Name: Un método de rendimiento eficiente y de alta para el aislamiento de ratón subconjuntos de células dendríticas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprenda un método de alto rendimiento para aislar subconjuntos de células dendríticas de bazo murino usando Flt-3 ligand. Esta técnica permite obtener poblaciones puras para estudios inmunológicos avanzados.

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Este trabajo fue apoyado por el NIH / NIAID AI45889 subvención a SAP de citometría de flujo estudios se llevaron a cabo utilizando las instalaciones centrales de FACS apoyados por el Centro de Cáncer de Einstein (NIH / NCI CA013330) y el Centro para la Investigación del SIDA (NIH / NIAID AI51519).

Los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las directrices aprobadas por el Comité Institucional Cuidado de Animales y el uso (IACUC). Todos los procedimientos que requieren la esterilidad se llevan a cabo en una cabina de bioseguridad. 1. Implantación de B16.Flt3L melanoma en ratones <ol><li> Cultura la expresión de línea de Flt-3 B16 melanoma celular en T25 matraces de cultivo tisular a una densidad de 0,5 x 10 6 células / ml en medio completo DMEM con 10% de CO2 a 37 ° C. Creciendo hasta que las células alcanzan ~ 90% de confluencia (~ 20 h). </li><li> Recoger las células por digestión con tripsina. Aspirar los medios de cultivo celular y se lavan las células adherentes con PBS. Añadir 5 ml de tripsina al 0,05% y se incuba durante 5 min a 37 ° C. Añadir 20 ml fríos medio completo DMEM (4 ° C) que contiene suero de ternera fetal (FCS) para extinguir la digestión con proteasas. Levantar las células fuera golpeando ligeramente seguido pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. </li><li> Recoger las células por centrifugación a 300xg durante 10 min a 4 ° C. Contar las células utilizando un hemocitómetro o un contador de la viabilidad celular automatizado. Resuspender a una densidad de 10 8 células / ml en PBS. </li><li> Ratones implante (C57BL / 6 o de otra cepa histocompatible) con células tumorales mediante inyección subcutánea como se describe por Machholz et al. 19 en la base del cuello con 100 l de suspensión de células (10 7 células). </li><li> Deje que el tumor crezca hasta palpables o visibles (2 - 10 mm de diámetro, generalmente 7 - 12 días) antes de sacrificar animales para la extracción de órganos. </li></ol> 2. Preparación de esplénica suspensión de células individuales a partir de ratones portadores de tumor <ol><li> Anestesiar a los ratones con una sobredosis de isoflurano (ajuste la velocidad de flujo de isoflurano a&gt; 5% y continuar la exposición al menos 2 minutos después de dejar de respirar). Sacrificar el ratón portador de un tumor de melanoma Flt-3 por dislocación cervical según las directrices institucionales para la eutanasia. </li><li> disinfect la piel con 70% de etanol y el bazo cosecha utilizando una técnica aséptica con la ayuda de unas tijeras estériles 20. </li><li> Coloque el bazo en una placa de Petri estéril para su transporte a la cabina de bioseguridad. Realizar todos los pasos de aquí en adelante en condiciones estériles. </li><li> Transferencia de bazo a un plato fresco Petri y se lava con medio RPMI. Cortar el bazo en trozos pequeños (~ 0,2 cm 2) utilizando un bisturí. Incubar durante 30 min a 37 ° C con 10 ml de solución de colagenasa / DNasa. </li><li> Se vierte la suspensión parcialmente digerido de tejido esplénico en un filtro de células de 70 micras. Comprimir los fragmentos de tejido restante a través de la malla del filtro utilizando un émbolo de la jeringa 5 ml. </li><li> Lavar el filtro de malla con 10 ml de medio fresco y deseche el filtro. Centrifugar la suspensión a 300 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar las células. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 2 ml de tampón de lisis RBC. Se incuba a RT fo 10 min. Se detiene el tampón de lisis RBC mediante la adición de 10 ml de medio completo RPMI. </li><li> Sedimentar las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Resuspender en volumen apropiado para alcanzar la densidad celular de 10 8 células / ml en tampón de clasificación de células (por ejemplo, MACS) que contiene 20 mg / ml de anticuerpo Fc-bloque (2.4G2). </li></ol> 3. Purificación de plasmocitoide DC, DC y CD8a Pos Neg CD8a países en desarrollo de esplénica suspensión de células individuales Nota: El aislamiento de los subconjuntos de DC esplénicos de suspensión de células individuales es un procedimiento de múltiples etapas como se ilustra en la Figura 1 Realizar todos los pasos usando tampón de pre-enfriado y un baño de agua con hielo para mantener la temperatura a 4-8 ° C.. Todos los volúmenes de reactivos en el siguiente apartado del protocolo se calculan para una entrada inicial de 200 l de suspensión de células del bazo a los 10 8 células / ml). Esto se puede escalar hacia arriba o haciaabajo función de sus necesidades, cambiando el volumen de suspensión celular (siempre a una densidad de 1 x 10 8 células / ml) y otros reactivos proporcionalmente en la etapa inicial (3.1.1 y 3.2.1). Ajustar los volúmenes de reactivo en todos los pasos posteriores en consecuencia. Por ejemplo, si a partir de 100 l de suspensión de células del bazo en 1 x 10 8 / ml, utilizar la mitad de los volúmenes de reactivos indicadas en todos los pasos. <ol><li> El aislamiento de los DC plasmocitoide (PDC) <ol><li> Añadir 300 l de cóctel de anticuerpo marcado con biotina en el kit plasmocitoide aislamiento de CC a 200 l de suspensión celular esplénica. </li><li> Mezclar bien e incubar en hielo baño de agua durante 15 minutos. Toque en el tubo de cada 3 minutos para mantener las células en suspensión, y para maximizar la unión de los anticuerpos. </li><li> Añadir 12 ml de células de tampón de clasificación y sedimentar las células por centrifugación a 300 x g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante para eliminar los anticuerpos no unidos con biotina. </li><li> Resuspender la célulaprecipitado en 500 l de tampón de clasificación de células. Añadir 300 l de perlas de anticuerpo conjugado con