tenere presente che la E. BAC trasformati coli non deve invadere perché potrebbe mettere a repentaglio la stabilità genetica del cDNA clonato, e una maggiore crescita non necessariamente portare a maggiori rendimenti o superiore purezza BAC DNA. Il protocollo qui descritto è ottimizzato, efficiente, e il metodo semplificato per la costruzione e la propagazione di un full-length geneticamente stabile clone cDNA infettiva come BAC per ICE, una procedura volta pensò praticamente impossibile. Questa stessa strategia di clonazione può anche essere applicato a molti altri virus a RNA positivo filamento. In generale, cloni di cDNA infettivi ci permettono di introdurre una varietà di mutazioni (ad esempio, delezioni, inserzioni e mutazioni puntiformi) in un RNA genoma virale per studiare le loro funzioni biologiche nella replicazione virale e la patogenesi. Questo sistema di genetica inversa basata cDNA-consente di sviluppare e TESt vaccino e candidati terapeutici mirati un fattore di virulenza (s) di un particolare virus RNA positivo filamento di interesse. Inoltre, questa tecnologia cDNA infettiva può essere utilizzato anche come un vettore virale, capace di esprimere un gene estraneo (s) di interesse per molte applicazioni nella ricerca biomedica.

Per virologi di RNA, l&#39;avvento della tecnologia del DNA ricombinante alla fine del 1970 ha permesso di convertire i genomi di RNA virale in cloni di cDNA, che potrebbero poi essere propagati come plasmidi nei batteri per la manipolazione genetica dei virus RNA. 1 Il primo virus RNA per essere molecolarmente clonato era batteriofago Qβ, un virus a RNA positivo filamento che infetta Escherichia coli. Un plasmide contenente una copia completa del cDNA dell&#39;RNA genomico Qβ all&#39;origine infettive fagi Qβ quando introdotto in E. coli. 2 Poco dopo, questa tecnica è stata applicata a poliovirus, virus RNA positivo filamento di esseri umani e animali. Un plasmide recante un full-length cDNA dell&#39;RNA genomico poliovirus è infettivo quando trasfettato in cellule di mammifero e in grado di produrre virioni infettivi 3 In questo approccio &quot;DNA-lanciato&quot;, i cDNA clonati andrebbe trascritto intracellulare di avviare la replicazione dell&#39;RNA virale.;Tuttavia, non è chiaro come si inizia la trascrizione e come le trascrizioni vengono elaborati nella sequenza corretta virale. Questa preoccupazione ha portato allo sviluppo di un&#39;alternativa &quot;RNA-lanciato&quot; approccio, in cui una copia completa del cDNA dell&#39;RNA genoma virale viene clonato sotto promotore riconosciuto da un E. coli o fago RNA polimerasi per la produzione di RNA sintetici in vitro con definito 5 &#39;e 3&#39; termini, che subiscono il ciclo completo di replicazione virale quando introdotto in cellule ospiti. 4,5 Il primo successo con questo approccio è stato segnalato per brome mosaic virus , 6,7 un virus RNA positivo filamento di piante. Da allora, l&#39;approccio RNA lanciato è stato sviluppato per una vasta gamma di virus a RNA positivo filamento, tra cui calicivirus, alphaviruses, flavivirus, arteriviruses e coronavirus. 1,4,5,8 Sia il DNA e RNA-lanciato sistemi genetica inversa, la costruzione di un Full lunghezza clone di cDNA è la chiave per generare DNA infettivo o RNA di virus a RNA positivo filamento, ma diventa una sfida considerevole tecnica come la dimensione degli aumenti genoma virale. 9-17 In particolare, una grande genoma RNA di ~ 10 -32 kb presenta tre principali ostacoli alla clonazione di un cDNA funzionale full-length. 18 La prima difficoltà è la sintesi di un fedele cDNA copiano, poiché la fedeltà di RT-PCR è inversamente proporzionale alla lunghezza del RNA virale. Il secondo ostacolo è la presenza di sequenze potenzialmente tossici, poiché le molecole di RNA lunghi sono più probabile che contengono sequenze inaspettati capaci di rendere il frammento di cDNA in plasmidi instabili in E. coli. Il terzo e più importante problema è la disponibilità di un vettore adatto, dal momento che è difficile trovare un vettore di clonazione che può alloggiare un inserto di cDNA virale&gt; 10 kb. Nel corso degli ultimi tre decenni, queste barriere sono state superate da alcuni progressi in enzimologia, la metodologia, und vectorology. 1,4,5,8 Di questi, lo sviluppo più promettente e innovativo è la clonazione di grandi virus a RNA positivo filamento come infettive cromosomi batterici artificiali (BAC). Il vettore BAC è un plasmide a basso copia clonazione (1-2 copie / cella) in base alla E. coli plasmide f, con una dimensione media di DNA dell&#39;inserto ~ 120-350 kb 19-21 Un frammento di DNA viene inserito nel vettore BAC in modo simile alla clonazione nei vettori di clonazione generali.; le conseguenti cloni BAC sono stabili per molte generazioni a E. coli. 22,23 ad oggi, la tecnologia BAC è stata utilizzata per creare cloni di cDNA infettivi per&gt; 10 membri di tre positivo-strand famiglie di virus RNA, cioè flaviviridae, 24-29 Arteriviridae, 30 e Coronaviridae. 9,16,17 , 31,32 Utilizzando virus dell&#39;encefalite giapponese (JEV), come esempio, il presente lavoro riporta le procedure dettagliate che possono essereutilizzato per costruire un full-length BAC infettiva geneticamente stabile per una varietà di virus RNA positivo filamento. ICE è un flavivirus zoonotici 33 che si trasmette nella natura tra gli uccelli, maiali e altri host vertebrati da zanzare vettori. 