Name: שיטות חדשות לחקר קידוד גוסטוריאלי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: חקור שיטות חדשות לרישום נוירונים גוסטוריים בחי Manduca sexta באמצעות טטרודות חוץ-תאיות ומערכת למסירת גירויים טעמיים מדויקת. השיטה מאפשרת הבנה עמוקה של קידוד מידע טעם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק פנימי בין NIH-NICHD ל- MS אנו מודים G. Dold ו T. טלבוט של NIH-NIMH מכשור מתקן הליבה לעזרה עם עיצוב מערכת משלוח טסטנט.

<ol><li>Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptors+and+cells+for+mammalian+taste%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The receptors and cells for mammalian taste.</a> Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).</li>
<li>Chen, X., Gabitto, M., Peng, Y., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Gustotopic+Map+of+Taste+Qualities+in+the+Mammalian+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Gustotopic Map of Taste Qualities in the Mammalian Brain.</a> Science. 333 (6047), (2011).</li>
<li>Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+Sense+about+Taste%3A+From+Mammals+to+Insects%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Common Sense about Taste: From Mammals to Insects.</a> Cell. 139 (2), 234-244 (2009).</li>
<li>Mueller, K. L., Hoon, M. A., Erlenbach, I., Chandrashekar, J., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptors+and+coding+logic+for+bitter+taste%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The receptors and coding logic for bitter taste.</a> Nature. 434 (7030), 225-229 (2005).</li>
<li>Zhao, G. Q., Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptors+for+mammalian+sweet+and+umami+taste%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The receptors for mammalian sweet and umami taste.</a> Cell. 115 (3), 255-266 (2003).</li>
<li>Huang, A. L., Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cells+and+logic+for+mammalian+sour+taste+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The cells and logic for mammalian sour taste detection.</a> Nature. 442 (7105), 934-938 (2006).</li>
<li>Pfaffmann, C., Carl, <a target="_blank" href="http://psycnet.apa.org/journals/amp/14/5/226/">The afferent code for sensory quality.</a> Am Psychol. 14 (5), 226-232 (1959).</li>
<li>Lemon, C. H., Katz, D. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1995451/">The neural processing of taste.</a> BMC Neurosci. 8 (Suppl 3), (2007).</li>
<li>Barretto, R. P. J., Gillis-Smith, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).</li>
<li>Reiter, S., Campillo Rodriguez, C., Sun, K., Stopfer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+Coding+of+Individual+Chemicals+by+the+Gustatory+System%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal Coding of Individual Chemicals by the Gustatory System.</a> J Neurosci. 35 (35), 12309-12321 (2015).</li>
<li>Wilson, D. M., Boughter, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bitter+Taste+Stimuli+Induce+Differential+Neural+Codes+in+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Bitter Taste Stimuli Induce Differential Neural Codes in Mouse Brain.</a> PLoS ONE. 7 (7), e41597(2012).</li>
<li>Glendinning, J. I., Davis, A., Ramaswamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+different+taste+cells+and+signaling+pathways+to+the+discrimination+of+%22bitter%22+taste+stimuli+by+an+insect%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Contribution of different taste cells and signaling pathways to the discrimination of "bitter" taste stimuli by an insect.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (16), 7281-7287 (2002).</li>
<li>Kay, L. M., Stopfer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+processing+in+the+olfactory+systems+of+insects+and+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Information processing in the olfactory systems of insects and vertebrates.</a> Semin Cell Dev Biol. 17 (4), 433-442 (2006).</li>
<li>Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/neuron/abstract/S0896-6273(14)00153-6">Peripheral Coding of Taste.</a> Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).</li>
<li>Carleton, A., Accolla, R., Simon, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+in+the+Mammalian+Gustatory+System%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coding in the Mammalian Gustatory System.</a> Trends Neurosci. 33 (7), 326-334 (2010).</li>
<li>Stocker, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organization+of+the+chemosensory+system+in+Drosophila+melanogaster%3A+a+rewiew%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a rewiew.</a> Cell Tissue Res. 275 (1), 3-26 (1994).</li>
<li>Mitchell, B. K., Itagaki, H., Rivet, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+and+central+structures+involved+in+insect+gustation%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Peripheral and central structures involved in insect gustation.</a> Microsc Res Tech. 47 (6), 401-415 (1999).</li>
<li>Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jmor.1051500206/abstract">Labellar taste organs of Drosophila melanogaster.</a> J Morphol. 150 (2), 327-341 (1976).</li>
<li>Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+a+primary+chemoreceptor+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Physiology of a primary chemoreceptor unit.</a> Science. 122 (3166), 417-418 (1955).</li>
<li>Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recording+from+Drosophila+labellar+taste+sensilla%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla.</a> J Vis Exp. (84), e51355(2014).</li>
<li>Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+bitter+taste+in+Drosophila%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila).</a> Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).</li>
<li>Descoins, C., Marion-Poll, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+responses+of+gustatory+sensilla+of+Mamestra+brassicae+%28Lepidoptera%2C+Noctuidae%29+larvae+to+three+ecdysteroids%3A+ecdysone%2C+20-hydroxyecdysone+and+ponasterone%5BTitle%5D)+AND+%22A.+J+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological responses of gustatory sensilla of Mamestra brassicae (Lepidoptera, Noctuidae) larvae to three ecdysteroids: ecdysone, 20-hydroxyecdysone and ponasterone.</a> A. J Insect Physiol. 45 (10), 871-876 (1999).</li>
<li>Popescu, A., Couton, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+and+central+projections+of+gustatory+receptor+neurons+on+the+antenna+of+the+noctuid+moth+Spodoptera+littoralis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Function and central projections of gustatory receptor neurons on the antenna of the noctuid moth Spodoptera littoralis.</a> J Comp Physiol. 199 (5), 403-416 (2013).</li>
<li>Morita, H., Yamashita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generator+potential+of+insect+chemoreceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generator potential of insect chemoreceptor.</a> Science. 130 (3380), 922(1959).</li>
<li>Davis, N. T., Hildebrand, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroanatomy+of+the+sucking+pump+of+the+moth%2C+Manduca+sexta+%28Sphingidae%2C+Lepidoptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arthropod+Struct+Dev%22%5BJournal%5D)">Neuroanatomy of the sucking pump of the moth, Manduca sexta (Sphingidae, Lepidoptera).</a> Arthropod Struct Dev. 35 (1), 15-33 (2006).</li>
<li>Stürckow, B., Adams, J. R., Wilcox, T. A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00298032">The Neurons in the Labellar Nerve of the Blow Fly.</a> Z Vergl Physiol. 54, 268-289 (1967).</li>
<li>Stürckow, B. Electrophysiological studies of a single taste hair of the fly during stimulation by a flowing system. Proceed 16 Intern Contr Zool. 3 (8), 102-104 (1963).</li>
<li>Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male-specific%2C+sex+pheromone-selective+projection+neurons+in+the+antennal+lobes+of+the+moth+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Male-specific, sex pheromone-selective projection neurons in the antennal lobes of the moth Manduca sexta.</a> J Comp Physiol A. 160, 553-569 (1987).</li>
<li>Reiter, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aReiter%2C+S+%22Gustatory+Information+Processing%22">Gustatory Information Processing</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://repository.library.brown.edu/studio/item/bdr:386235/PDF/?embed=true">https://repository.library.brown.edu/studio/item/bdr:386235/PDF/?embed=true</a> (2014).</li>
<li>Saha, D., Leong, K., Katta, N., Raman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-unit+Recording+Methods+to+Characterize+Neural+Activity+in+the+Locust+%28Schistocerca+Americana%29+Olfactory+Circuits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits.</a> J Vis Exp. (71), (2013).</li>
<li>Pouzat, C., Mazor, O., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+noise+signature+to+optimize+spike-sorting+and+to+assess+neuronal+classification+quality%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Using noise signature to optimize spike-sorting and to assess neuronal classification quality.</a> J Neurosci Methods. 122 (1), 43-57 (2002).</li>
<li>Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+Metrics+to+Accompany+Spike+Sorting+of+Extracellular+Signals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Quality Metrics to Accompany Spike Sorting of Extracellular Signals.</a> J Neurosci. 31 (24), 8699-8705 (2011).</li>
<li>Fee, M. S., Mitra, P. P., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+sorting+of+multiple+unit+neuronal+signals+in+the+presence+of+anisotropic+and+non-Gaussian+variability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Automatic sorting of multiple unit neuronal signals in the presence of anisotropic and non-Gaussian variability.</a> J Neurosci Methods. 69 (2), 175-188 (1996).</li>
<li>Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mushroom+body+memoir%3A+from+maps+to+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mushroom body memoir: from maps to models.</a> Nat Rev Neurosci. 4 (4), 266-275 (2003).</li>
<li>Naraghi, M., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-induced+oscillations+in+the+mushroom+bodies+of+the+locust%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant-induced oscillations in the mushroom bodies of the locust.</a> J Neurosci. 14, 2993-3004 (1994).</li>
<li>Laurent, G., Wehr, M., Davidowitz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+representations+of+odors+in+an+olfactory+network%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Temporal representations of odors in an olfactory network.</a> J Neurosci. 16, 3837-3847 (1996).</li>
<li>Perez-Orive, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillations+and+sparsening+of+odor+representations+in+the+mushroom+body%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oscillations and sparsening of odor representations in the mushroom body.</a> Science. 297, 359-365 (2002).</li>
<li>Stopfer, M., Jayaraman, V., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/neuron/fulltext/S0896-6273(03)00535-X">Odor identity vs. intensity coding in an olfactory system.</a> Neuron. 39, 991-1004 (2003).</li>
<li>Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+network+dynamics+and+the+coding+of+multidimensional+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Re+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Olfactory network dynamics and the coding of multidimensional signals.</a> Nature Re Neurosci. 3, 884-895 (2002).</li>
</ol>