anti-biotina. Repita el paso 3.1.2 y 3.1.3. </li><li> Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 2 ml de tampón de clasificación de células. Realizar todos los pasos de este punto en adelante a temperatura ambiente utilizando tampones pre-enfriado. </li><li> Coloque una célula activada magnética fresca de clasificación de columna LS en el soporte magnético. Lavar y equilibrar la columna con 5 ml de tampón de clasificación de células. </li><li> Pipetear la suspensión celular en la columna, aplicando suavemente para el centro de la superficie del lecho de la columna. Recoger el flujo a través. </li><li> Lavar la columna con 10 ml de tampón de clasificación de células. Recoger este flujo a través y se combinan con el flujo a través del paso 3.1.7. Los PDC se enriquecen en este flujo a través de la columna (FT1). </li><li> Sedimentar las células de FT1 por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C, se resuspenden en 2 ml de tampón de clasificación celular y pasar las células a través de una columna LS frescorepitiendo los pasos 3.1.6 - 3.1.8. Este uso de dos columnas secuenciales produce una mayor pureza de las células aisladas. </li><li> Precipitar las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C, y resuspender con 2 ml RPMI completo. Colocar en hielo hasta que se necesite. </li></ol></li><li> Aislamiento de CD8a Pos Neg CD8a y los países en desarrollo Nota: El primer paso en este procedimiento es el agotamiento de las células B, PDC, T y NK. <ol><li> A partir de toda la suspensión de células de bazo (1 ml de 10 8 células / ml obtenidos en la etapa 2.8), añadir 100 l de cóctel de anticuerpo conjugado con biotina proporcionado en el kit de aislamiento de CD8a Pos DC. </li><li> Mezclar bien e incubar en hielo baño de agua durante 15 minutos. Toque en el tubo suavemente cada 3 minutos para maximizar la unión de los anticuerpos marcados con biotina a sus células diana. </li><li> Añadir 12 ml de células de tampón de clasificación y sedimentar las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar súpersobrenadante para eliminar los anticuerpos no unidos con biotina. </li><li> Añadir 150 l de tampón de clasificación celular y 100 l de perlas de anti-biotina proporcionados en el kit de aislamiento de CD8a Pos DC. Mezclar bien e incubar en hielo baño de agua durante 15 minutos. </li><li> Añadir 10 ml de células de tampón de clasificación y sedimentar las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender las células en tampón de clasificación 1 ml de células y pasar por encima de una columna LS fresca acuerdo con el procedimiento en los pasos 3.1.6 a través de 3.1.8. </li><li> Recoger el flujo sin etiqueta a 2 (FT2) y desechar el material retenido columna. Esta fracción se enriquece sin etiqueta para CD8a Pos Neg CD8a y los países en desarrollo. </li><li> Sedimentar las células en FT2 por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender las células en tampón de clasificación celular 1 ml y añadir 200 l de perlas magnéticas conjugadas-CD8a contra proporcionados en el kit de aislamiento de CD8a Pos DC. </li><li> Repscomer pasos 3.2.2 a través de 3.2.6. El flujo a través de la columna se enriquece para CD8a Neg DC y agota para CD8a Pos países en desarrollo. Esto se denomina flujo a través de 3 (T3L). </li><li> Para eluir el CD8a Pos DCs retenido en la columna, eliminar la columna del imán, añadir 5 ml de tampón de clasificación celular y purgar la matriz de la columna usando el émbolo suministrado con la columna de LS. </li><li> Sedimentar las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y resuspender en tampón de clasificación de 1 ml de células. Para aumentar la pureza, ejecute las células eluidas de nuevo a través de una columna LS fresco repitiendo los pasos 3.1.6 a 3.1.8, excepto desechar el flujo a través y recoger células retenidas como en 3.2.11. </li><li> Para purificar el CD8a Neg DCs de la suspensión PIE3S, sedimentar los PIE3S por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C y resuspender en 300 l de tampón de clasificación de células. </li><li> Añadir 100 l de mag anti-CD11cperlas néticas. Mezclar bien e incubar en hielo baño de agua durante 15 minutos. </li><li> Añadir ordenar celdas tampón y de pellets de 10 ml de células por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Repita los pasos 3.1.5 a través de 3.1.8. El CD8a Neg DCs se seleccionan positivamente con perlas de CD11c y se unió a la columna. El flujo a través se puede descartar. </li><li> La elución de las células retenidas en la columna como se describe en el paso 3.2.11 para recoger el purificada CD8a Neg DC. </li></ol></li></ol> 4. pulsante APC con antígenos y de transferencia de células <ol><li> Contar las células vivas después de la purificación mediante exclusión con azul de tripano 21 para distinguir las células vivas y muertas. </li><li> Se incuban las células con el antígeno de elección. Utilizar análogos de antígeno glicolípido ceramida llamada alfa-galactosil (αGalCer) a una concentración de 100 nM 13. Típicamente, la placa 10 6 células viables / pocillo en medio RPMI completo el uso de ultra bajo attachment de fondo en U de 96 pocillos para minimizar la unión celular. Se incuban las células en una atmósfera de CO2 al 5% a 37 ° C por 1 - 4 horas. </li><li> Las células de la cosecha con la pipeta suavemente varias veces. Utilice puntas de pipeta diámetro ancho para minimizar el daño celular de las fuerzas de corte. Lavar los pocillos con PBS y agrupar estos lavados para maximizar la obtención de células. </li><li> Sedimentar las células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C y resuspender a la densidad deseada en PBS. Por lo general, se inyecta 1 millón de células en 200 l por animal receptor. Mantener las células en hielo para maximizar la viabilidad antes de la administración en animales huésped. </li><li> Inyectar células vía intravenosa en ratones, ya sea a través del vano lateral de la cola o del plexo venoso retroorbital 19. Use una aguja 27 G en una jeringa de 1 ml, y se inyecta un volumen máximo de 0,1 ml por ratón. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

