Zelfassemblage van gamma-gemodificeerde peptide nucleïnezuren in complexe nanostructuren in organische oplosmiddelmengsels

Dit nieuwe protocol beschrijft het gebruik van meerdere verschillende sequenties van het synthetische nucleïnezuur bootsen gamma PNA na om nanostructuren te vormen in specifieke organische oplosmiddelmengsels. De hier beschreven tests tonen de noodzaak aan om bestaande nucleïnezuurnanotechnologieprotocollen aan te passen aan organische oplosmiddelen waar weinig tot geen protocollen zijn gepubliceerd. Beoefenaars die nieuw zijn voor deze techniek kunnen het moeilijk vinden om bestaande protocollen die voor waterrijke omgevingen zijn ontwikkeld aan te passen aan organische oplosmiddelrijke omgevingen vanwege de neiging van het nanomateriaal PNA om samen te voegen.

Begin met het voorbereiden van de gamma PNA-voorraden. Na het verkrijgen van HPLC-kwaliteit gezuiverde gamma PNA-strengen van een commerciële fabrikant, resuspend elke streng in gedeïmiseerd water tot 300 micromolarconcentraties. Bewaar de gamma-azi's tot min 20 graden Celsius gedurende maximaal enkele maanden.

Wanneer u klaar bent om zelfassemblage uit te voeren, bereidt u anneale batchmonsters voor in 75%DMSO, 75%DMF en 40%1, 4-dioxaan. Bereid eerst 20 micromolar-subvoorraden van elke oligomer voor door 0,67 microliter uit de hoofdvoorraad te drinken en gedeïmiseerd water toe te voegen voor een eindvolume van 10 microliters. Voeg een microliter van elke oligomer van de 20 micromolar substocks aan een 200 microliter PCR buis, die zal komen tot een totaal volume van negen microliters voor negen oligomers.

Voeg 30 microliter water zonder water of DMF toe met een extra microliter gedeïmiseerd water voor een eindvolume van 40 microliters. Voeg 16 microliter van 1, 4-dioxaan en breng het volume met gedeïsized water naar 40 microliter en voeg 16 microliter van 1, 4-dioxaan, toe en breng het volume op 40 microliter met gedeïioniseerd water. Anneal de monsters voor 22,5 uur in een thermische cycler koeling van 90 tot 20 graden Celsius.

Typisch, smeltende temperaturen verkregen voor twee oligomer en drie oligomer gamma PNA subsets liggen in het bereik van 40 tot 70 graden Celsius voor verschillende oplosmiddel voorwaarden. Programmeer de thermische cycler volgens manuscriptaanwijzingen. Zodra annealing is voltooid, kunnen monsters worden opgeslagen op vier graden Celsius gedurende 12 tot 24 uur voor karakterisering.

Maak een vochtigheidskamer van een lege pipettipsdoos door de doos te vullen met ongeveer vijf milliliter water. Bereid een 20-voudige verdunning van commercieel beschikbare 2%collodion in amylacetaat met isoamyas acetaat oplosmiddel om de nitrocelluloseoplossing te creëren. Gebruik een pincet om een coverslip in de nitrocellulose-oplossing te dompelen en laat het aan lucht-droog, dan maakt een stroomkamer uit een microscoopdia, twee dubbelzijdige bandstroken, en nitrocellulose-gecoate coverslip.

Bereid de biotine BSA-oplossing voor door een gewicht van één milligram biotine BSA en los deze op in één milliliter PBS. Pipette 15 microliters van de biotine BSA in het stroomkanaal onder een hoek en uitbroeden gedurende twee tot vier minuten bij kamertemperatuur in de bevochtigde kamer. Blaas 15 microliters van de wasbuffer, die bestaat uit een milligram BSA in één milliliter PBS, in het kanaal om overtollige biotine BSA weg te wassen en vervolgens het oppervlak te passeren door het stroomkanaal twee tot vier minuten in de bevochtigde kamer uit te broeden.

Meet 0,5 milligram streptavidin en een milligram BSA en los vervolgens beide op in één milliliter PBS. Pipette 15 microliters van de streptavidin oplossing in het stroomkanaal en plaats het in de bevochtigde kamer gedurende twee tot vier minuten en was het kanaal door 15 microliters van wasbuffer. Vervolgens stroom 15 microliters van de geannealed batch van gamma PNA oligomeren in de bevochtigde kamer, dan was de ongebonden nanostructuren door stromende 15 microliters van een millimolar Trolox in dezelfde oplosmiddel samenstelling als de nanostructuren.

Breng het stroomkanaal naar de schuifhouder en beeld het met een fluorescentie microscoop uitgerust met TIRF imaging, een 60X olie onderdompeling doelstelling, en een 1.5X vergrootglas. Scan het stroomkanaal bij 60 of 90X vergroting terwijl u het Cy3-kanaal bewaakt. Bereid 20 en 6% SDS-voorraden volgens manuscriptaanwijzingen en trek vervolgens de gamma PNA-oligomers door één microliter van elke 20 micromolar oligomer toe te voegen aan een 200 microliter PCR-buis.

Voeg 30 microliter watervrije DMSO en één microliter van 6% of 20% SDS toe aan de PCR-buizen voor een eindvolume van 40 microliters, wat resulteert in een uiteindelijke SDS-concentratie van respectievelijk 5,25 of 17,5 millimolar. Anneal de gamma-AZI's in de thermocycler zoals eerder beschreven. Karakteriseer gamma PNA nanostructuren in aanwezigheid van SDS met behulp van het TIRF- of TEM-protocol.

TIRF beeldvorming van gamma PNA oligomers geannealed in 75%DMSO toonde goed georganiseerde architecturen, terwijl annealing in 75%DMF resulteerde in spicule-vormige of naald-achtige nanostructuren. De 40%1, 4-dioxane aandoening produceerde een schaarse decoratie van filamenteuze nanostructuren. Bovendien toonden de monsters van gamma PNA nanobuisjes gevormd in 75%DMSO aan dat nanovezels bij hoge vergroting of nanoscopische resoluties tijdens TEM-beeldvorming bundelden.

Kwantitatieve analyse van de breedte van de nanostructuren toonde een mediane breedte van 16,3 nanometer met maximale waarden van meer dan 80 nanometer. Isosequential DNA oligomeren die aaneengesloten gamma-PNO's vervingen, vormden rechte filamenteuze structuren, terwijl vervanging van crossover gamma PNAs resulteert in stellate structuren. De nanostructuren die werden vervangen door aaneengesloten DNA-oligomeren hadden een gemiddelde breedte van ongeveer 19 nanometer.

Bij hoge SDS-concentraties nemen gamma PNA-nanovezels ook sterk genetwerkte morfologieën aan in vergelijking met de kritische micelleconcentraties wanneer ze worden bekeken met TIRF-beeldvorming. TEM imaging geeft aan dat gamma PNA assemblage in 5,25 millimolar SDS heeft de meest substantiële vermindering van de structurele bundeling. Bij een poging tot dit protocol, is het belangrijk om te onthouden om de oplosmiddel samenstellingen zoals vermeld te handhaven vanwege de neiging van de nanostructuren om te aggregaat.

Deze methoden moedigen beoefenaars aan om andere onontgonnen wegen van verschillende oplosmiddelsamenstellingen, oppervlakteactieve stoffen en andere PNA DNA-nanostructuren na te streven.