למחברים אין מה לגלות.

השיטות המתוארות כאן מתירות בהקלטות vivo מחיה פשוטה יחסית, Manduca sexta , כדי לאפיין את פעילותם של מספר רב של GRNs שנבחרו באקראי על פני משכים ארוכים (במשך יותר מ -2 שעות), לפני, במהלך ואחרי משלוח טסטנט. שיטות אלה מאפשרות גם את המסירה המהירה והרצופה של מספר רב של גירויי טסטנט עם שליטה טמפורלית מדויקת, יתרונות שימושיים ללימוד מנגנונים עצביים המונחים ביסוד טסטנט. פרוטוקול זה שימש כדי ללמוד כיצד התגובות של GRNs כדי tastants הם שינו כאשר הם מועברים נוירונים היעד postsynaptic שלהם ( למשל, ב SEZ) על ידי ניטור GRNs בו זמנית עם interneurons מחובר monosynaptically 10 . בנוסף, שיטות אלה ניתן להתאים את הצרכים של הנסיין, המאפשר ביצוע של פרדיגמות מורכבות ללמוד היבטים בסיסיים של קידוד גס. כאשר מתחיליםG המחקר שלנו, בעיה טכנית אחת היינו לפעמים כדי לפתור את חוסר היכולת לזהות אותות spiking מן העצב Maxillary עם חוטי tetrode. סיבות אפשריות לכך הן מגוונות, כמו פרוטוקול לנתיחה הוא מאתגר, וכמה תרגול הוא הכרחי כדי להשיג הכנה טובה. ראשית, במהלך לנתיחה עש את העצבים מקסימיליים קל נזק, במיוחד במהלך הסרת נדן סביב הרקמה העצבית. שנית, אם הנדן אינו מוסר באופן מלא, חוטי tetrode לא יוכלו לגשת לעצב. בשני המקרים, החל הכנה חדשה היא לעתים קרובות הדרך הקלה ביותר לפתור בעיות אלה. שלישית, ייתכן שיש בעיה עם חוטי tetrode. זה יכול להיבדק על ידי מדידת עכבה של חוטים אשר צריך להיות ~ 270 kΩ ב 1kHz. אם הערך עכבה מעל ~ 300 kΩ, electroplate החוטים עם זהב כדי להשיג את העכבה הרצויה (ראה התייחסות 30 ). רביעית, חתיכת ציוד עשוי להיות מקושריםאו התנהגות לא הולמת. בעיה נוספת אפשרית היא כי אותות spiking נרשמות אבל הנוירונים (ים) מופיעים להגיב על הטעמים. זה יכול להיות בגלל הנוירונים שהוקלטו הם רגישים למערכת של טעימות נמסר. כמו כן, חשוב לזכור כי בנוסף אקסונים של GRNs, העצב maxillary גם נושאת סיבים מכאנסנסורי. לכן, ניתן להקליט נוירונים mechanosensory במקום, או בנוסף, GRNs. עם זאת, מערכת משלוח טסטנט נועד לספק קלט מכני קבוע לאורך הניסוי מה שעושה את זה סביר כי התגובות טסטנט יהיה מבולבל על ידי תגובות הרכיב המכני של המסירה שלה. נוירונים המגיבים על כמה טעימות אחרות אבל לא, או בדרכים שונות טעימות שונות, ניתן לסווג באופן חד משמעי כמו GRNs. אנו ממליצים להשתמש בטעמים מדולל טרי כדי למנוע וריאציות ריכוז טסטנט או הרכב בשל השפלה או התייבשות מתחםשל הממס. אנו ממליצים גם לנקות את המערכת באופן קבוע כדי למנוע זיהום צינורות ו / או חסימות. בעיה טכנית אפשרית נוספת היא יחס אות לרעש חלש. בעיה זו יכולה לעתים קרובות להיפתר על ידי rechloriding או התאמת המיקום של האלקטרודה הקרקע אמבטיה. פתרונות אחרים עשויים לדרוש מיגון ומזעור אורך של כל חיבור חשמלי במנגנון. לבסוף, חשוב לציין כי ניתוח נכון של נתונים שהושגו באמצעות הקלטות tetrode דורש מיון ספייק זהיר. מצאנו כי שיטות אוטומטיות לחלוטין הם בדרך כלל לקוי. אנו ממליצים להכיר את הספייק מיון מיון לפני ניתוח tetrode נתונים 10 , 29 , 31 , 32 , 33 . חלופות פרו לנתיחה שלנוTocol ניתן להשתמש. כאן, תיארנו דיסקציה דרך החלק הגחון של ראש העש, מתן גישה העצבים מקסימילרי SEZ, אבל אפשר גם לגשת מבנים אלה על ידי לנתח את הצד הגבי. מצאנו כי הכנת הצד הגבי אינה אופטימלית להכנת הקלטות מהמבנים המבעבעים הללו בשל מיקומם העמוק, אך הכנה זו מציעה את היתרון של הפעלת הקלטות ממבנים מסדר גבוה יותר, כגון גוף הפטרייה, אזור שקשור לרבים - אינטגרציה חושית, למידה אסוציאטיבית ועיבוד זיכרון 34 . התמקדנו בשימוש של אלקטרודות tetrode כדי להקליט מן העצב maxillary, אבל, כפי שאנו באיור, אלקטרודות חד תאיים סטנדרטיים יכול לשמש גם למטרה זו. בנוסף, שתי הטכניקות ניתן לשלב לבצע הקלטות בו זמנית מאזורים מרובים במוח 10 . ספרות המוח מציעה דוגמאות רבות של iמודלים של חוליות אשר הוכיחו להיות כלים רבי עוצמה לחשיפת העקרונות הבסיסיים של עיבוד חושי, כגון קידוד הריח, החלים על חרקים ועל חוליות 35 , 36 , 37 , 38 , 39 . אנו מקווים שהשיטות שלנו יובילו לתובנות חדשות יסודיות על קידוד מתסכל.

