Name: Organik Çözücü Karışımlarında Gama Modifiye Peptit Nükleik Asitlerin Kompleks Nanoyapılara Kendi Kendine Montajı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Keşfedin, gama modifiye peptit nükleik asitlerin organik çözücü karışımlarında kendi kendine montajını ve kompleks nanoyapı oluşumunu. Bu yöntem, su bazlı ortamlardan organik çözücülere adaptasyon sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma kısmen National Science Foundation hibe 1739308, NSF CAREER hibe 1944130 ve Hava Kuvvetleri Ofis Bilim Araştırma hibe numarası FA9550-18-1-0199 tarafından desteklenmiştir. γPNA dizileri Trucode Gen Onarım, Inc Dr Tumul Srivastava cömert bir hediye vardı. Dr. Erik Winfree ve Dr. Rizal Hariadi'ye DNA Tasarım Araç Kutusu MATLAB kodu hakkındaki yararlı konuşmaları için teşekkür ederiz. Ayrıca Joseph Suhan, Mara Sullivan ve Biyolojik Görüntüleme Merkezi'ne TEM verilerinin toplanmasındaki yardımları için teşekkür ederiz.

1. γPNA sıra tasarımı
<ol><li>Caltech23'teki Winfree Lab tarafından geliştirilen DNA Tasarım Araç Kutusu22'yi dizileri tasarlamak için programlama komut dosyaları içeren klasöre indirin.</li>
	<li>Bu sıra lı tasarım klasöründe, ".m" dosya uzantısı ile uyumlu dördüncü nesil bir programlama dili açın ve daha önce indirilen "DNAdesign" klasörünü aşağıdaki komutu kullanarak yola ekleyin: >> addpath DNAdesign</li>
	<li>Daha sonra aşağıdaki komutu kullanarak "PNA3nanofiber.m" adlı aşağıdaki komut dosyasını çalıştırın (Bkz. Ek Şekil 1). >> PNA3nanofiber</li>
	<li>"thisSeqs" ve "thisScore" adlı değişkenler oluşturmak için bu komut dosyasını çalıştırın. "thisSeqs" değişkeni tasarlanmış oligomerlerin dizilerini içerir ve "thisScore" ceza puanıdır.</li>
	<li>En az puanı elde etmek için komut dosyasını birden çok kez çalıştırın. Tablo 1'de20 tür çalıştırmanın bir örneği gösterilmiştir.</li>
	<li>Belirtilen SST yapısal motifi için oluşturulan dizilerin her etki alanının istenilen Watson-Crick tamamlayıcılığını el ile onaylayın. 3 sarli sehpa nanofiber yapının dizi özellikleri Tablo 2'degösterilmiştir.</li>
	<li>Oluşturulan diziler için aşağıdakileri doğrulayın.<ol>
<li>Art arda dört C ve G tabanı kullanmaktan kaçının.</li>
		<li>Floresan mikroskobik çalışmaları sağlamak için floresan boya ve biotin molekülleri ile N-terminal fonksiyonelizasyonu için belirli dizileri manuel olarak seçin.</li>
		<li>Sahu ve ark.tarafından açıklandığı gibi tek iplikçikli oligomerlerde önceden organize edilmiş sarmal konformasyonu sağlamak için omurgaüzerinde en az 3 mini PEG gama modifikasyonu ekleyin. 21.000
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. γPNA stok iplikçiklerinin hazırlanması
<ol><li>Ticari bir üreticiden yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) saflaştırma ile 50 nmol ölçekli sentezde belirtilen dizilerin γPNA bileşen iplikçiklerini elde edin.</li>
	<li>Deiyonize sudaki her bir ipliği 300 μM konsantrasyona geri alın. Yeniden askıda kalan iplikçikleri -20 °C'lik dondurucuda deney için gerekli olana kadar birkaç aya kadar saklayın.</li>
</ol>3. ΓPNA oligomer alt kümelerinin erime eğrisi çalışmaları