se aceptan las células dendríticas que es el principal antígeno profesional que presenta células que participan en el cebado de respuestas de células T. Su función principal es la de inspeccionar el microambiente del tejido mediante la adopción y el procesamiento de antígenos para la presentación a las células T. Con el fin de estudiar la función de subconjuntos específicos de DC, estos necesitan ser aislados en cantidades suficientes utilizando un enfoque que mantiene su fenotipo y las funciones normales. La mayoría de...

Las células dendríticas (DC) fueron descubiertos hace casi cuarenta años como el &quot;gran estrelladas (griego dendron) celular&quot; que se encuentra en los órganos linfoides 1. Muchos estudios han demostrado que los países en desarrollo son las únicas células que presentan antígenos que pueden estimular eficazmente las células T ingenuas 2. Una función importante de estas células es la captación y presentación de antígenos y su procesamiento eficaz y la carga de éstos a las moléculas presentadoras de antígeno. En bazo de ratón, las DC se puede separar en plasmocitoide y subconjuntos convencionales. Las DCs plasmacitoides se caracterizan por una baja expresión de CD11c y altos niveles de B220 y Gr-1. Ellos también son positivas para el marcador de superficie mPDCA1 y secretan interferón de tipo I en respuesta al número 9 como ligandos del receptor (TLR9). Las CD convencionales son demasiado altos para CD11c y MHC clase II expresión. Ellos se pueden dividir en tres subconjuntos distintos basados ​​en la expresión superficial de marcadores fenotípicos tales como CD4, CD8a, DEC205, CD11b y las células dendríticas del receptor inhibitorio 2 (DCIR2, reconocido por el anticuerpo 33D1) proteínas 3,4. Los CD8a Pos DC también se conocen como Cdc1, son positivas para DEC205, pero negativas para los marcadores mieloides tales como CD11b y 33D1. El CD8a Neg DC, también llamado cdc2, son positivos para 33D1, CD11b y CD4, pero carecen de DEC205. El subgrupo negativo doble (es decir, negativo para CD4 y CD8a) es relativamente poco frecuente, y es negativa para DEC205 y 33D1. Es el subconjunto menos caracterizado y puede ser una forma menos diferenciadas de CD8a Neg DC. Las diferencias fenotípicas en los diferentes subconjuntos de DC se extienden también a sus funciones in vivo. El CD8a Neg los DC son altamente fagocítica y se cree que presentar el antígeno exógeno principalmente a través de MHC de clase II de células T CD4 3. Por el contrario, los países en desarrollo Pos CD8a son especializados para la presentación de antígeno de proteína soluble en MHC de clase Ien un mecanismo denominado presentación cruzada. El resultado de la presentación cruzada depende del estado de activación de estas DCs 5, y puede o bien conducir a la expansión de las células T citotóxicas (CTL) o el desarrollo de células T reguladoras 6 2,7. Focalización del antígeno a CD8a Pos DC usando resultados de la entrega mediada por anti-DEC205-anticuerpo en gran medida en la eliminación de las células T 8, mientras que la presentación de antígenos derivados de células apoptóticas infectadas induce una fuerte respuesta CTL 9. Además del reconocimiento de antígenos peptídicos, el sistema inmune de los mamíferos ha evolucionado para reconocer los antígenos de lípidos y glicolípidos. Estos antígenos son presentados por moléculas CD1, que son proteínas de la superficie celular-I como de clase MHC que existen en múltiples formas relacionadas en diversos mamíferos. En ratones, un solo tipo de molécula de CD1 altamente conservada llamada CD1d es responsable de la presentación de antígenos glicolípidos 10. El mayor<html> población de células T que reconocen complejos CD1d / glicolípidos se llama células NKT invariantes (células iNKT). Estas células expresan un receptor de células T semi-invariante (TCR) compuesto por una cadena invariante TCRα que se empareja con cadenas TCR que han diversidad 11 limitados. A diferencia de las células T convencionales que necesitan para proliferar y diferenciarse para convertirse en células T efectoras activadas, existen células iNKT como una población efectora y comenzar a responder rápidamente después de la administración glicolípido 12. Identificación de células presentadoras de antígeno de lípidos fisiológicamente relevante es un área activa de investigación, y se han sugerido varios tipos de células diferenciadas, tales como las células B, los macrófagos y las CD para realizar esta función. Sin embargo, se demostró que el subconjunto CD8a Pos de las DC es la célula primaria que media la captación y presentación de antígenos a las células de lípidos iNKT ratón 13 y glicolípido mediada cebado cruzado de células T CD8 14. ove_content &quot;&gt; Para comparar la eficiencia de la presentación de antígenos por diferentes células presentadoras de antígenos, un enfoque directo es la transferencia de los diferentes tipos de APCs purificadas pulsadas con cantidades equivalentes de antígeno en huéspedes tratados previamente. experimentos de transferencia de células de este tipo se realiza a menudo para estudios inmunológicos. Sin embargo, la realización de estudios de transferencia con las DC tratadas ex antígeno in vivo es un reto, ya que estas células existen poblaciones tan raros en los órganos linfoides en las que constituyen menos del 2% del total de células 15. por tanto, es necesario mejorar el desarrollo de estas células en los animales donantes para aumentar la eficacia de los protocolos de aislamiento. Se sabe que la linfoide común y progenitores mieloides comunes, que son necesarios para la generación de pDC, CD8 Pos y subconjuntos CD8 Neg DC, expresa fms relacionadas receptor tirosina quinasa 3 (Flt-3). A in vivo Flt-3 ligando (Flt-3L) administración, emigration de Flt-3 que expresan las células progenitoras de la médula ósea se incrementa, lo que resulta en el aumento de la siembra de los órganos linfoides periféricos y la expansión de su progenie madura DC 16. La expresión de Flt-3 se pierde durante el compromiso con el B, T o NK vías de diferenciación celular. Por lo tanto, sólo alteraciones mínimas se observan en estas células tras la administración Flt-3L. Expansión similares en las poblaciones de DC se observa en ratones con tumores generados por la implantación de una línea celular B16-melanoma secretoras de murino Flt-3L, que proporciona un método sencillo y económico para proporcionar niveles sistémicos sostenidos de Flt-3L 17,18. Usando este enfoque, hemos desarrollado un protocolo basado en la implantación de células B16 melanoma secretoras de Flt-3L para estimular la expansión de todos los subconjuntos normales de corriente continua en el bazo del ratón, lo que aumenta en gran medida los rendimientos de estas células que se pueden aislar para experimentos posteriores . constantemente nos encontramos con que dentro de 10 - 14 días después de im subcutáneaplantación del tumor secretor de Flt-3, los ratones desarrollan esplenomegalia marcada con el enriquecimiento de las DC para constituir 40 - 60% del total de células de bazo. A partir de estos bazos, diferentes subconjuntos de DC se pueden aislar con alta pureza usando el estándar kits de purificación de células disponibles en el mercado que emplean marcadores fenotípicos-subconjunto específico.