34,35 Nell&#39;uomo, l&#39;infezione può causare il ICE spesso fatale malattia neurologica grave encefalite giapponese (JE), 36 che si verifica in Asia e parti del Pacifico occidentale, 37,38 con un&#39;incidenza annuale stimata di ~ 50,000-175,000 casi clinici. 39,40 Il genoma di ICE è un ~ 11 kb, a singolo filamento, positivo-senso molecola di RNA ed è composto da un unico open reading frame (ORF) affiancato da due regioni non codificanti (NCR) al 5 &#39;e 3&#39; termina. 41,42 L&#39;ORF codifica una poliproteina che viene scisso dagli host e proteasi virali per generare 10 singole proteine, designato C, PRM E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, e NS5 nella N in direzione C-terminale. 34,43,44 inoltre, una esotto forma di Xtended NS1 (NS1 &#39;) si esprime con -1 frameshifting ribosomiale ai codoni 8-9 di NS2A. 45,46 Di queste 11 proteine, le tre proteine ​​strutturali (C, PRM, ed E) sono essenziali per la formazione di malattie infettive virioni, 47,48 e le restanti otto proteine ​​non strutturali (NS1 a NS5, e NS1 &#39;) sono fondamentali per la replicazione virale RNA, assemblea 49-51 particella, 52-56 e innata immunità evasione. 57-59 Sia il 5&#39; e 3 &#39;NCR contengono conservati sequenze primarie e strutture forma RNA secondari e / o terziari, 60-62 che sono importanti per modulare la replicazione RNA virale. 63,64 Questo protocollo descrive gli strumenti, i metodi e le strategie per la generazione di un full-length BAC infettiva di ICE SA 14 -14-2. 28 Questo clone BAC funzionale contiene una copia completa del cDNA dell&#39;RNA genomico ICE, 65 che è comprendeva da un promotore per la polimerasi SP6 RNA a montedel virale 5&#39;-end e un sito di restrizione Xba I unica valle del 3&#39;-end virale per la trascrizione in vitro di dilavamento. Questa tecnologia BAC è applicabile alla costruzione di un clone molecolare di cDNA completamente funzionale per una vasta gamma di virus a RNA positivo-strand.

<table><tbody><tr><td><forte>1. Clonazione molecolare</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2xYT Brodo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2377</td><td></td></tr><tr><td>[3H]UTP</td><td>PerkinElmer</td><td>NET380250UC</td><td>Radioattivo</td></tr><tr><td>50 ml Tubo</td><td>Thermo Scientific (Nalgene)</td><td>3114-0050</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Beckman</td><td>Coulter</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio (basso punto di fusione)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>AvaI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0152S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England BioLabs</td><td>R0174S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>BsiWI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0553S</td><td></td></tr><tr><td>BsrGI</td><td>Nuovo Inghilterra BioLabs</td><td>R0575S</td><td></td></tr><tr><td>Butanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di cesio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1595-1</td><td></td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>Carcinogeno</td></tr><tr><td>DE-81 Carta da filtro</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3658-023</td><td></td></tr><tr><td>Miscela dNTP</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18427-088</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH10B&nbsp;</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18297-010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td> Colonna filtrante <td>tossica e altamente mutagena</td></tr><tr><td>(kit plasmidico Maxiprep)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>K2100-26</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>Glucosio irritante</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5400</td><td></td></tr><tr><td>Glicogeno</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>DNA polimerasi ad alta fedeltà</td><td>New England BioLabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isoamilico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9392</td><td>Isopropanolo infiammabile</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0918</td><td>Brodo LB infiammabile</td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di litio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9650</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Amresco</td><td>0663</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Trascrittasi inversa</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>Fagiolo mung nucleasi</td><td>New England BioLabs</td><td>M0250S</td><td></td></tr><tr><td>ago (18G, 20G)</td><td>BD</td><td>305196, 305175</td><td>a rischio biologico (rifiuti taglienti)</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotide</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Sintesi</td><td></td>personalizzata di oligonucleotidi</tr><tr><td>PacI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>pBeloBAC11</td><td>New England BioLabs</td><td>ER2420S (E4154S)</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo (saturo di tampone)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15513-039</td><td>Tossico e altamente corrosivo</td></tr><tr><td>Fenolo:Cloroformio:Alcool isoamilico Life</td><td>Technologies (Invitrogen)</td><td>15593-031</td><td>Fenolo