מערכות המעי הגס וחוש הריח מייצרות ייצוגים פנימיים של כימיקלים בסביבה, מה שמביא לתפיסות של טעמים וריחות, בהתאמה. החושים הכימיים האלה חיוניים להפקת התנהגויות רבות חיוניות להישרדות האורגניזם, החל מציאת בני זוג וארוחות, כדי למנוע טורפים ורעלים. התהליך מתחיל כאשר כימיקלים סביבתיים אינטראקציה עם קולטנים הממוקם בקרום פלזמה של תאים קולטניים סנסוריים; תאים אלה, ישירות או באמצעות אינטראקציות עם נוירונים, transduce מידע על הזהות והריכוז של כימיקלים לתוך אותות חשמליים. אותות אלה מועברים לנוירונים מסדר גבוה יותר ומבני מוח אחרים. ככל שצעדים אלה מתקדמים, האות המקורי עובר תמיד שינויים המקדמים את יכולתו של האורגניזם לזהות, להפלות, לסווג, להשוות ולאחסן את המידע החושי, ולבחור בפעולה המתאימה. הבנת איך החזייהב transforms מידע על כימיקלים סביבתיים כדי לבצע מגוון רחב של משימות היא שאלה בסיסית בתחום מדעי המוח. קידוד גוסטורי נחשב כפשוט יחסית: תפיסה הרווחת גורסת כי כל מולקולה כימית שמקבלת טעם (&quot;טסטנט&quot;) שייכת באופן טבעי לאחת מחמש תכונות הטעם הבסיסיות ( כלומר , מתוק, מריר, חמוץ) , מלוח ואומאמי) 1 . בתפיסת &quot;הטעם הבסיסי&quot; הזה, תפקידה של מערכת התסכול הוא לקבוע אילו טעמים בסיסיים אלה קיימים. יתר על כן, המנגנונים העצביים המונחים ביסוד הטעם הבסיסי במערכת העצבים אינם ברורים, והם נחשבים להיות נשלט על ידי &quot;קו מסומן&quot; 2 , 3 , 4 , 5 , 6 או &quot;על פני דפוס סיבים&quot; 7 </suP&gt; , 8 קוד. בקוד קו מסומן, כל תא חושי וכל אחד מחסידיו העצביים מגיבים לאיכות טעם אחת ויוצרים ערוץ ישיר ועצמאי למרכזי עיבוד גבוהים יותר במערכת העצבים המרכזית המוקדשים לטעם. לעומת זאת, בקוד דפוס סיבי, כל תא חושי יכול להגיב לאיכויות הטעם המרובות, כך שהמידע על הטעם מיוצג על ידי התגובה הכוללת של אוכלוסיית הנוירונים הסנסוריים. בין אם מידע גוסטיווי מיוצג על ידי טעמים בסיסיים, באמצעות קווים מסומנים, או באמצעות מנגנון אחר, אינו ברור והוא מוקד החקירה האחרונה 3 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . העבודה שלנו לאחרונה עולה כי מערכת gustatory משתמש קוד האוכלוסייה spatiotemporal ליצורייצוגים של טסטנטים בודדים ולא בקטגוריות טעם בסיסיות 10 . כאן אנו מציעים 3 כלים חדשים כדי לסייע במחקר של קידוד gustatory. ראשית, אנו מציעים את השימוש של סנדקה hawkmoth מאנדוקה כמו אורגניזם מודל פשוט יחסית הנלמד מחקר אלקטרופיזיולוגי של טעם לתאר הליך לנתיחה. שנית, אנו מציעים את השימוש &quot;tetrodes&quot; תאיים להקליט את הפעילות של GRNs הפרט. ושלישית, אנו מציעים מנגנון חדש לאספקת ניטור מדויק של פעימות מתוזמן של טסטנט אל החיה. כלים אלה הותאמו טכניקות המעבדה שלנו ואחרים השתמשו כדי ללמוד את מערכת חוש הריח. חרקים כמו זבוב הפירות תסיסנית melanogaster , ארבה Schistocerca אמריקה , כמו גם עש סנדקה עש , יש עשרות שנים סיפק משאבים רבי עוצמה כדי להבין עקרונות בסיסיים על nerVOS, כולל קידוד סנסורי ( למשל, olfaction 13 ). אצל יונקים, קולטני הטעם הם תאים מיוחדים שמתקשרים עם נוירונים דרך מסלולים מורכבים של מסיר שני, 1 , 14 . זה פשוט יותר חרקים: קולטני הטעם שלהם הם נוירונים. יתר על כן, מסלולי הטעם של יונקים ליד הפריפריה הם מורכבים יחסית, שמציעות מסלולים עצביים מרובים מקבילים, ורכיבים חשובים הם מאתגרים לגישה, הכלולים במבנים גרמיים קטנים 15 . חרקים טעם חרקים נראה פשוט יותר. ב חרקים, GRNs כלולים מבנים מיוחדים המכונה סנסילה, הממוקם באנטנה, mouthparts, כנפיים ורגליים 16 , 17 . את GRNs ישירות לפרויקט לאזור תת תת קרקעי (SEZ), מבנה שתפקידו נחשב להיות בעיקר gustatory 17 , ואשר מכיל סדר שנינוירונים גוסטיים 10 . משם המידע מגיע לגוף כדי להניע רפלקסים, ולאזורים מוחיים גבוהים יותר להיות משולבים, מאוחסנים, ובסופו של דבר לנהוג בחירות התנהגותיות 16 . יש צורך לאפיין תגובות הטעם הפריפריה כדי להבין כיצד מידע הטעם הוא מופץ והשתנה מנקודה לנקודה לאורך מערכת העצבים. השיטה הנפוצה ביותר כדי לפקח ישירות על הפעילות העצבית של GRNs חרקים היא טכניקת ההקלטה קצה 12 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . זה כרוך הצבת אלקטרודה ישירות על סנסילום, שרבים מהם קל יחסית לגשת. הטעם כלול בתוך האלקטרודה, המאפשר אחד להפעיל ו extגזעני למדוד תגובות עצביות של GRNs ב sensillum. אבל, בגלל הטעם הוא הכיל את האלקטרודה, לא ניתן למדוד את פעילות GRN לפני הטעם נמסר או לאחר הסרתו, או להחליף טעימות מבלי להחליף את האלקטרודה 20 . שיטה נוספת, &quot;הקיר בצד&quot; טכניקה הקלטה, יש גם שימשו להקליט פעילות GRNs. כאן, אלקטרודה ההקלטה מוכנס לתוך הבסיס של טעם sensillum 24 , וטעמים מועברים דרך זכוכית נפרדת נימי על קצה הסנסילום. שתי הטכניקות להגביל את ההקלטה מ GRNs כדי sensillum מסוים. כאן, אנו מציעים טכניקה חדשה: הקלטה מתוך אקסון GRN שנבחרו אקראית מ sensilla שונים, תוך מתן בנפרד רצפים של טסטנטים כדי חוטם. הקלטות האקסון מושגות על ידי הנחת או אלקטרודות זכוכית חדה או צרורות אלקטרודה תאיים (tetrodes) לתוך העצב שנושאת אקסונים מGRNs ב חוטם 10 SEZ. במנדוצ&#39;ה , האקסונים האלה חוצים את העצב המקסימלי, הידוע כבעל אופי גרידא, המאפשר הקלטה חד-משמעית של תגובות חושיות 25 . שיטה זו של הקלטה מ אקסונים, מאפשר, במשך יותר משעתיים, מדידה יציבה של תגובות GRN לפני, במהלך ואחרי סדרה של מצגות טעימות. כאן, אנו מתארים הליך לנתיחה לחשיפת העצבים מקסימילרי יחד עם SEZ, אשר יכול לאפשר אחד להקליט בו זמנית את התגובות של GRNs מרובים נוירונים ב 10 SEZ. כמו כן, אנו מתארים את השימוש של הקלטות תאיים של GRNs באמצעות Custom-made 4 ערוצים tetrode מעוותת אשר, בשילוב עם שיטת מיון ספייק, מאפשר ניתוח של מספר (בידיים שלנו, עד שש) GRNs בו זמנית. אנחנו עוד להשוות הקלטות שנעשו עם tetrodes הקלטות שנעשו עם תאיים חדאלקטרודות. לבסוף, אנו מתארים מנגנון חדש עבור מתן גירויים טעים. הציוד החדש שלנו, המתבסס על הציוד ששימש זמן רב על ידי חוקרים רבים כדי לספק חומרי ריח בחקר האולפונים, מציע יתרונות לחקר הלמידה: שיפור במערכת ההולכה הרב-שנתית הקודמת, כמו אלה שפותחו על ידי סטורקוב ועמיתים (ראה הפניות 26 , 27 ), המנגנון שלנו משיג דיוק שליטה על העיתוי של משלוח טסטנט תוך מתן readout המתח של העיתוי הזה; וזה מאפשר משלוח מהיר, רציף של גירויים טעימות מרובים 10 . המכשיר מנגב את חוטם הזרימה בזרימה מתמדת של מים נקיים, שאליהם ניתן להעביר פולסים מבוקרים של טסטנט. כל דופק טעים עובר מעל חוטם ואז נשטף משם. טסטנטים מכילים כמות קטנה של צבעי מזון חסרי טעם, המאפשרים חיישן צבע לפקח, עם תזמון מדויק, את המעבר של ov טעיםאה חוטם.