<table><tbody><tr><td>0.05% Tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CDS019936-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa D&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I (polvo seco)</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>etanol de 200 pruebas&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9-6705-004-220</td><td>Se utiliza para preparar</td></tr> un <tr><td>tampón de lisis RBC</td> de etanol al 70% <td>Medio Sigma-Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 con L-glutamina&nbsp;</td><td>Life Technologies, medio Gibco</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>DMEM con L-glutamina&nbsp;</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-glutamina&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>aminoácidos no esenciales MEM&nbsp;</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminoácidos esenciales&nbsp;</td><td>Tecnologías de la Vida</td><td>11130-051&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio &nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS Ca2+ y Mg2+ pH libre 7.2)</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (DPBS con Ca2+ y Mg2+)</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>14040-182</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M Solución de etilendiaminatetraacetato (EDTA)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal para terneros</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11050&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina&nbsp;</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Azul de tripano (polvo seco)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146-5G&nbsp;</td><td>Prepare 0.08% con PBS</td></tr><tr><td>Kit de aislamiento de células dendríticas plasmocitoide II, ratón</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-092-786</td><td></td></tr><tr><td>Perlas magnéticas conjugadas con anti-ratón CD11c&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-152-001</td><td></td></tr><tr><td>CD8 y alfa; Pos ratón Kit de aislamiento de CC&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-169</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo bloqueante del receptor Fc-gamma (Clon 2.4G2)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratón CD11c-FITC&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553801</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratón CD8&alpha;-PerCP&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553036</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratón B220-PE&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553090</td><td></td></tr><tr><td>jeringas de 1 ml&nbsp;</td><td>BD</td><td>26048</td><td></td></tr><tr><td>23 Aguja G1&nbsp;</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri de 100 mm&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific 875712</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos quirúrgicos&nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>INSMOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células (70 &micro; m)</td> <td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri grandes&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de filtración al vacío (500 ml (0,22 y micro; m))</td><td>Columnas Corning</td><td>431097</td><td></td></tr><tr><td>LS&nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Soporte magnético Separador MACS&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Diámetro ancho 200 &mu; l puntas de pipeta&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>111623</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 pocillos de fijación ultrabaja Corning&nbsp;</td><td>Ratones Corning</td><td>CLS3474-24EA hembra</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 de 6-8 semanas de edad&nbsp;</td><td>Jackson Research Laboratories, Jax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murine B16.Flt3L línea</td><td></td><td></td> celular de melanoma <td>descrita por Mach et al., 2000</td></tr><tr><td>Serum libre de DMEM y RPMI media 500 ml DMEM con L-glutamina, o 500 ml RPMI-1640 con L-glutamina 5 ml MEM aminoácidos no esenciales (100x, 10&nbsp; mM) 5 ml Tampón HEPES (1 M) 5 ml L-glutamina (200&nbsp; mM) 0,5 ml de 2-mercaptoetanol (5,5 x 10-2 M)</td><td></td><td></td><td>Mezcle todos los ingredientes en una cabina de bioseguridad con medios DMEM o RPMI, según sus necesidades. Filtro esterilizar los medios pasando a través de un 0.22 &micro; m Sistema de filtración al vacío.</td></tr><tr><td><fuerte>Medios RPMI y DMEM completos</fuerte></td><td></td><td></td><td>Agregue 50 ml de suero de ternera fetal inactivado por calor a los medios RPMI o DMEM sin suero para obtener medios completos.</td></tr><tr><td><tampón fuerte>MACS</fuerte></td><td></td><td></td><td>Añadir 2 ml de EDTA 0,5 M y 10 ml de suero fetal de ternero inactivado por calor a 500 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS, Ca2+ y Mg2+ Free, pH 7,2) y 2&nbsp; y micro; g/ml 2.4G2 (anticuerpo Fc-Block).</td></tr><tr><td><tampón de tinción fuerte>FACS</fuerte></td><td></td><td></td><td>Disuelva azida sódica al 0,05% (0,25 g por 500 ml) en tampón MACS para obtener tampón de tinción FACS</td></tr><tr><td><fuerte>10x Colagenasa D y solución madre de DNasa 1 
Disolver 1 g de colagenasa D y 0,2 ml de caldo de DNasa 1 (1 mg/ml, 100x) en 20 ml de PBS que contengan Ca2+ y Mg2+ para obtener una solución de aproximadamente 1.000-2.000 unidades de actividad colagenasa por ml.</td><td></td><td></td><td>Esta solución de stock 10x se puede preparar con anticipación y almacenar a -20 &deg; C durante varias semanas. Diluir 1 ml de este con 9 ml de RPMI sin suero inmediatamente antes de usar.</td></tr></tbody></table>

un método de rendimiento eficiente y de alta para el aislamiento de ratón subconjuntos de células dendríticas