tossico e altamente corrosivo</td></tr><tr><td>:Guanidina Isotiocianato</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>10296-010</td><td>Pme I Tossico, corrosivo e irritante</td></tr><tr><td>Pme I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0560S</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di potassio</td><td>Amresco</td><td>0698</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della RNasi</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>rNTP Set</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in polipropilene sigillabile (16 &volte; 76 mm)& nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>342413</td><td></td></tr><tr><td>SfiI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0123S</td><td></td></tr><tr><td>Sma I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato</td><td>Amresco</td><td>0227</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA polimerasi</td><td>New England BioLabs</td><td>M0207S</td><td></td></tr><tr><td>Spin Column (kit di minipreparazione plasmidica)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>K2100-11</td><td></td></tr><tr><td>Siringa</td><td>HSW NORM-JECT</td><td>4200.000V0</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0826</td><td></td></tr><tr><td>tRNA (lievito)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15401-011</td><td></td></tr><tr><td>XbaI&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>2. Colture cellulari</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alpha Minimal Essential Medium Life</td><td>Technologies (Gibco)</td><td>12561-049</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica (50 mL)</td><td>VWR</td><td>21008-242</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet&nbsp;</td><td>Piatto di coltura Sigma-Aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>(150 mm)&nbsp;</td><td>TPP</td><td>93150&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetta (gap 2 mm)</td><td>Apparecchio Harvard</td><td>450125&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino&nbsp;</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td>Glutammina tossica e cancerogena</td></tr><tr><td>Life</td><td>Technologies (Gibco)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>61100-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a sei pozzetti</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Life Technologies ( Gibco)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Vitamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>3. AttrezzaturaSistema di</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>elettroforesi su gel di agarosio</td><td>Mupid</td><td>MPDEXU-01</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubatore</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heracell 150i</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da tavolo&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>Elettroporatore</td><td>Harvard Apparecchio</td><td>ECM 830</td><td></td></tr><tr><td>Lampade ultraviolette a onde lunghe (palmare)</td><td>UVP</td><td>UVGL-58</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da tavolo</td><td>Coltro Beckman 368826</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td>Tecnologie di vita (Applied Biosystems)</td><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Scientific Industries</td><td>G-560</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>Jeio Tech</td><td>WB-10E</td><td></td></tr></tbody></table>

bacterial artificial chromosomes: uno strumento genomica funzionale per lo studio di positivo-strand virus rna

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

La genetica inversa, un approccio per salvare il virus infettivo interamente da un cDNA clonato, ha rivoluzionato il campo dei virus a RNA a filamento positivo, i cui genomi hanno la stessa polarità dell'mRNA cellulare. Il sistema di genetica inversa basato su cDNA è un metodo seminale che consente la manipolazione diretta dell'RNA genomico virale, generando così virus ricombinanti per studi molecolari e genetici sia degli elementi dell'RNA virale che dei prodotti genici nella replicazione e nella patogenesi virale. Fornisce inoltre una preziosa piattaforma che consente lo sviluppo di vaccini geneticamente definiti e vettori virali per la consegna di geni estranei. Per molti virus a RNA a filamento positivo come il virus dell'encefalite giapponese (JEV), tuttavia, i cDNA clonati sono instabili, ponendo un grave ostacolo alla costruzione e alla propagazione del cDNA funzionale. Qui, il presente rapporto descrive le considerazioni strategiche nella creazione e nell'amplificazione di un cDNA JEV infettivo a lunghezza intera geneticamente stabile come cromosoma artificiale batterico (BAC) utilizzando le seguenti procedure sperimentali generali: isolamento dell'RNA virale, sintesi del cDNA, subclonaggio e modifica del cDNA, assemblaggio di un cDNA a lunghezza intera, linearizzazione del cDNA, in vitro Sintesi dell'RNA e recupero del virus. Questo protocollo fornisce una metodologia generale applicabile alla clonazione di cDNA a lunghezza intera per una serie di virus a RNA a filamento positivo, in particolare quelli con un genoma di >10 kb di lunghezza, in un vettore BAC, da cui gli RNA infettivi possono essere trascritti in vitro con una RNA polimerasi batteriofago.