<table><tbody><tr><td><חזק>דיסקציה והכנת דגימה</צינור</td> פוליפרופילן חזק><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 15 מ"ל מחט פלקון</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>, שיפוע קצר, 19 גרם x 1 - 1/2 אינץ'&nbsp;</td><td>&nbsp; MONOJET</td><td>888200144</td><td>למריחת אוויר להסרת השיער מהעש.</td></tr><tr><td>דוגמנות קליי-ואן אקן פלסטלינה&nbsp;</td><td>צלחת פטרי DickBlick</td><td>33268</td><td></td></tr><tr><td>-100 x 15 מ"מ&nbsp;</td><td>VWR International</td><td>89000-304</td><td></td></tr><tr><td>קצה פיפטה (1 - 200 ומיקרו; L)</td> <td>USA Scientific</td><td>1111-0806</td><td></td></tr><tr><td>סכין גילוח</td><td>Techni Edge</td><td>TE05-071</td><td></td></tr><tr><td>22 AWG חוט חיבור סטנדרטי</td><td>AlphaWire</td><td>1551</td><td>להכנסת הפרובוסקיס לקצה הפיפטה.</td></tr><tr><td>שעוות בטיק</td><td>אקארד</td><td>7946000</td><td></td></tr><tr><td>שעווה חשמלית</td><td>אלמור אינטרנשיונל</td><td>66000</td><td></td></tr><tr><td>סטריאו מיסקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>MZ75</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #1 מלקחיים (גס)&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>500335</td><td>להסרת שומן ורקמות שאינן עצביות.</td></tr><tr><td>דומונט #5 מלקחיים טיטניום (עדין)&nbsp;</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>14096</td><td>להסרת שומן ורקמות שאינן עצביות.</td></tr><tr><td>מלקחיים של Dumont #5SF (סופר עדין)</td><td>World Precision Instruments</td><td>500085</td><td>להסרת רקמת העצבים.</td></tr><tr><td>מספריים Vannas (עדין)</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td>להסרת הציפורן.</td></tr><tr><td>קולגנאז/דיספאז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>11097113001</td><td></td></tr><tr><td>אפוקסי</td><td>פרמטקס</td><td>84101</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>מערכת זלוף מי מלח</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סט הארכה עם ווסת זרימת קצב</td><td>&nbsp; בי בראון מדיקל בע"מ</td>ערכת מתן <td>V5200</td><td></td></tr><tr><td>IV עם אתר הזרקת Y</td><td>&nbsp; בי בראון מדיקל בע"מ</td><td>V1402</td><td></td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>Catalog Number</td><td>Comment<s/strong></td></tr><tr><td>Tastant Delivery System</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>White צינורות ניילון שקופים OD 1/4 אינץ', ID 1/8 אינץ'</td> <td>Small Parts Inc.</td><td>B001JJT4SA</td><td>צינור קשיח המחבר בין ארבעת האלמנטים העיקריים של המערכת.</td></tr><tr><td>מומחי מעגלים</td> <td>לברזל הלחמה</td><td>ZD200BK</td><td></td></tr><tr><td>כלי סיבובי - Dremel</td><td>Dremel</td><td>4200</td><td></td></tr><tr><td>רשת פוליפרופילן, גודל חור (גודל חור 0.1 x 0.13 ס"מ)&nbsp;</td><td>רשת תעשייתית</td><td>XN5170</td><td>להבטחת הצבת החרטומים של בעלי חיים שונים באותו מיקום.</td></tr><tr><td>מערכת זלוף 16 ערוצים בלחץ&nbsp;</td><td>כלי מדע ביולוגי</td><td>PS-16H</td><td>למשלוח טעם. מערכת זו כוללת שסתומי צביטה, צינורות, סעפת, צילינדרים לתמיסה, בקר שסתומים ואביזרי התאמה.</td></tr><tr><td>צינורות פוליפרופילן, תעודת זהות 0.034 אינץ', תעודת זהות 0.050 אינץ'</td> <td>בקטון, דיקינסון & Co</td><td>427421</td><td>צינור פלט ממערכת הזילוף.</td></tr><tr><td>מכשירי דיוק</td> <td>פנאומטיים של PicoPump</td> World <td>SYS-PV820</td><td>לשליטה בערוץ הפלט של מערכת הזילוף.</td></tr><tr><td>מערכת תוכנה לרכישת נתונים, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 כרטיס DAQ</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW 2011</td><td>כדי לשלוט במשאבת הפיקו להעברת טסטנט ולהקליט את האותות מחיישן הצבע.</td></tr><tr><td>Compulab 3 Manostat משאבה פריסטלטית</td><td>Sigma</td><td>P1366</td><td>לשאיבת מים.</td></tr><tr><td>צינורות סיליקון, מזהה 1/16 אינץ' OD 1/8 אינץ'</td> <td>Cole-Parmer</td><td>WU-95802-02</td><td>לחיבור מקור המים לצינור המשאבה הפריסטלטית, וצינור היציאה של המשאבה לצינור הקשיח של מערכת המסירה.</td></tr><tr><td>חיישן צבע-חיישן סיבים אופטיים דיגיטלי</td><td>Keyence</td><td>&nbsp; FS-V31M</td><td>לניטור מסירת טענות.&nbsp;</td></tr><tr><td>חיישן צבע-יחידת סיבים רפלקטיבית</td><td>Keyence</td><td>FU35-FZ</td><td>לחיבור מכשיר חיישן הצבע.</td></tr><tr><td>פריפריה דנטלית שעווה</td><td>הנרי-שיין 6652151 שיניים</td><td></td><td>כדי לאבטח את הפרובוסקיס לתוך הצינור הקשיח.</td></tr><tr>שני מיכלים <td></td><td></td><td>בנפח 3.7 ליטר</td><td>כדי לספק מים למערכת, ולאסוף את פסולת המים.</td></tr><tr><td>FCF&nbsp ירוק מהיר;</td><td>Sigma</td><td>F7258</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים חבישה 25.5 ס"מ</td><td>WPI</td><td>500364</td><td>להחדרת פרובוסקיס עש לחור הפרובוסקיס בצינור הקשיח.</td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>מספר קטלוגי</td><td>הערות</td></tr><tr><td>ציוד אלקטרופיזיולוגיה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DC מגבר</td><td>בראון-לי</td><td>440</td><td></td></tr><tr><td>מנורה</td><td>Schott</td><td>Schott Fostec מקור אור DCR 2</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור ידני</td><td>מיקרומניפולטור</td><td>Leica</td><td>כדי להכניס במדויק את הטטרודות למוח החיה. המניפולטור צריך לאפשר תנועות עדינות וגסות בציר x, y ו-z.</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>MZ75</td><td></td></tr><tr><td>שולחן בידוד רעידות (טבלת מעבדה MICRO-g)</td><td>TMC</td><td>63-541</td><td></td></tr><tr><td>אוסצילוסקופ</td><td>Tektronix&nbsp;</td><td></td><td></td>TDS2014</tr><tr><td>מגבר ומגבר 16 ערוצים</td><td>מערכת מגברים MA-800 16 ערוצים&nbsp;</td><td>מחשב B.E.S 2013</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dell</td><td>optiplex 780</td><td>להלן דרישות המינימום המומלצות. זיכרון RAM: 3.32 ג'יגה הרץ, 3 ג'יגה-בייט. מעבד: Intel Core&nbsp; 2 צמד. כרטיס גרפי: Intel GMA X4500 משולב.&nbsp;</td></tr><tr><td>מערכת תוכנה לרכישת נתונים, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 כרטיס DAQ</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW 2011</td><td>כדי לשלוט במשאבת הפיקו להעברת טסטנט ולהקליט את האותות מחיישן הצבע והאלקטרודה.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Tastants</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KAc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5708</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9650</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73575</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>84097</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטות חדשות לחקר קידוד גוסטוריאלי