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Las células dendríticas (DC) son las células presentadoras de antígeno profesionales principalmente responsable de la adquisición, procesamiento y presentación de antígenos en moléculas presentadoras de antígenos para iniciar la inmunidad mediada por células T. Las células dendríticas se pueden separar en varios subconjuntos fenotípicamente y funcionalmente heterogéneos. Tres importantes subconjuntos de células dendríticas esplénicas son plasmocitoide, células CD8a POS y CD8a Neg. Las DCs plasmacitoides son productores naturales de interferón de tipo I y son importantes para la inmunidad de células T anti-viral. El subconjunto CD8a Neg DC está especializada para MHC de clase II presentación de antígenos y está implicado en el centro de cebado de células T CD4. El CD8a Pos países en desarrollo son los principales responsables de la presentación cruzada de antígenos exógenos y sensibilización de las células T CD8. Los CD8a Pos DC han demostrado ser más eficaz en la presentación de antígenos glicolípidos por moléculas CD1d a un cel T especializadal población conocidas como células T asesinas naturales invariantes (iNKT). La administración de Flt-3 ligando aumenta la frecuencia de la migración de progenitores de células dendríticas de la médula ósea, lo que se traduce en la expansión de las células dendríticas en los órganos linfoides periféricos en modelos murinos. Hemos adaptado este modelo para purificar grandes cantidades de células dendríticas funcionales para su uso en experimentos de transferencia de células para comparar dominio in vivo de diferentes subconjuntos de DC.

El resultado de este procedimiento se basa en la expansión de los subgrupos de CD por murino Flt-3L expresado por las células de melanoma implantados. El tumor B16.Flt3L se derivó de un 6 mouse / C57BL, y debe ser implantado en animales con que cepa de antecedentes con el fin de evitar el fallo del tumor a establecerse debido al rechazo. En algunos casos, puede ser deseable usar ratones modificados genéticamente para derivar DCs con defectos conocidos en vías o receptores de interés de s...

Existen distintos subconjuntos de células dendríticas como poblaciones raras en los órganos linfoides y, por lo tanto, son difíciles de aislar en número y pureza suficientes para los experimentos inmunológicos. Aquí describimos un método de alta eficiencia y alto rendimiento para el aislamiento de todos los principales subconjuntos actualmente conocidos de células dendríticas esplénicas de ratón.

Un método de rendimiento eficiente y de alta para el aislamiento de ratón subconjuntos de células dendríticas