Per tutti i virus RNA positivi filamento, l&#39;affidabilità e l&#39;efficienza di un sistema di genetica inversa dipendono dalla stabilità genetica di un full-length cDNA clonato, la cui sequenza è equivalente alla sequenza consensus di RNA genomico virale. 27 La Figura 1 mostra un cinque strategia passo per la costruzione di un cDNA infettiva intera lunghezza come per BAC ICE SA 14 -14-2 28: Fase 1, purificazione dell&#39;RNA virale dal supernatante di coltura cellulare di ICE-infettate cellule BHK-21 (Figura 1A); Fase 2, la sintesi di quattro ampliconi cDNA sovrapposti (da F1 a F4) che coprono l&#39;intero genoma virale (Figura 1B); Fase 3, subcloning di ciascuno dei quattro frammenti di cDNA contigui in un vettore BAC, creando PBAC / F1 a PBAC / F4 (Figura 1C); Fase 4, la modifica dei cDNA clonati per la trascrizione in vitro run-off con SP6 RNA polimerasi, cioè, mettendo un SP6sequenza promotrice immediatamente a monte del virale 5&#39;-end (PBAC / F1 SP6), eliminando un preesistente sito interno Xba I al nucleotide 9131 introducendo una mutazione puntiforme silenzioso, 9134 A → T (PBAC / F3 KO), ed inserendo un sito immediatamente a valle del virale 3&#39;-end (PBAC / F4 RO) (Figura 1D) nuovo Xba artificiale I run-off; e Step 5, il montaggio di un full-length SA 14 -14-2 cDNA BAC, PBAC / SA 14 -14-2 (Figura 1E). La tabella 1 elenca i oligonucleotidi utilizzati in questa procedura di clonazione. 28 Per la costruzione di un funzionale ICE cDNA, il primo passo importante è la sintesi dei quattro frammenti di cDNA sovrapposizioni con RNA virale purificato come modello per RT-PCR. La Figura 2 fornisce un risultato rappresentativo per i quattro prodotti RT-PCR che erano elettroforesi su 0,8%gel di agarosio. Questo gel dimostra chiaramente che un integrale ICE cDNA viene amplificato in quattro frammenti di cDNA sovrapposti. Occasionalmente, reazioni di RT-PCR potrebbero produrre uno o più prodotti specifici per il virus o aspecifiche che sono per lo più piccolo del prodotto atteso, a causa della ricottura non specifico di primer durante cDNA sintesi / amplificazione. D&#39;altra parte, poca o nessuna prevede prodotto RT-PCR sarebbe amplificato a causa della contaminazione RNasi accidentale durante l&#39;isolamento dell&#39;RNA virale o improprio prestazioni RT-PCR. Il successivo passaggio chiave è la clonazione e la modifica di un integrale parzialmente autonome o ICE cDNA in BAC, che è una procedura relativamente semplice che utilizza tecniche di DNA ricombinante standard. 69 Figura 3 presenta un risultato rappresentativo per la purificazione del clone BAC contenenti un full-length cDNA di ICE SA 14 -14-2 da bande in un gradiente di CsCl-EtBr.In questo esperimento, dopo centrifugazione per 16 ore a 401.700 xg, due bande distinte, vale a dire, la E. coli DNA cromosomico sopra e la BAC DNA plasmidico superavvolto seguito, sono visibili al centro del tubo sotto la luce ultravioletta a onda lunga. Un volume minimo (~ 400 microlitri) della fascia BAC DNA inferiore è stato accuratamente recuperato colpendo un foro con una siringa sul lato del tubo. Successivamente, l&#39;EtBr è stato estratto dal DNA BAC per estrazione butanolo, e il BAC DNA libero-EtBr stata concentrata mediante precipitazione in etanolo. Il passo finale è la determinazione della infettività specifica degli RNA trascritti in vitro di sintesi dal full-length SA 14 -14-2 BAC (PBAC / SA 14 -14-2) dopo RNA trasfezione in cellule permissive (Figura 4). Questa fase prevede tre fasi successive: Fase 1, linearizzazione del full-length SA 14 -14-2 cDNA al 3 &#39;-end del genoma virale (Figura 4A); Fase 2, la produzione di RNA di sintesi del cDNA linearizzata di run-off di trascrizione (Figura 4B); e Step 3, salvataggio dei virus ricombinanti in BHK-21 cellule transfettate con RNA sintetici (Figura 4C). Sperimentalmente, due cloni indipendenti di PBAC / SA 14 -14-2 stati linearizzati con Xba I digestione e trattati con MBN per rimuovere le quattro-base 5 sbalzo &#39;generato dalla digestione Xba I. I BAC linearizzate sono stati puliti da estrazione con fenolo-cloroformio, seguita da precipitazione in etanolo. La linearizzazione delle due BAC purificati è stata dimostrata su un gel di agarosio 0,8% (Figura 5A). L&#39;estrazione con fenolo-cloroformio deve essere fatto con attenzione per assicurare che le BAC linearizzate sono privi di RNasi. Ciascuno dei due BAC linearizzate servito come modello per la trascrizione cDNA scolo usando SP6 RNA polimerasi in presenza di m 7 G (5 &#39;) PPP (5&#39;) Un analogo cap. L&#39;integrità degli RNA sintetici stato dimostrato eseguendo aliquote delle due miscele di reazione trascrizione su un gel di agarosio 0,6%, con un kb scala di riferimento 1 DNA (Figura 5B). In questo semplice test, la principale fascia RNA prominente sempre migrato solo al di sotto dei 3 kb riferimento banda DNA e sembrava essere tagliente. Tuttavia, degradato RNA avrebbe un aspetto spalmato