Multiplexing di campioni automatizzato utilizzando l'etichettatura isotopica precursore combinata e il tagging isobarico (cPILOT)

Il nostro protocollo cPILOT automatizzato rende più facile per i ricercatori analizzare i campioni in modo ad alta produttività. Questo è significativo perché ci consente di ottenere informazioni biologiche su malattie o condizioni diverse molto più velocemente. Il vantaggio principale di questa tecnica è che aiuta a elaborare più campioni in parallelo, riducendo così gli errori utilizzabili durante l'utilizzo di campioni ad alta velocità effettiva.

Il nostro laboratorio è interessato ad applicazioni legate all'invecchiamento e al morbo di Alzheimer. Tuttavia, questa tecnica può anche essere utilizzata per studiare qualsiasi malattia o sfida per dove ci sono tessuti biologici coinvolti. Iniziare accendendo l'apparato a pressione positiva, il dispositivo di riscaldamento e raffreddamento e le pompe per vuoto.

Collega tutti gli accessori con il gestore del liquido, che mostrerà una luce blu una volta collegato al computer e pronto per l'esercizio. Aliquot 300 microlitri del fegato omogeneizzano in un tubo da 500 microlitri e lo posizionano su una piastra profonda di due millilitri. Archiviare l'esempio a quattro gradi Celsius fino all'inizio del protocollo.

Aprire il metodo nel software e posizionare i suggerimenti e i labware richiesti nelle loro posizioni. Quindi eseguire il controllo incrociato con il layout del mazzo finale e fare clic su Avanti per continuare il protocollo. Caricare 230 punte di microlitri e aspirare 90 microlitri di otto urea molare dal serbatoio.

Quindi erogarlo per remare uno dei due millilitri neri piastra profonda bene. Scaricare le punte di TL1 e ripetere questo passaggio fino a quando l'urea non è stata aggiunta a tutti i pozzi. Dopo aver aggiunto il tampone di denaturazione, utilizzare 90 punte di microlitri per trasferire 10 microlitri di omogenato di fegato di topo nella piastra del pozzo profondo.

Scaricare le punte, quindi caricare una fila di 90 punte di microlitri e aspirare tre microlitri di DTT dalla piastra di reagente uno. Distribuire DTT alle file uno e due della piastra del pozzo profondo. Sigillare la piastra campione con un foglio di alluminio e incubarla a 37 gradi Celsius per 600 secondi mentre si ruota a 300 giri/min.

Dopo l'incubazione, caricare una fila di 90 punte di microlitri, aspirare sei microlitri di IAM dalla piastra del reagente una alla terza riga e erogarla per remare una delle piastre campione. Sigillare la piastra campione e incubarla a quattro gradi Celsius per 30 minuti mentre si ruota a 300 giri/min sul dispositivo di raffreddamento. Quindi smacchiare la piastra del campione e caricare una fila di 90 punte di microliter.

Aspirare cinque microlitri di cistina dalla piastra del reagente uno alla riga due e disrogarlo alle file uno e due della piastra del campione. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo l'incubazione, eseguire una scossa a tempo di 1800 giri/min per 30 minuti.

Quindi aggiungere 800 microlitri di tampone Tris millimolare da 20 millimolare con cloruro di calcio millimolare ad ogni pozzo sulla piastra del campione per diluire la concentrazione di urea in due molari. Aggiungere 20 microlitri di triptina alla prima fila di una piastra da 96 pozzi e posizionare la piastra in una posizione specificata sul ponte. Dopo aver aggiunto la tripsina alla piastra del campione, sigillarla e incubarla per 15 ore a 37 gradi Celsius e 600 RPM sul dispositivo di riscaldamento e raffreddamento.

Interrompere la digestione aspirando 150 microlitri di acido formico al 5% dalla terza riga della piastra dell'acido formico e erogandola alla piastra del campione alle file uno e due. Procedere a desalt i peptidi. Utilizzare 1070 punte di microlitri per aspirare 600 microlitridi di acetonitrile.

Quindi erogarlo in file uno e due dell'estrazione in fase solida, o piastra SPE, per attivare il C-18. Quindi, caricare il campione digerito sulla piastra SPE in due passaggi. Caricare due file di punte, aspirare 534 microlitri dei campioni digeriti e disrogarli alle file uno e due della piastra SPE.

Applicare la pressione sulla piastra e ripetere questo passaggio fino a quando tutti i campioni non vengono caricati. Pulire i peptidi lavandosi con acqua e diluire i peptidi con 60-40 acetonitrile nello 0,1% di acido formico. Quindi posizionare la piastra sopra una piastra di raccolta per elutare i peptidi usando l'apparato a pressione positiva.