New Methods to Study Gustatory Coding 

חוש הטעם מאפשר לבעלי חיים לזהות חומרים כימיים בסביבה, מה שמביא להתנהגויות חיוניות להישרדות. כאשר נוירונים קולטן גוסטורי (GRNs) לזהות מולקולות טסטנט, הם לקודד מידע על הזהות ואת הריכוז של הטעם כמו דפוסי הפעילות החשמלית כי אז להפיץ נוירונים עוקבים במוח. דפוסים אלה מהווים ייצוגים פנימיים של הטעם, אשר לאחר מכן לאפשר החיה לבחור פעולות לזכרונות. השימוש במודלים של בעלי חיים פשוטים יחסית היה כלי רב עוצמה ללימוד עקרונות בסיסיים בקוד החושי. כאן, אנו מציעים שלוש שיטות חדשות ללמוד קידוד gustatory באמצעות mextuca mextuca sexta . ראשית, אנו מציגים הליך לנתיחה לחשיפת עצבים מקסימילריים אזור תת אזורית (SEZ), המאפשר הקלטה של ​​הפעילות של GRNs מן האקסונים שלהם. שנית, אנו מתארים את השימוש של אלקטרודות תאיים כדי להקליט את הפעילות של GRNs מרובים על ידי הצבת teTrode חוטים ישירות לתוך העצב Maxillary. שלישית, אנו מציגים מערכת חדשה לאספקת ניטור, עם דיוק גבוהה בזמן, פולסים של טסטנטים שונים. שיטות אלה מאפשרים אפיון של תגובות העצבית vivo ישירות GRNs לפני, במהלך ואחרי הטעמים מועברים. אנו מספקים דוגמאות של עקבות מתח שנרשמו מ GRNs מרובים, ולהציג דוגמה כיצד טכניקה מיון ספייק ניתן ליישם את הנתונים כדי לזהות את התגובות של נוירונים בודדים. לבסוף, כדי לאמת את הגישה שלנו הקלטה, אנו משווים הקלטות תאיים המתקבל GRNs עם tetrodes הקלטות תאיים שהושגו עם אלקטרודות זכוכית חדה.