sullo stesso gel. Un test centro infettiva è il gold standard per la determinazione del infettività specifica dei RNA sintetici. Questo test è stato fatto da electroporating cellule BHK-21 con campioni di RNA, la semina uguali aliquote delle 10 volte le cellule elettroporate serialmente diluiti in 6 pozzetti contenenti naïve cellule BHK-21 (3 x 10 5 cellule / pozzetto), e la sovrapposizione agarosio sui monostrati cellulari. Dopo incubazione per 4 giorni, cellule sopravvissute sono state fissate con formaldeide e colorate con cristalvioletto soluzione di quantificare il numero di centri infettive (placche), che corrisponde al numero di molecole di RNA infettivi trasportati nelle cellule (Figura 6A). Poiché il cDNA utilizzato per la trascrizione in vitro è stato dimostrato di essere non-infettiva, 27 una aliquota della miscela di reazione di trascrizione è stata utilizzata direttamente per elettroporazione. Elettroporazione è il metodo preferito per l&#39;RNA trasfezione; In alternativa, RNA possono essere trasfettate con altri metodi usando liposomi DEAE-destrano e cationici. RNA elettroporazione è molto efficace, ma &quot;arco&quot; dell&#39;impulso elettrico si verifica raramente, se sono presenti nella reazione elettroporazione o se la cuvetta elettroporazione viene riutilizzato sali. L&#39;espressione di proteine ​​virali in cellule transfettate RNA è stato esaminato mediante saggi di immunofluorescenza usando un antisiero di coniglio anti-NS1 (Figura 6B). La produzione di particelle virali accumulati nei surnatanti di cellule transfettate RNA eraalyzed mediante saggi placca (Figura 6C). I risultati di questi esperimenti mostrano chiaramente che gli RNA sintetici cDNA derivati ​​sono infettive in permissivi cellule BHK-21, generando un alto titolo di virus ricombinanti. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Oligonucleotide </td><td> Sequenza di un (5 &#39;a 3&#39;) </td><td> Posizione b </td><td> Polarità </td></tr><tr><td> 1RT </td><td> TAGGGATCTGGGCGTTTCTG GCAAAT </td><td> 2578-2603 </td><td> Antisenso </td></tr><tr><td> 1F </td><td> aatcccgggAGAAGTTTATC TGTGTGAACTT </td><td> 1-22 </td><td> Senso </td></tr><tr><td> 1R </td><td> attgcggccgcCCACGTCGT TGTGCACGAAGAT </td><td> 2532-2553 </td><td> Antisenso </td></tr><tr><td> 2RT </td><td> TTCTGCCTACTCTGCCCCTC CGTTGA </td><td> 5975-6000 </td><td> FormicaIo percepisco </td></tr><tr><td> 2F </td><td> aatcccgggTCAAGCTCAGT GATGTTAACAT </td><td> 1800-1821 </td><td> Senso </td></tr><tr><td> 2R </td><td> attgcggccgcGATGGGTTT CCGAGGATGACTC </td><td> 5929-5950 </td><td> Antisenso </td></tr><tr><td> 3RT </td><td> ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC AGGTCT </td><td> 9426-9451 </td><td> Antisenso </td></tr><tr><td> 3F </td><td> aatcccgggGAGGATACATT GCTACCAAGGT </td><td> 5500-5521 </td><td> Senso </td></tr><tr><td> 3R </td><td> attgcggccgcGTAAGTCAG TTCAATTATGGCT </td><td> 9380-9401 </td><td> Antisenso </td></tr><tr><td> 4RT </td><td> AGATCCTGTGTTCTTCCTCA CCACCA </td><td> 10.952-10.977 </td><td> Antisenso </td></tr><tr><td> 4F </td><td> aatcccgggAGTGGAAGGCT CAGGCGTCCAA </td><td> 9200-9221 </td><td> Senso </td></tr><tr><td> 4R </td><td> attgcggccgcAGATCCTGT GTTCTTCCTCACC </td><td> 10.956-10.977 </td><td> Antisenso </td></tr><tr><td> SP6F </td><td> cataccccgcgtattcccac ta </td><td></td><td> Senso </td></tr><tr><td> SP6R </td><td> ACAGATAAACTTCTctatag tgtcccctaaa </td><td> 1-14 </td><td> Antisenso </td></tr><tr><td> F1F </td><td> aggggacactatagAGAAGT TTATCTGTGTG </td><td> 1-17 </td><td> Senso </td></tr><tr><td> F1R </td><td> TGGATCATTGCCCATGGTAA GCTTA </td><td> 638-662 </td><td> Antisenso </td></tr><tr><td> X1f </td><td> CGAATGGATCGCACAGTGTG GAGAG </td><td> 8403-8427 </td><td> Senso </td></tr><tr><td> X1R </td><td> AAAGCTTCAAACTCAAGATA CCGTGCTCC </td><td> 9120-9148 </td><td> Antisenso </td></tr><tr><td> X2F </td><td> GGAGCACGGTATCTTGAGTT TGAAGCTTT </td><td> 9120-9148 </td><td> Senso </td></tr><tr><td> X2R </td><td> cacgtggacgagggcatgcc tgcag </td><td></td><td> Antisenso </td></tr><tr><td> ROF </td><td> CCAGGAGGACTGGGTTACCA AAGCC </td><td> 10.670-10.694 </td><td> Senso </td></tr><tr><td> ROR </td><td> agggcggccgctctagAGAT CCTGTGTTCTTCCTCACCAC </td><td> 10.954-10.977 </td><td> Antisenso </td></tr><tr><td colspan="4"> una sequenza JEV sono riportati in lettere maiuscole, e le sequenze BAC sono indicati in lettere minuscole. posizione b Nucleotide si riferisce alla sequenza completa del genoma di ICE SA 14 -14-2 (numero di accesso Genbank JN604986). </td></tr></tbody></table> Tabella 1: oligonucleotidi utilizzati per la sintesi del DNA, amplificazione PCR, e BAC mutagenesi. