Visualizzazione quantitativa di leucociti infiltrati in un modello di murina della miocardite fulminante mediante microscopia a foglio chiaro

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di eliminare chimicamente il cuore di un topo, con un'aritmia cardiaca indotta per una visualizzazione dell'intero organo dell'infiltrato cardiaco leucocitario mediante microscopia a foglio di luce a fluorescenza. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sull'intero organo su protesi e strutture a livello di risoluzione cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente sia la quantificazione che la localizzazione dell'infiammazione in interi organi.

Fornire interni dettagliati nella protesi neurologica. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando avevamo urgente bisogno di uno strumento di visualizzazione per identificare le spiegazioni cellulari per l'aritmia cardiaca nel modulo di deplezione. Dopo l'esposizione del cuore da un topo di 8-10 settimane, utilizzare un catetere calibro 21 e penetrare nel ventricolo destro.

Incidere l'aorta per consentire il drenaggio del sangue e poi perfondere con cinque millilitri di PBS più EDTA, con una pressione lenta e costante. Seguire il PBS EDTA con cinque millilitri di paraformaldeide al 4%. Alla fine della perfusione, utilizzare una pinza seghettata per afferrare delicatamente il cuore fisso e tirare leggermente l'organo verso l'alto per tagliare tutte le connessioni tissutali.

Comprese le arterie e le vene in entrata e in uscita. Quindi, conservare il cuore per quattro ore in PFA fresco al 4% per un'ulteriore fissazione. Per disidratare il tessuto, incubare il cuore in una serie ascendente di etanolo, in provette di reazione in polipropilene nero da cinque millilitri al buio, con una rotazione lenta costante su un rotatore di tubi, per prevenire la formazione di bolle d'aria.

Quindi, pulire il tessuto con un'incubazione di etere dibenzilico al 98% con rotazione costante durante la notte. Per eseguire la microscopia a fluorescenza a foglio luminoso, posizionare prima i blocchi di agarosio disidratati nel supporto del campione standard, per tenere il campione in posizione. Quindi, trasferire il campione sul supporto del campione.

Quindi, trasferire il portacampione in una cuvetta riempita di etere dibenzilico di dimensioni adeguate. Utilizzare le impostazioni appropriate del filtro di eccitazione ed emissione per rilevare i segnali di fluorescenza di interesse. Pertanto, il corretto posizionamento e fissazione del campione è fondamentale per ridurre al minimo gli effetti di ombreggiatura durante l'imaging.

Inoltre, un campione allentato può causare artefatti in movimento, che sono difficili da illuminare durante la post-elaborazione. Dopo aver richiesto tutte le immagini, aprire il software di analisi dell'elaborazione delle immagini 3D e 4D appropriato e selezionare Supera. Scegliere file e apri, quindi selezionare la cartella contenente i dati del primo canale acquisito per aprire le pile di immagini.

Selezionare Modifica e aggiungi canali per aggiungere i dati del canale fluorescente acquisiti appropriati. Quindi, fai clic su modifica e seleziona le proprietà dell'immagine per correggere le dimensioni del voxel x, y e z. Regolazione dei parametri nella finestra appena aperta.

Per regolare i segnali fluorescenti, aprire prima il menu di modifica e selezionare Mostra regolazione display. Una nuova finestra mostra tutti i canali aperti. Per modificare il canale di autofluorescenza in scala di grigi, selezionare il canale di autofluorescenza, scegliere lo stile di visualizzazione bianco e fare clic su OK.

Quindi, regolare la visualizzazione rimuovendo la griglia. Quindi, ingrandisci e deseleziona un canale. Quindi, regolare il valore del livello di nero per escludere eventuali segnali di fondo indesiderati che non rappresentano le strutture del campione, l'intensità del segnale e il contrasto.

Regolare il canale in piedi dell'anticorpo in relazione al segnale del canale di autofluorescenza rivisto. Impostando la modalità canale, attiva per impostare la visualizzazione del segnale anticorpale su una tabella di ricerca dei colori della mappa di calore. Quindi, selezionare la modalità di fusione, per visualizzare le strutture dei tessuti in dettaglio.

Per aprire virtualmente l'organo, prima dell'esportazione della scena 3D, selezionare l'icona del piano di ritaglio nell'elenco degli oggetti. Nella vista immagine appariranno una cornice gialla e un manipolatore a mandrino bianco. Utilizzare il mouse per ruotare il mandrino all'estremità più sottile, per modificare l'orientamento del piano di ritaglio e spostare la parte centrale più spessa del mandrino per selezionare la profondità di ritaglio desiderata.

Quindi, deseleziona le rispettive caselle di controllo per nascondere il fotogramma e il manipolatore e creare le istantanee desiderate. L'acquisizione di un intero stack di immagini, composto da due segnali di canale fluorescenti, suscita un rendering 3D artificiale, in cui la distribuzione dei leucociti viene visualizzata in una vista mappa di calore. Le aree fortemente infiammate dei cuori di un animale trattato con tossina difterica possono essere percepite dal loro aspetto rossastro e biancastro.

In particolare nelle regioni del sistema di conduzione cardiaca, come il fascio ventricolare atriale e le fibre di Purkinje. Al contrario, i cuori degli animali trattati con PBS controllato non dimostrano questo modello di infiammazione. Una volta padroneggiata, questa tecnica consente l'analisi digitale di un organo bersaglio, dal suo prelievo alla sua rendificazione assistita da computer in quattro o cinque giorni.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'emmenologia, per esplorare i modelli di distribuzione cellulare in interi organi di topo. Questo può invecchiare nell'analisi e nel trattamento di una varietà di protesi di malattie fisiopatologiche. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare interi organi di topo per la microscopia a fluorescenza e di come generare ed elaborare stack di dati 3D.