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

El objetivo general de este protocolo es desarrollar un método de alta eficiencia y alto rendimiento para generar células dendríticas o DC, que reflejen fatídicamente su divergencia fenotípica y funcional in vivo. Las células dendríticas existen como grandes poblaciones en los órganos linfoides. Por lo tanto, utilizamos ligando filtro para aumentar la frecuencia de estas células esenciales en los tejidos del donante para facilitar ese aislamiento.La principal ventaja de esta técnica es que elimina la generación de todos los subconjuntos de DC en números adecuados para el análisis utilizando solo los agentes disponibles comercialmente. Para recolectar el ligando flt-3 que expresa células de melanoma B16 de un cultivo confluente al 90%, primero lave las células con PBS e incube el cultivo con 05% de tripsina a 37 grados Celsius. Después de 5 minutos, apague la actividad de la proteasa con 20 mililitros de medio dima completo de 4 grados centígrados y separe la capa del modelo celular adherente con un ligero golpeteo y un pipeteo suave.Recoja las células por centrifugación y cuéntelas. A continuación, vuelva a suspender la suspensión unicelular a una concentración de 1 veces a 8 células por mililitro en PBS para su inyección subcutánea en ratones receptores C57 black 6. Cuando el tumor alcance de dos a diez mililitros de diámetro, recoja los bazos de los animales portadores de tumores y colóquelos en una placa de Petri que contenga medio RPMI fresco.Con un bisturí, corte los tejidos en trozos de 0,2 centímetros cuadrados y luego incube los fragmentos en diez mililitros de colagenasa y Dnasa a 37 grados centígrados. Después de 30 minutos, vierta la suspensión de tejido parcialmente digerida en un colador de células de 70 micras y use un émbolo de jeringa de cinco mililitros para presionar los fragmentos de tejido restantes a través de la malla del colador. Enjuague el filtro con 10 mililitros de medio fresco, agrupando el lavado con el resto de la suspensión unicelular y pelice las celdas.Suspendemos el pellet de células en 2 mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, lave las células en 10 mililitros de medio RPMI fresco y vuelva a suspenderlas a 1 veces 10 hasta las 8 células por mililitro en el tampón de clasificación de células que contiene el bloque FC. Para aislar las CD del cítodo plasmático, mezcle bien 300 microlitros de cóctel de anticuerpos marcados con biotina de un kit de aislamiento de CC del cítodo plasmático con 200 microlitros de la suspensión unicelular esplénica.Coloque las células en un baño de agua helada durante 15 minutos, con golpecitos suaves cada tres minutos. A continuación, lave las celdas con 12 mililitros de tampón de clasificación de células y vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón de clasificación fresco. A continuación, incube las células en 300 microlitros de perlas conjugadas con anti-biotina y anticuerpos durante otros 15 minutos en el agua helada con golpecitos regulares.Después de lavar las celdas en tampón de clasificación nuevo, vuelva a suspender el palet en 2 mililitros de tampón de clasificación de celdas y cargue una columna magnética de tamaño adecuado en su imán correspondiente. Equilibre la columna con cinco mililitros de tampón de clasificación de celdas fresco de 4 grados Celsius. Cuando todo el tampón se haya drenado de la parte superior de la columna, agregue con cuidado las celdas al centro de la superficie de la cabeza de la columna y recoja el flujo.A continuación, lave la columna con 10 mililitros de tampón de clasificación fresco a 4 grados centígrados y recoja el flujo en el mismo tubo. Después de pasar a través de una segunda columna magnética, se puede esperar una población de células dendríticas de cítodos de plasma con una pureza superior al 94%. Para aislar las CD8aplha+y CD8alpha-DCs, mezcle el resto de la suspensión de células esplénicas con 100 microlitros de cóctel de anticuerpos conjugados de bioción de un kit de aislamiento de células