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig1.jpg" /> Figura 1.0; strategia per la costruzione di un full-length cDNA di ICE SA 14 -14-2 come BAC (A) Isolamento di RNA virale da particelle ICE.. Viene mostrato un diagramma schematico del RNA genomico di ICE SA 14 -14-2. (B) Sintesi di quattro frammenti di cDNA sovrapposti (F1 a F4) che copre l&#39;intero genoma virale. (C) Subclonaggio di quattro frammenti di cDNA sovrapposti in un vettore BAC, creando PBAC / F1 a PBAC / F4. (D) Modifica dei cDNA clonati per la trascrizione ballottaggio in vitro. PBAC / F1 SP6 è un derivato di PBAC / F1 che contiene la sequenza del promotore SP6 monte del virale 5&#39;-end. PBAC / F3 KO è un derivato di PBAC / F3 che contiene una mutazione puntiforme silente (A 9134 → T, asterisco). PBAC / F4 RO è un derivato del PBAC / F4 che contiene un artificiale Xba I sito deflusso a valle del virale 3&#39;-end. (E </<html> strong&gt;) Assemblaggio di un full-length SA 14 -14-2 BAC (PBAC / SA 14 -14-2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig2.jpg" /> Figura 2. Sintesi di quattro frammenti di cDNA sovrapposti (da F1 a F4) che attraversa il full-length RNA genomico di ICE SA 14 -14-2. I quattro prodotti RT-PCR vengono valutati mediante elettroforesi in gel di agarosio 0,8%. M, 1 kb scala del DNA. Le dimensioni attese dei quattro frammenti di cDNA sono indicati nella parte inferiore dell&#39;immagine gel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> /ftp_upload/53164/53164fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Purificazione della BAC contenente un full-length cDNA di ICE SA 14 -14-2. Il plasmide BAC è isolato dal E. coli DH10B con il metodo di lisi SDS-alcalino e ulteriormente purificato mediante bande in un gradiente di CsCl-EtBr. Presentato è un esempio del gradiente CsCl-EtBr utilizzando un tubo di polipropilene sigillato 16 × 76 millimetri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig4.jpg" /> Figura 4. Sommario del recupero di virus infettivi da un integrale ICE SA 14 -14-2 cDNA assemblato in un BAC. (A) linearizzazione del cDNA. Il full-length ICE BAC è tagliato conXba I e trattati con MBN. (B) Sintesi dei trascritti di RNA. Il cDNA linearizzato viene trascritto da RNA polimerasi SP6 in presenza di m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) Un analogo cap. (C) Recupero del sintetico JEVs. In vitro RNA trascritti sono trasfettati in cellule BHK-21 per l&#39;elettroporazione, che genera un alto titolo di virus sintetico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig5.jpg" /> Figura 5. Sintesi degli RNA mediante trascrizione in vitro utilizzando un full-length BAC ICE come modello cDNA. (A) Generazione del full-length linearizzato ICE BAC, PBAC / SA 14 -14-2. Due cloni indipendenti di PBAC/ SA 14 -14-2 (Cl.1 e Cl.2) linearizzate mediante digestione con Xba I e successivo trattamento con MBN. I BAC linearizzate sono esaminati mediante elettroforesi su gel di agarosio 0,8%. (B) La produzione di RNA sintetici per trascrizione run-off. Ciascuno dei due BAC linearizzate viene utilizzato come modello per SP6 RNA polimerasi di trascrizione run-off. Aliquote delle due reazioni di trascrizione vengono eseguiti su un gel di agarosio 0,6%. M, 1 kb scala del DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig6.jpg" /> Figura 6. infettività specifica dei RNA sintetici trascritti da un BAC ICE full-length e il recupero del virus sintetico. BHK-21 cellule sono mock-elettroporate (Mock) o elettroporate con i trascritti di RNA derivati ​​from ciascuno dei due cloni indipendenti del full-length ICE BAC (Cl.1 e Cl.2). (A) RNA infettività. Le cellule sono sovrapposti con agarosio e colorate con cristallo viola a 4 giorni dopo la trasfezione. RNA infettività è determinata mediante saggi centro infettivi per stimare la quantità di RNA infettivi elettroporate nelle cellule (pannello di sinistra). Inoltre, le immagini rappresentative di centri infettive sono riportati (pannello di destra). (B) L&#39;espressione proteica. Le cellule sono coltivate in 4 pozzetti camera di diapositive. Espressione di proteine ​​virali in cellule elettroporate-RNA a 20 ore dopo la trasfezione (HPT) viene analizzata mediante saggi di immunofluorescenza usando un antisiero di coniglio anti-NS1 primaria e IgG anti-coniglio di capra secondario Cy3-coniugato (rosso). I nuclei sono contrastate con 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolo (blu). Le immagini di immunofluorescenza sono sovrapposte le immagini di contrasto interferenza corrispondente differenziali. (C) resa virus. Le cellule vengono coltivate in 150 piatti mm cultura. La produzione di virioni infettivi accumulati nei sovranatanti di coltura di cellule RNA-elettroporate a 22 e 40 HPT viene esaminato attraverso saggi placca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Qui, viene presentato un protocollo per la creazione di un cromosoma artificiale batterico infettivo contenente un cDNA a lunghezza intera dell'RNA genomico a filamento positivo del virus dell'encefalite giapponese. Questo protocollo può essere utilizzato per costruire un cDNA funzionale di altri virus a RNA a filamento positivo, rendendolo un potente strumento genomico per lo studio della biologia dei virus.