<ol><li>1x fosfat tamponlu salin (PBS) veya Dimethylformamid (DMF) veya Dimetil sülfoksit (DMSO) gibi tercih edilen polar organik çözücügibi sulu tamponlarda erime eğrisi çalışması yaparak tamamlayıcı 2-oligomer ve 3-oligomer alt kümelerinin farklı kombinasyonları için erime sıcaklık aralıkları elde edin (Şekil 2'yebakınız). NOT: DMF'nin >%50'deki Termal erime eğrileri üst taban çizgisini kaybetmeye başlar ve kısmen deneyler için gerekli dalga boyunda DMF'nin yüksek emilmesi nedeniyle ciddi bozukluklar gösterir. Bu literatürde önemli bir olgudur24. Ancak bu çözücü koşullarda iplikçik konsantrasyonları başına 5 μM'lik erime eğrileri elde etmek mümkündür.<ol>
<li>Aliquot 16.7 μL her oligomer 300 μM stok ve 1x PBS veya 100% (v / v) DMSO veya% 100 (v / v) DMF etkili oligomer başına 5 μM son konsantrasyon elde 1000 μL için son hacmi olun. Bu oligomer alt set karışımını 1 cm optik yola, kuvars cuvette'ye aktarın.</li>
		<li>Programlanabilir sıcaklık bloğu ile donatılmış bir spektrofotometre değişken sıcaklık UV-Vis deneyleri gerçekleştirin.</li>
		<li>0,5\u20121 °C/dk hızında hem soğutma (annealing) hem de ısıtma (erime) döngüleri için 15\u201290 °C sıcaklık aralığındaki erime eğrileri için veri noktaları toplayın. Numuneleri soğumadan önce 90 °C'de 10 dk ve ısıtmadan önce 15 °C'de saklayın. Isıtma eğrisinin ilk türevinin zirvesinden erime sıcaklığını (Tm)belirleyin.</li>
		<li>2-oligomer alt kümelerinin erime sıcaklığı aralıklarının tüm çözücü durumlarda 35 °C'nin üzerinde olduğunu doğrulayın. Ayrıca, eşdeğer 2-oligomer alt kümesine ek bir iplikçik içeren karşılık gelen 3-oligomer alt kümelerinin, artan işbirliği nedeniyle Tm'de önemli bir artış gösterdiğini doğrulayın. NOT: Bu, birden fazla oligomerden oluşan tek bir potun otomatik montajının makul termal stabilite ile istenilen nanoyapıya otomatik olarak katlanabilir olduğunu doğrular.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Birden fazla farklı γPNA oligomerleri için kendi kendine montaj protokolü
NOT: γPNA nanoyapılar için kendi kendine montajlı termal rampa protokolü hazırlamak için, yavaş rampa tavlama arzu edilir.
<ol><li>Üretilen oligomer dizileri söz konusu olduğunda, numuneleri 90 ila 20 °C arasında soğutulan bir termal döngüde 22,5 saat bekletin. Tipik olarak, 2-oligomer ve 3-oligomer γPNA alt kümeleri için elde edilen erime sıcaklığı farklı çözücü koşulları için 40\u201270 °C aralıklarında yer alır.</li>
	<li>Termal döngüciyi aşağıdaki gibi programlayınız: 90 °C'de 5 dakika bekletin, rampa 90'dan 70 °C'ye sabit bir hızda 0,1 °C/dk, rampa 0,1 °C/3 min, rampa 40'tan 20 °C'ye kadar 0,1 °C/dk'da tutun ve 4 C 'de tutun (Tablo 3'ebakınız). Numuneler karakterizasyondan önce 12\u201224 saat boyunca 4 °C'de saklanabilir. NOT: Nanofiber sistemimizin 2 ve 3- oligomer alt kümeleri 1x PBS'de oluşabilirken, tam mikron ölçekli nanofiberler 1x PBS'de toplanır. Bu nedenle, solvent koşulları, oluşturulan yapının ölçeğine ve büyüklüğüne ve gama modifikasyonlarının türüne ve yoğunluğuna göre optimize edilmelidir.</li>
	<li>Mikron ölçekli uzun 3 sarnıç nanofiberler için, %75 DMSO'da anneal toplu numuneler hazırlayın: H2O (v/v), %75 DMF: H2O (v/v), %40 1,4-Dioksan: H2O (v/v) solvent optimizasyonu çalışmalarına dayalı15.</li>