CD8alpha+dendríticas durante 15 minutos en hielo con un suave golpeteo, como se acaba de demostrar.Al final de la incubación, lave las células en 12 mililitros de tampón de clasificación de células de 4 grados Celsius y vuelva a suspender el pellet en 150 microlitros de tampón de clasificación de células fresco de 4 grados Celsius. A continuación, mezcle las células con 100 microlitros del kit de aislamiento de células dendríticas CD8alpha + perlas anti-biotina. Después de 15 minutos en hielo con golpecitos suaves, lave las celdas en 10 mililitros de tampón de clasificación de celdas de 4 grados Celsius y vuelva a suspender el pellet en 1 mililitro de tampón de clasificación fresco de 4 grados Celsius.Al final de la incubación, clasifique las células por separación magnética de perlas, como se acaba de demostrar, recogiendo el flujo y el primer lavado. Luego, gire las celdas y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón de clasificación de celdas fresco de 4 grados Celsius. Ahora etiquete las células con 200 microlitros de perlas magnéticas conjugadas anti-CD8aplha del kit y pase las células a través de una nueva columna, recogiendo el flujo de células CD8alfa-dendríticas.Para recolectar los CD8alpha + DC, transfiera la columna a un tubo cónico de 15 mililitros y sumerja 5 mililitros de tampón de clasificación de células frescas de 4 grados Celsius a través de la columna. Después de pasar las células por una segunda columna, se puede esperar una población de células dendríticas CD8alfa + superior al 96%. Para aislar las células CD8alfa, haga girar la suspensión de células de flujo CD8alfa.A continuación, etiquete las células con 100 microlitros de perlas c-magnéticas anti-CD11 y recoja la población de células positivas para perlas magnéticas, como se acaba de demostrar, para obtener una población de subconjuntos de células CD8alfa-dendríticas superior al 97%. Por último, determine el número de células vivas, por exclusión de azul de tripano. Una vez que el tumor se vuelve palpable, los ratones portadores de tumores con ligando B16 flt-3 exhiben consistentemente un aumento dramático en la celularidad esplénica que se correlaciona con la expansión de los subconjuntos de células dendríticas esplénicas.Curiosamente, mientras que se observa un aumento de 15 a 20 veces en el número absoluto de células para las CD convencionales en estos animales, solo se observa un aumento de 4 veces para el subconjunto de DC del cítodo plasmático. Los diferentes subconjuntos de células dendríticas se caracterizan según su expresión de B220, CD11b, CD11c y CD8alpha. Sin embargo, las poblaciones celulares también exhiben otros marcadores de subconjuntos únicos, con mPDCA1 expresado exclusivamente en los CD del cítodo plasmático DEC205 altamente expresado en los CD8alpa + DC, y CD11b y 33D1 detectados de manera más prominente en los CD8alpha-DC.Utilizando este método, hemos demostrado que CD8alpa+DC es el más eficiente en la presentación de antígenos por moléculas de unión CD a una población especializada de células T conocidas como células NKT invariantes. La característica más crítica del aislamiento de DC es mantener una esterilidad estricta y condiciones libres de antidoxantes. Durante los procedimientos, estas células T responden muy bien a los antidoxantes.Al intentar este procedimiento, es importante recordar manipular las células con cuidado, ya que la estimulación mecánica repetida puede alterar el estado de maduración de las células dendríticas. Una vez dominada, esta técnica se puede utilizar para aislar un gran número de todos los principales subconjuntos de DC de un solo bazo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Aislamiento de linfocitos utilizando el kit de Miltenyi MAC es una manera confiable para purificar las células de todo homogeneizados de tejido linfoide. Células purificadas utilizando el sistema de Miltenyi suelen ser ≥ 96% de pureza. Este sentido, demuestran las medidas adoptadas para aislar las células CD4 + T, uno de los kits que se ofrecen por Miltenyi.