Bacterial Artificial Chromosomes: uno strumento Genomica Funzionale per lo studio di positivo-strand virus RNA

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere particelle virali infettive prodotte interamente da un cDNA clonato di virus a RNA a filamento positivo, i cui genomi presentano la stessa polarità dell'mRNA cellulare, come il virus dell'encefalite giapponese. La genetica inversa basata su cDNA è un metodo fondamentale che consente la manipolazione diretta dell'RNA genomico virale, generando così virus ricombinanti per lo studio molecolare e genetico della replicazione virale e della patogenesi. Questa tecnica fornisce inoltre una piattaforma preziosa che permette lo sviluppo di vettori virali vaccinici geneticamente definiti per il trasferimento di geni estranei.Questi metodi sono applicabili al clonaggio di cDNA di lunghezza completa per virus a RNA a polarità negativa o positiva, in particolare quelli con genomi più grandi di 10 kb. A dimostrazione della procedura ci saranno diversi membri del mio laboratorio: l'assistente di ricerca Sang-Im Yun, i ricercatori postdottorandi Byung-Hak Song e Jin-Kyoung Kim e lo studente universitario Jordan Frank.La parte video di questa pubblicazione illustra la preparazione del cromosoma artificiale batterico contenente le sequenze di interesse, la sintesi dell'RNA trascritto dal plasmide, nonché come misurare l'infettività dell'RNA e il rendimento virale. Tutte le procedure eseguite prima della generazione del plasmide BAC sono descritte nel protocollo testuale con grande dettaglio. Per questa procedura, coltivare innanzitutto una singola colonia di E. coli DH10B, portatrice del plasmide BAC, in tre millilitri di brodo 2X YT contenente cloramfenicolo. Incubare la coltura per 10 ore a 35 gradi Celsius con agitazione a 225-250 giri al minuto.Dopo 10 ore, aumentare la scala della coltura. Quindi inoculare 500 microlitri di coltura in 500 millilitri di mezzo e coltivare l'inoculo per sei ore con agitazione vigorosa. Dopo sei ore, centrifugare la coltura batterica in 2 bottiglie da 250 millilitri a 3.100 ×g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, risospendere ogni pellet in 30 millilitri di soluzione GTE.Aggiungere 500 microlitri di lisozima e incubare le sospensioni sul ghiaccio per 10 minuti. Nel frattempo, preparare una soluzione di lisi fresca per il passaggio successivo. Dopo 10 minuti, aggiungere 60 millilitri della soluzione di lisi e mescolare ruotando delicatamente fino a quando la soluzione appare limpida.Lasciare avvenire le reazioni a temperatura ambiente per 10 minuti. Successivamente, aggiungere 45 millilitri di soluzione di neutralizzazione in ciascun flacone e capovolgere i flaconi fino a quando non siano completamente miscelati. Poi metterli sul ghiaccio per 10 minuti.Raccogliere i lisati neutralizzati mediante centrifugazione refrigerata ad alta forza g. Quindi trasferire i soprannatanti in due nuovi flaconi da 250 millilitri. Aggiungere 0,6 volumi di isopropanolo al 100% a ciascun flacone e porli sul ghiaccio per 20 minuti.Successivamente, centrifugare i precipitati, scartare i soprannatanti e sciogliere i pellet in cinque millilitri di tampone TE. Unire i due volumi in un unico tubo da 50 millilitri e precipitare l'RNA aggiungendo un volume uguale di cloruro di litio 5 M e incubando la miscela su ghiaccio per 10 minuti. Utilizzare una centrifugazione fredda di 20 minuti per raccogliere il precipitato di RNA.Quindi trasferire il soprannatante in un nuovo tubo da 250 millilitri, aggiungere due volumi di isopropanolo al 100% e porre il tubo sul ghiaccio in modo che si formi il precipitato di DNA. Dopo 20 minuti, centrifugare per far sedimentare il precipitato, aspirare il soprannatante, risospendere il pellet di DNA in 9,5 millilitri di tampone TE e trasferire la soluzione di DNA in un tubo da 50 millilitri.Proseguire la preparazione impostando il gradiente di cloruro di cesio con bromuro di etidio. Caricare la miscela in un tubo in polipropilene sigillabile utilizzando una siringa con un ago da 18 gauge e sigillare il tubo. Centrifugare il tubo sigillato tutta la notte in un ultracentrifugo per formare un gradiente di cloruro di cesio.Il giorno successivo, raccogliere una banda di DNA del plasmide BAC dal gradiente al cloruro di cesio. Utilizzare un ago da 18 gauge per creare un'apertura di ventilazione nella parte superiore del gradiente e un ago da 20 gauge con siringa per raccogliere il DNA BAC dal lato del gradiente, quindi trasferire il campione in una provetta microcentrifuga da 1,7 millilitri. Eseguire un lavaggio, aggiungendo 2,5 volumi di butanolo saturo di acqua e mescolare con vortexing normale.Quindi centrifugare la miscela a temperatura ambiente e trasferire la fase acquosa inferiore