Disegnare il flow-through e impostare i suggerimenti e i labware richiesti nel software, fare un controllo incrociato con il layout del deck e fare clic su Avanti per continuare il protocollo per la dimetilazione. Ricostituire i peptidi in acido acetico all'1%. Per eseguire l'etichettatura di dimetilazione, caricare 90 punte di microlitri e aspirare 16 microlitri di formaldeide leggera da 60 millimolare dalla seconda fila di piastra reagente due.

Erogarlo per remare una delle piastre campione, quindi scaricare le punte. Caricare una fila di 90 punte di microlitri e aspirare 16 microlitri di formaldeide pesante 60 millimolare dalla terza fila della piastra di reagente due. Erogarlo riga due della piastra campione e scaricare le punte.

Caricare due file di 90 punte di microlitri e aspirare 16 microlitri di cianoboroidro di sodio millimolare e 24 millimolare cianoborodeuteride di sodio dalle file uno e due della piastra reagente tre, quindi erogare i reagenti alle file uno e due della piastra del campione per iniziare la reazione di dimetilazione. Scaricare le punte e utilizzare lo shaker orbitale per eseguire una scossa a tempo per 15 minuti a 1800 giri/min. Quindi caricare due file di 90 punte di microlitri e aspirare 32 microlitri di 1% di ammoniaca dalle file tre e quattro della piastra di reagente tre.

Erogarlo in file uno e due di piastra campione due per fermare la reazione. Combina volumi uguali di peptidi dimetilati leggeri e pesanti in una nuova piastra profonda di due millilitri per la dissalazione. Dopo aver dissaleto i peptidi leggeri e pesanti combinati, asciugare i peptidi ed eseguire l'etichettatura isobarica.

Ricostituire i peptidi con 100 microlitri di tampone di bicarbonato di trietilonio millimolare su uno shaker orbitale. Quindi utilizzare 90 punte di microlitri per aspirare 25 microlitri dei peptidi dimetilati combinati e erogarli alla prima fila della piastra di lavorazione TMT. Caricare una riga di 90 punte di microlitri e aspirare 10 microlitri di TMT.

Erogarlo nella prima riga della piastra di lavorazione TMT, scaricare le punte, quindi eseguire un frullato a tempo per un'ora a 1800 giri/min. Aspirare otto microlitri di idrossilammina dalla seconda fila della piastra TEAB e erogarla per remare una delle piastre di lavorazione TMT. Dopo una scossa di 15 minuti a 1800 giri/min, trasferire 30,5 microlitri dei peptidi etichettati TMT in un tubo da 1,5 millilitri.

Quindi procedere con l'acquisizione e l'analisi dei dati secondo le indicazioni manoscritte. I dati rappresentativi della SM di un peptide identificato in tutti i 22 canali ionici reporter da un esperimento di etichettatura isotopica del precursore combinato 22 Plex e di tagging isobarico sono mostrati qui. La sequenza del peptide corrisponde alla betaina-omocisteina S-metiltransferasi.

Gli ioni di frammento più intensi sia per i picchi dimetilati leggeri che per i picchi dimetilati pesanti sono stati ulteriormente isolati per la frammentazione MS3. Le intensità degli ioni reporter sono direttamente proporzionate all'abbondanza peptidica nel campione. Nel complesso, questo esperimento combinato di etichettatura isotopica precursore e tagging isobarico ha ridotto i tempi di elaborazione del campione e ha permesso di visualizzare l'espressione proteica su più canali o condizioni.

Il box plot dell'abbondanza del log 10 rispetto alle intensità totali degli ioni reporter su tutti i 22 canali mostra una minore variabilità tra i pozzi o tra campioni. La valutazione dell'automazione totale è stata effettuata esaminando l'errore nell'abbondanza di ioni reporter in ciascuna proteina nei 22 campioni. L'elaborazione del campione con la piattaforma robotica ha comportato coefficienti di variazione molto bassi.

Nei 3098 peptidi, il coefficiente medio di variazione nell'abbondanza di ioni reporter era rispettivamente del 12,36% e del 15,03% per i peptidi dimetilati leggeri e pesanti. Quando si tenta questo protocollo, è importante tenere presente che i livelli isotopico e isobarico vengono utilizzati in un singolo esperimento. Pertanto, è necessario eseguire un'attenta pianificazione per designare ogni campione con i tag destinati ad essere utilizzati nell'esperimento.

Questo metodo può essere facilmente integrato in altri sistemi robotici e può essere applicato a una varietà di tessuti, come tessuti o lysati cellulari e altri biofluidi.