Aislamiento de células T CD4 + de los ganglios linfáticos del ratón utilizando Miltenyi Purificación MACS

Una preparación altamente purificada de células dendríticas del pulmón del ratón se describe. Especial énfasis se da al aislamiento de subgrupo de células dendríticas convencionales.

Aislamiento de células dendríticas del pulmón de ratón

Aquí, le detallamos una metodología para el aislamiento rápido de las células dendríticas de ratones intestinales (DCS) y los macrófagos. Caracterización fenotípica de los países en desarrollo y los macrófagos intestinales se realiza utilizando varios colores, mientras que el flujo de análisis de citometría de enriquecimiento de bolas magnéticas seguido por la selección de células se utiliza para producir poblaciones de alta pureza para los estudios funcionales.

Aislamiento y caracterización de las células dendríticas y los macrófagos del intestino delgado de ratón

Este video muestra un procedimiento para la transferencia adoptiva de células dendríticas presentadoras de antígenos (CD) tratadas con alto contenido de sal a ratones. Las células dendríticas (CD) murinas CD11c+ se exponen a un medio que contiene altas cantidades de sodio, formando aductos de proteína isolevuglandina (IsoLG) en las células. Estos aductos sirven como neoantígenos y se presentan en la superficie de las CD. Las células tratadas con alto contenido de sal se inyectan en ratones a...

Un método para el tratamiento con alto contenido de sal de células dendríticas y su transferencia adoptiva a ratones

Este protocolo detalla un método para aislar células presentadoras de antígeno de timo humano a través de diferentes etapas de la digestión enzimática del tejido seguido por centrifugación de densidad de la suspensión de células individuales y la clasificación finalmente magnético y / o FACS de las poblaciones de células de interés.

Aislamiento de células dendríticas mieloides y células epiteliales de timo humano

Se presenta un protocolo para el aislamiento de primaria microglia del cerebro murino. Esta técnica ayuda a promover la comprensión actual de condiciones neurológicas. Centrifugación de gradiente de densidad y separación magnética se combinan para producir suficiente rendimiento de una muestra muy pura. Además, describiremos los pasos para la caracterización de la microglia.

Caracterización y aislamiento de Microglia primarios de ratón por centrifugación de gradiente de densidad

Aquí describimos un método para aislar y purificar las células dendríticas de diferentes compartimentos anatómicos en el tracto reproductor femenino humano para la evaluación de sus características fenotípicas y funcionales. Este método puede adaptarse para aislar a otras células inmunes o las células dendríticas de otros tejidos de la mucosa.

Aislamiento de las células dendríticas del tracto reproductivo femenino humano estudios fenotípica y funcional

Derivados de monocitos DC (MoDC) puede detectar pequeñas cantidades de moléculas asociadas de peligro y por lo tanto son fácilmente preparada. Proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento de MoDC de sangre y los tumores y su activación con complejos inmunes mientras destacando medidas claves que deben considerarse para evitar su activación prematura.

Protocolo de aislamiento de células dendríticas derivadas de monocitos de ratón y su activación posterior In Vitro con complejos inmunes Tumor

Aquí, presentamos un protocolo para desarrollar y caracterizar células dendríticas tolerogénicas (TolDCs) y evaluar su utilidad de la inmunoterapia.

Desarrollo y caracterización funcional de células dendríticas tolerogénicas murino

Aquí, presentamos un protocolo para aislar las células dendríticas de bazos murinos por clasificación magnética celular y posterior transferencia adoptiva en ratones ingenuos. El modelo de células dendríticas activadas de sal fue elegido para explicar los procedimientos paso a paso de transferencia adoptiva y citometría de flujo.

Aislamiento y la transferencia adoptiva de sal alta tratan células dendríticas presentadoras de antígenos

Aquí, presentamos un método económico y eficiente para aislar y generar células dendríticas derivadas de la médula ósea de alta pureza a partir de ratones después de 7 días de cultivo con 10 ng / ml GM-CSF / IL-4.

Protocolo económico y eficiente para aislar y cultivar células dendríticas derivadas de la médula ósea de ratones

Aprenda un método de alto rendimiento para aislar subconjuntos de células dendríticas de bazo murino usando Flt-3 ligand. Esta técnica permite obtener poblaciones puras para estudios inmunológicos avanzados.

Un método de rendimiento eficiente y de alta para el aislamiento de ratón subconjuntos de células dendríticas

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