in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,7 millilitri. Ripetere questo lavaggio un totale di sei volte per rimuovere tutto il bromuro di etidio. A questo punto, precipitare il DNA BAC. Aggiungere al tubo un decimo di volume di acetato di sodio 3 molar e 2,5 volumi di etanolo al 100%. Incubare la miscela sul ghiaccio per 10 minuti. Quindi centrifugare il precipitato a temperatura ambiente e lavare il pellet di DNA con un millilitro di etanolo al 70%. Ripetere la centrifugazione e raccogliere nuovamente il pellet. Infine, asciugare il DNA pelletizzato all'aria per 10 minuti ed eluirlo in 200 microlitri di tampone TE.Iniziare con una digestione su larga scala del plasmide BAC mediante l'enzima di restrizione Xba-I in un volume totale di 100 microlitri. Eseguire questa digestione a 37 gradi Celsius per 12-15 ore. Successivamente, proseguire l'incubazione della digestione con ulteriori 25 unità di nuclease di mung-bean a 30 gradi Celsius per due ore.Dopo l'incubazione, portare il volume a 300 microlitri con acqua distillata. Eseguire ora un'estrazione fenolica aggiungendo un volume uguale di fenolo-cloroformio, alcol isoamilo al campione diluito, vortexando vigorosamente per un minuto, centrifugando il tubo e trasferendo la fase acquosa superiore in un nuovo tubo.Quindi ripetere l'estrazione con cloroformio. Successivamente, recuperare il DNA BAC linearizzato mediante precipitazione alcolica. Raccogliere il pellet di DNA mediante centrifugazione, scartare il soprannatante e lavare il pellet con un millilitro di etanolo al 70%. Ripetere la centrifugazione e lasciare asciugare il pellet all'aria. Dopo 10 minuti di essiccazione, sciogliere il pellet di DNA in 30 microlitri di acqua distillata. Quindi analizzare un microlitro del BAC recuperato su un gel di agarosio allo 0,8%.Successivamente, impostare una trascrizione di runoff di 25 microlitri del DNA BAC linearizzato, inclusa UTP triziata per la quantificazione dell'RNA. Eseguire la reazione a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi analizzare uno o due microlitri della reazione di trascrizione di runoff su un gel di agarosio allo 0,6%.Iniziare con cellule BHK-21 coltivate per 24 ore in piatti da 150 millimetri seminati a 3 milioni di cellule per piatto. Lavare il monostrato cellulare con soluzione A fredda e quindi staccare le cellule mediante trypsinizzazione. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 270 g per due minuti.Quindi risospendere le cellule in 50 millilitri di soluzione A fredda e centrifugarle nuovamente. Ripetere questo lavaggio per tre volte. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le cellule a 20 milioni per millilitro in soluzione A. Quindi mescolare un'aliquote di 400 microlitri della sospensione cellulare con due microgrammi di RNA sintetico in una cuvetta da due millimetri.Elettroporare immediatamente la miscela in condizioni ottimali e lasciare riposare le cellule per 10 minuti. Trasferire quindi le cellule in una provetta microcentrifuga contenente 600 microlitri di mezzo di coltura completo. Preparare ora delle diluizioni seriali decrescenti delle cellule elettroporate in volumi di un millilitro. Piastrare aliquote di 100 microlitri di ciascuna diluizione su monocapati di cellule BHK21 normali. Dopo un'incubazione di quattro-sei ore, ricoprire le cellule con agarosio allo 0,5% in MEM aggiunto di FBS e coltivare per altri quattro giorni.Le cellule BHK21 sono state sottoposte a elettroporazione fittizia o elettroporate con trascritti di RNA derivati da due cloni indipendenti del JEV-BAC a lunghezza intera. Quattro giorni dopo, le cellule sono state colorate con violetto di cristallo per visualizzare l'RNA infettivo all'interno delle cellule. Mediante questa colorazione, sono stati quantificati i centri infettivi. Successivamente, l'espressione delle proteine virali è stata analizzata in cellule elettroporate con RNA a 20 ore post trasfezione, utilizzando un antisiero da coniglio anti-NS1 e un anticorpo secondario coniugato con Cy3, visibile in rosso. I nuclei sono stati contrastati con DAPI, visibile in blu. Successivamente, a 22 e 40 ore post trasfezione, la produzione di virioni infettivi accumulati nei supernatanti di coltura delle cellule elettroporate con RNA è stata valutata mediante saggi di placca.Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare un virus infettivo interamente da un cDNA clonato di una ceppo positivo, RNA, come il virus dell'encefalite giapponese. Pertanto, non dimenticare che lavorare con il virus dell'encefalite giapponese e altri patogeni umani può essere estremamente pericoloso. È necessaria un'adeguata formazione in materia di sicurezza biologica prima di eseguire questa procedura.

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