הפעילות של GRNs ניתן להקליט באמצעות אלקטרודה tetrode תאיים לפני, במהלך ואחרי משלוח טסטנט ( איור 6 א ו 6 ג ). איור 6 א (פאנל באמצע ותחתון) מראה סימני מתח מסוננים (300-6,000 הרץ) שנרשמו על ידי כל אחד מארבעת חוטי הניצב בעצב מקסימלי, שבו ניתן לזהות סימנים של אמפליטודות שונות המשקפות פוטנציאל פעולה (חיצים). דופק 1 של טסטנט (1 סוכרוז M) נמסר 2S לאחר תחילת הניסוי; את הופעת ו היסט של הגירוי היה פיקוח על ידי חיישן צבע ( איור 6 א , הלוח העליון). טסטנט המושרה קוצים שניתן לראות בכל אחד מארבעת הערוצים ( איור 6 א , לוח באמצע). GRNs יכולים להיות מזוהים ומכובד מן mechanosensors (לא מוצג כאן) כאשר הם מגיבים על כמה טעימות ולא אחרים כדי לזהות ולבודד תגובות נוירון יחיד מהקלטות tetrode, ביצענו מחוץ לקו ספייק מיון באמצעות קבוצה של פונקציות מותאמות אישית המבוססת על 31 של Pouzat ו 32 של קליינפלד של 33 שיטות (שיטות אלה מתוארים ציטוטים אלה: 10 , 29 ). איור 6 ב מציג דוגמה של מיון ספייק להחיל את הנתונים המוצגים בתרשים 6 א , שבו שלוש יחידות מבודד היטב נמצאו. מגרשים סריקה איור 6 ג מתארים תגובות של שלוש יחידות מבודדים באיור 6B עד שש טסטנטים שונים (1 סוכרוז M, מלטוז ו NaCl, 100 קפאין מ&quot;מ ו 10 מ&quot;מ ברברין ו לובלין) נמסר ברצף (4 משפט<html> S / tastant מוצגים). כפי שמוצג באיור 6 ג , ה- GRNs המוקלט יש רמות שונות של פעילות בסיסית, החל משתיקה (GRNs 1) כדי נמוך או בינוני (GRN 2 ו -3). לאחר הופעת טסטנט, GRNs להראות דפוסי פעילות מגוונים בתערוכות סלקטיביות שונים הטעמים. לדוגמה, GRN 1 הגיב רק סוכרוז, בעוד GRN 2 הגיב maltose ו NaCl עם פרץ של דוקרנים ל lobeline עם spiking רק עם תחילת הגירוי. בנוסף, חלק מהתגובות נעולות לעיתוי הגירוי ( כמו תגובה GRN 1 ל סוכרוז), בעוד שהתגובות האחרות משפיעות על משך הגירוי ( כגון תגובת GRN 3 לברברין) או המכילות מרכיבים מעוררים ומעכבים ( למשל איור 7 GRN 2 תגובות NaCl ו סוכרוז). לקבלת מידע נוסף על הרגישויות המגוונות ודפוסי הפעילות של GRN ראה התייחסות 10 . = &quot;1&quot;&gt; כדי לאמת את השימוש בטכניקות tetrode ו- spike-sort כדי להקליט GRNs מהעצב המקסימלי, ביצענו הקלטות תאיים מאקסונים של GRN בבעלי חיים אחרים באמצעות אלקטרודות זכוכית חדות קונבנציונליות (התנגדות של 80-120 MΩ). מצאנו כי דפוסי הפעילות שהושגו באמצעות הקלטות תאיים היו דומים לתגובות שנצפו באמצעות טכניקת tetrode ( איור 7 ). עקבות המתח בתיבה הירוקה בלוח A נרשמו תוך כדי תאימות בין GRN 1 במהלך 5 ניסויים עוקבים של מצגת סוכרוז, ותגובות זהות מוצגות כנקודות רסטר בחלונית B. (שים לב כי סוג זה של תגובה תואם את זה שהתקבל עם tetrodes ו כפי שמוצג באיור 6 ג .) GRN 2, שנרשמה עם אלקטרודות חדות תאיות, מראה דפוס תגובה רחב יותר. <img alt="איור 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55868/55868fig6v2.jpg"/&gt; איור 6: תוצאות נציג מתוך הקלטות עצבים מקסיליים עם Tetrodes תאיים. ( א ) מסוננים (300-6,000 הרץ) עקבות מתח נרשם על ידי כל אחד מארבעת חוטי בעצב מקסימלי (לוח באמצע). דופק 1 של טעימות היה מוחל במהלך פרק הזמן המצביע על ידי הצללה אדומה בלוח האמצעי. ההתחלה וקיזוז הגירוי נבחנו על ידי חיישן הצבע כפי שצוין על ידי עקבות המתח האדום על הלוח העליון, והיא מסומנת על הלוח האמצעי על ידי השטח המוצל באדום. הקווים האופקיים המנוקדים מציינים +50 (למעלה), 0 (באמצע) ו -50 (למטה) μV. הגדלה של עקבות מתח גולמי המתאים לאזור בתוך הקווים מנוקד אנכי מוצג (הפאנל התחתון). דוגמאות של קוצים מסומנים על ידי החצים. ( ב ) דוגמה של מיון ספייק מוחל על הנתונים המוצגים בלוח א. צורות הגל שנרשמו בכל אחד מארבעת חוטי תאיים (1-4) arE מזוהה עם שלוש GRN שונים (יחידות 1-3) לתרום את האותות המוקלטים. אירועים בודדים (קווים דקים צבעוניים) ואת הממוצע (קו שחור עבה) מוצגים עבור שלוש יחידות. יש לבחון מספר קריטריונים סטטיסטיים כדי לזהות באופן מהימן יחידות עצמאיות תוך שימוש בשיטת מיון ספייק (ראה הפניות 10 , 29 ). ( C ) סריקה מגרשים המייצג תגובות של שלוש יחידות מבודדות רצף של שישה טסטנטים שונים (4 ניסויים / טסטנט מוצגים). פרק הזמן של משלוח טסטנט (1) מסומן על ידי השטח מוצל אדום. ריכוז של טסטנטס היו גם 1 M (סוכרוז, maltose, NaCl), 100 מ&quot;מ (קפאין) ו 10 מ&quot;מ (berberine ו lobeline). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55868/55868fig6v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" c<html> Lass = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55868 / 55868fig7.jpg&quot; /&gt; איור 7 : הקלטות תאיים של אקסונים GRN. ( A , לוח ירוק) עקבות מתח שנרשמו GRN עם זכוכית חדות תאיים אלקטרודות (התנגדות של 80-120 MΩ) הניח לתוך העצב Maxillary, עורר על ידי 5 גירויים רצופים עם סוכרוז M 1 (Suc). ( ב ) סריקה מגרשים של תגובות של שני GRNs, כולל התגובות שמוצג בלוח א &#39;(לוח תיבת ירוק), לשני טסטנטים שונים מועברים ברצף (100 מ&quot;מ צבע גופן אפור, 1 M צבע גופן שחור) נרשם עם זכוכית חדה אלקטרודות תאיים להציב את העצב Maxillary (7 ניסויים / טסטנט ו 3 ניסויים / מים מוצגים). זמן אספקה ​​טעים מסומן על ידי אזורים מוצללים בשני לוחות. ההתחלה וקיזוז הגירוי נבחנו על ידי חיישן הצבע, כפי שצוין על ידי עקבות המתח האדום בתחתית כל פאנל.Es / ftp_upload / 55868 / 55868fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

אנו מציגים שלוש שיטות חדשות כדי ללמוד קידוד gustatory . בעזרת חיית מחמד פשוטה, המנדוקה סוקה ( Manduca ) , אנו מתארים פרוטוקול לנתיחה, השימוש tetrodes תאיים להקליט את הפעילות של נוירונים קולטן רב גוסטורי, ומערכת לאספקת ומעקב פולסים תזמון מדויק של טעימות.

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...

המטרה הכוללת של שיטות אלו היא לחקור קידוד טעם בבעל חיים פשוט, mandi-casecsta, באמצעות הקלטת פעילותם של מספר נוירונים קולטנים in vivo, תוך מתן וניטור של פולסים של חומרי טעם בתזמון מדויק. שיטות אלו יכולות לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנושא תחושת הטעם, כגון האופן שבו חומרי טעם מקודדים על ידי אוכלוסיות של נוירונים קולטני טעם. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הקלטות in vivo של מספר נוירוני טעם לפני, במהלך ואחרי מתן מדויק של גירויי טעם.אנשים שאינם מכירים שיטה זו עשויים למצוא אותה מאתגרת מכיוון שפרוצדורת הנתיחה היא מורכבת. בשל כך, אנו מקווים שההדגמה הוויזואלית של השיטה תסייע להם. טכניקות אלו פותחו על ידי Sam Writer כאשר היה סטודנט לתואר מתקדם במעבדה שלי, יחד עם Alejandra, ו-Kui Sun ידגים פרוצדורות אלו.שלושה ימים לאחר הבקיעה, בחרו נאי של מין כלשהו שנראה בריא באופן כללי. הכנפיים צריכות להיות פרושות לחלוטין, והפרובוסקיס והמחושים צריכים להיות מעוצבים היטב ושלמים. בתוך מ𒄅, הכניסו את הנאי שנבחר לתוך צינור קיבוע עד שהראש יהיה חשוף.לאחר מכן, קבעו את העש על ידי הכנסת נייר ספיגה לקצה השני של המבחנה. כעת, באמצעות אוויר בלחץ המוזרם ממזרק, הסירו את השערות מהראש החשוף. לאחר מכן, הניחו את המבחנה על פלטפורמת חימר בתוך צלחת פטרי.הנח את הראש כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, הגן על המחושים ועל ה-proboscis. ראשית, הכן כיסויים לכל מבנה מקצות של פפטות בנפח 200 microliter שגולשו לאורך של חצי סנטימטר.כדי לתמרן את הבוסקס (proboscis), הכין וו מחתיכת תיל. הארך את הבוסקס אל תוך אחד הכיסויים עד שהחלק הפרוקסימלי ביותר של הבוסקס מוגן.יבס את הצינור לחלק הגבי של קפסולת הראש באמצעות שעוות באטיק חזקה.בשלב הבא, יש להסתיר בזהירות את המחושים ולאבטח את השפופרות בעזרת שעוות באטיק. כעת, יש לייצב את המוח על ידי חיתוך של שריר דחיסת האבזם (buckle compressor muscle). תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמש בכלי מיקרו-דיסקציה כדי לפתוח את קפסולת הראש באמצעות חתך קטן ממש מתחת לחרטום.כדי לוודא שהשריר נחתך, הגישו תמיסת סוכרוז לשני השלישים הדיסטליים של החרטום, ומשך חמש דקות ודאו שהחרטום אינו נמתח. לאחר מכן, סגרו את קפסולת הראש באמצעות שכבה של שעוות באטיק מומסת. כדי לבצע פרפוזיה של המוח במי מלח, בנו כוס שעווה מסביב לצד הוונטרלי של הראש.בעזרת מחולל שעווה חשמלי, התחילו בבניית גביע שעווה לאורך חזית הראש תוך תנועה לכיוון האחורית. השאירו את צינורות התבלית (proboscis) והמחושים בתוך הגביע. המשיכו לבנות את הגביע כלפי חוץ וכלפי מעלה עד שייגשם לגובה העיניים.באמצעות פינצטה, קחו את המחושים השפתיים (labial palps) והצמידו אותם לכוס השעווה בעזרת שעווה מומסת. לאחר מכן, אטמו את כל הפתחים בכוס השעווה ובצינורות באמצעות שכבה דקה של אפוקסי דו-רכיבי. ערבבו את האפוקסי בעזרת קיסם.ראשית, כסו את המשטחים החיצוניים והפנימיים של הכוס. שנית, מלאו את חלקו של צינור הריסון המקיף את הצוואר כך שהראש יתקבע בצורה חזקה יותר. לאחר 20 דקות, בדקו את הכוס לאיתור דליפות.כדי להתחיל בניתוח המוח, חתכו תחילה את המחושים השפתיים (labial palps). כדי לפתוח את הצד הגחוני של קפסולת הראש, חתכו את הקוטיקולה לאורך החלק האחורי והקדמי של הראש ומסביב לעיניים. לאחר מכן, חתכו לאורך החלק האחורי של הראש ובצעו חתכים נוספים לאורך החלק הקדמי של הראש בקרבת החרטום (proboscis).לאחר מכן, הרימו בעדינות את מקרי cuticle בעזרת פינצטה כדי לחשוף את המוח. כעת, בצעו את השלב הקריטי ביותר, חשיפת ה-SEZ ועצבי הלסת העליונה (maxillary nerves). הסירו באיטיות ובזהירות את רקמת השומן ואת הקנה (trachea).שטפו את המוח לעיתים קרובות בתמיסת מלח טרייה. היזהרו מאוד, שכן קל מאוד למעוך את העצבים הלסתייים (maxillary nerves). כאשר ה-SEZ והעצבים הלסתייים יהיו גלויים לבסוף, הם יהיו מכוסים בנרתיק דק.כדי להסיר מעטפת זו, יש לנקז עודפי סליין ולאחר מכן להחליש את המעטפת על ידי החלת תמיסת 10% collagenase dispase. לאחר השריה של חמש דקות, יש לשטוף את התמיסה מספר פעמים בעזרת סליין. לאחר מכן, לאחר מספר שטיפות בסליין, יש להסיר בעדינות את המעטפת באמצעות פינצטות מיקרו-דיסקציה superfine.לבסוף, חברו קו טפטוף סליין אל כוס הפרפוזיה. חלק זה מתאר כיצד לבנות ולהשתמש במערכת להחדרת חומרי טעימה. המערכת מורכבת מנבובת בדיקה עם מספר פתחים.הפתחים מספקים כניסה עבור החרטום של בעל החיים, מגוון של חומרי טעם, וחיישן צבע, והם מאפשרים זרימה של מים. כדי לבנות מערכת זו, הכינו תחילה צינור בדיקה עבור החרטום. צרו חור בגודל החרטום באמצעות מלחם.לאחר מכן, בנו מקטע מוגן ברשת בתוך הפחית כדי להחזיק את הproboscis במקומו. חתכו חמישה מילימטרים מעל החור, הצמידו שם את הרשת באמצעות שעווה, וחברו מחדש את הפחיתות באמצעות שעווה ואפוקסי. השתמשו במערכת פרפוזיה בלחץ להגשת חומרי הטעם.חברו למניפולטור (manifold) מספר צינורות טועמים (tastant tubes) לפי הצורך. כדי לחבר את צינור הפלט של הטועם, הכינו חור בכמובן סנטימטר אחד מעל הרשת, ולאחר מכן קבעו אליו את צינור הפלט באמצעות אפוקסי. בכל טועם, הוסיפו צבע מלאכותי שייגלה על ידי חיישן צבע.חברו חיישן צבע למכשיר בחור הנמצא במרחק של חצי סנטימטר מהרשת, ואבטחו אותו שם באמצעות אפוקסי. השתמשו במשאבה פריסטלטית כדי להזרים מים מזוקקים למערכת באמצעות צינור סיליקון. אספו את מי השפכים למכל גדול.השתמש במשאבה פנאומטית כדי להגיש את חומרי הטעם באמצעות נשיפות אוויר. כעת, התחל להזרים מים נקיים דרך הפחית, והגש פולסים של חומר טעם כדי לבדוק את חיישן הצבע. כעת, הכנס את שני שליש מאורך שפופת הפה של העש לתוך צינור הבדיקה.בעזרת פינצטה, הרחבו את החרטום והחדירו אותו בעדינות אל תוך החור. לאחר מכן, אטמו את החרטום במקומו באמצעות שעווה דנטלית רכה ושכבת אפוקסי. כעת, חברו את קו פריפוזיית הסליין והגדירו את קצב הזרימה של הפריפוזיה.לאחר מכן, טבול את אלקטרודת ההארקה של הטטרודה עם החוטים הפלפוליים (twisted wire tetrode) לאמבט הסליין. לאחר מכן, באמצעות מיקרו-מניפולטור, מקם את הטטרודה לצד העצב המקסילרי (maxillary nerve), והחדר אותה באיטיות אל תוך העצב. לאחר זיהוי אותות של פריקה (spiking signals), המתן לייצוב הדגימה למשך 10 דקות לפחות לפני תחילת ההקלטות.הקליטות בוצעו מנוירונים רגישים לטעם לפני, במהלך ואחרי מתן חומרי טעם, בהתאם לפרוטוקול המתואר. תחילת וסיום הפולס של כל חומר טעם, שנמשך שנייה אחת, נוטרו באמצעות חיישן הצבע. חומרי הטעם עוררו פוטנציאלי פעולה (spikes) שזוהו על ידי כל אחד מארבעת הערוצים.בתוך רכבות הפולסים (spike trains), ניתן היה להבחין בפוטנציאלי פעולה בודדים. תוכנה למיון פולסים (Spike sorting) שימשה לשיוך פולסים אלו לנוירונים ייחודיים. התגובה של שלושה נוירונים קולטני טעם שונים לשישה חומרי טעם שהוגשו ברצף, חושפת רמות שונות של פעילות בסיס וסלקטיביות לחומרי הטעם.כמו כן, לתגובות היו זמני תגובה שונים. חלקן נקבעו למשך זמן הגירוי, בעוד שחלקן נמשכו מעבר לזמן הגירוי. ניתן היה לבצע הקלטות תוך-תאיות מצומרי קולטני טעם באמצעות אלקטרודות זכוכית חדות קונבנציונליות.ההקלטות התוך-תאיות היו דומות מאוד לתגובות שנצפו בשימוש בטכניקת הטטרודה המתוארת, אך ההקלטות באמצעות הטטרודה היו קלות יותר לביצוע, נמשכו זמן רב יותר והיו עמידות יותר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להיות מסוגלים לחשוף את עצבי הלסת העליונה (maxillary nerves) ואת האזור התת-וושחתי (sub-esophagal zone) ב-mandi-casecsta, ולהיות מסוגלים לבנות מערכת להגשת חומרי טעם עם בקרה זמנית מדויקת. בעת ביצוע פרוטוקול זה, עליכם להשתמש בכפפות הגנה למעבדה ובמסכת פנים, מכיוון שהקשקשים האבקיים העדינים השפוכים על ידי mandi-casecsta עלולים להיות אלרגניים.לאחר השליטה בפרוצדורה, ניתן להשלים אותה בתוך שלוש שעות וחצי. בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע גם הקלטות סימולטניות מאזורי מוח מרובים כדי לענות על שאלות נוספות, כגון, כיצד תגובות של נוירונים קולטני טעם למרכיבי טעם משתנות כאשר הן מועברות לנוירונים הפוסט-סינפטיים המהווים את יעד התגובה.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הידע של המנגנונים המולקולריים שבבסיס התמרה התעורר אצלם נהנתה לאחרונה התקדמות משמעותית, בעיקר בשל שימוש במודלים של בעלי חיים. עם זאת, מגוון רחב של רגישות וספציפיות טעם בקרב היונקים מחקרים צווי ברקמות אנושיות. אנו מתארים טכניקה ביופסיה כדי לאסוף טעם תאים חיים מ גבשושיות על הלשון האנושית.

שיטת איסוף Fungiform (טעם) ואדומות מן הלשון האדם

פרוטוקול זה מתאר הקלטה תאית מתגובות פוטנציאל הפעולה שנורו על ידי נוירונים טעם labellar בדרוזופילה.

הקלטת אלקטרו מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; Labellar טעם Sensilla

הרגליים הקדמיות והפרובוסקיס של דרוזופילה מכילים רפרטואר עשיר של נוירונים חושיים טעמיים. כאן, אנו מציגים שיטה המשתמשת בהדמיית סידן כדי למדוד תגובות פיזיולוגיות מנוירונים חושיים ברגל הקדמית וחוטם של זבובים חיים ביישום אקסוגני של פרומון טעם.

מדידת תגובות פיזיולוגיות של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עצב סנסורי כדי ליפידים פרומונים שימוש סידן הדמיה חיה

טעם הוא תהליך חושי חשוב המאפשר משיכה לחומרים מועילים והימנעות מחומרים רעילים.  פרוטוקול זה מתאר מבחן בליעה פשוט לקביעת העדפת טעם של דרוזופילה לתרכובת כימית נתונה.

Assay העדפות טעם למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em

פרוטוקול זה מודד תגובות הטעם האנושי, כולל הערכה אנטומי קצרה, מבחן טעימות קצר ו שיטת אימות באמצעות מדווחת תחושה וטעם קולטן גנוטיפ הנבדק.

מבחן טעימה: קצר, המאומת בדיקה

מאמר זה מתאר שיטות להכנת רקמות, כתמים וניתוח של פטריות שלמות, בלוטות טעם וחך המניבות בעקביות בלוטות טעם שלמות ושלמות (כולל סיבי העצבים המעוררים אותן) ושומרות על היחסים בין מבנים בתוך בלוטות הטעם לבין הפפילה שמסביב.

כתמים, הדמיה וניתוח של פטריות, בלוטות טעם של הרכבה מלאה, מקיפים וחיך

כאן אנו מציגים כיצד לחשוף את גנגליון geniculate של עכבר מעבדה חי, מרדים וכיצד להשתמש הדמיית סידן כדי למדוד את התגובות של הרכבים של נוירונים אלה לטעום גירויים, המאפשר ניסויים מרובים עם ממריצים שונים. זה מאפשר השוואות מעמיקות של אילו נוירונים מגיבים לאו תיוהמים.

In vivo סידן הדמיה של עכבר גניציה גנגליון נוירון תגובות לגירויים טעם

המאמר מציג את מכשיר μTongue (microfluidics-on-a-tongue) להדמיית תאי טעם פונקציונליים ב- vivo על ידי שילוב מיקרופלואידיקה בחלון הדמיה תוך-וינטלי על הלשון.

μTongue: פלטפורמת הדמיה פונקציונלית מבוססת מיקרופלואידיקה עבור הלשון ב- Vivo

שיטה נדירה של הקלטה אלקטרופיזיולוגית, הקלטת בסיס, מאפשרת ניתוח של תכונות של קידוד טעם שלא ניתן לבחון בשיטות הקלטה קונבנציונליות. הקלטה בסיסית מאפשרת גם ניתוח תגובות טעם לגירויים הידרופוביים שלא ניתן לחקור בשיטות אלקטרופיזיולוגיות מסורתיות.

הקלטת בסיס: טכניקה לניתוח תגובות של נוירוני טעם בדרוזופילה

גישת הדמיית סידן מאפשרת להקליט תגובות הנגרמות על ידי טעם במוחם של זבובים ערים בזמן שתמיסה מוחלת על התווית. תגובות טעם ראשוניות ב-Drosophila melanogaster משמשות כדוגמה, אך ניתן להתאים פרוטוקול זה לחקר נוירונים במורד הזרם או מינים אחרים.

ב Vivo הדמיית סידן של תגובות עצביות הנגרמות על ידי טעם בדרוזופילה בוגרת

חקור שיטות חדשות לרישום נוירונים גוסטוריים בחי Manduca sexta באמצעות טטרודות חוץ-תאיות ומערכת למסירת גירויים טעמיים מדויקת. השיטה מאפשרת הבנה עמוקה של קידוד מידע טעם.

שיטות חדשות לחקר קידוד גוסטוריאלי

גלה סרטונים נוספים