	<li>Anneal toplu işlerini aşağıdaki gibi hazırlayın (bkz. Tablo 4). İlk olarak, ana stoktan 0,67 μL alarak ve deiyonize su kullanarak hacmi 10 μl'a çıkararak her bir oligomer için 300 μM ana stoktan 20 μM konsantrasyonlarda 10 μL alt stok hazırlayın.</li>
	<li>Aliquot 1 μL her oligomer için 20 μM alt stokları ve 200 μL PCR tüp ekleyin. Bu 9 oligomerler için toplam 9 μL hacmi ni hesaplar.</li>
	<li>%75 DMSO için 30 μL susuz DMSO/DMF ve %75 DMF olguları ile ilave 1 μL deiyonize su ekleyerek her oligomerile 500 nM son konsantrasyonlarda 40 μL'lik son bir hacim yapın. 1,4-Dioksan 16 μL ekleyin ve %40 Dioxane çözücü durumu için 40 μL'ye deiyonize su ile hacim yapın.</li>
	<li>4.2 adımda belirtilen protokolü kullanarak anneal toplu işlerini termal döngücöre ve anneal'a yükleyin.</li>
</ol>5. Toplam iç yansıma floresansı (TIRF) mikroskopi görüntüleme
<ol><li>Boş bir pipet uçları kutusundan bir nem haznesi hazırlayın. Aşağıdaki gibi açıklanan numune akış kanallarının kurumasını önlemek için kutuyu yaklaşık 5 mL su ile doldurun (Bkz. Şekil 3).</li>
	<li>Bir mikroskop slayt, 2 çift taraflı bant şeritler ve nitroselüloz kaplı coverslip ile akış odası hazırlayın. Coverslip'i nitroselülozla kaplamak için, coverslip'i amil asetat ve hava kurusunda %0,1 kolokit içeren bir kabın içine batırın.<ol>
<li>Azotluoz çözeltisini, izoamil asetat çözücü ile amil asetatta %2'lik bir seyreltme yaparak hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Biotinylated sığır serum albumin (Biotin-BSA) çözeltisi 1 mg Biotin-BSA tartarak ve 1 mL 1x PBS eriterek hazırlayın. Akış 15 μL 1 mg/mL Biotin-BSA 1x PBS tampon akış bir açıda akış kanalı yerleştirerek. Nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 2-4 dakika akış kanalı kuluçka.</li>
	<li>1 mL 1x PBS BSA 1 mg eriterek yıkama tampon hazırlayın. Fazla Biotin-BSA'yı yıkama tamponunun 15 μL'lik kalıbını çalarak yıkayın. Yüzeyi pasifleştirmek için, nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 2-4 dakika boyunca akış kanalını kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Streptavidin çözeltisini 0.5 mg streptavidin ve 1 mg BSA ölçerek hazırlayın ve 1x PBS'nin 1 mL'sini kullanarak eritin. 1 mg/mL BSA içeren 1x PBS'de 0.5 mg/mL streptavidin akışı. Nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 2-4 dakika akış kanalı kuluçka. Akış 15 l yıkama tampon uzak bağlı olmayan Streptavidin yıkamak için.</li>
	<li>%75 DMSO, %75 DMF veya %40 1,4-Dioksan durumunda iplikçik başına 500 nM konsantrasyonda daha önce anneleştirilmiş γPNA oligomerlerinin 15 μL'si akış. Nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 2-4 dakika boyunca akış kanalını kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>DMSO'daki 10 mM'lik Trolox stoğundan 10 kat seyrelterek tercih edilen çözücü koşullarında 1 mM Trolox hazırlayın (2.5 mg Trolox ölçün ve DMSO'nun 1 mL'sinde çözünün). Akış kanalındaki bağlanmamış nanoyapıları 1m Trolox'un 15 μL'si ile nanoyapılarla aynı çözücü bileşimine sahip olarak yıkayın. NOT: Akış kanalındaki >%50 DMSO içeriği, genellikle coverslip-su TIRF açıları için kalibre edilen TIRF sırasında solvent durumunun farklı kırılma indeksi nedeniyle küçük sinyal bozukluklarına neden olur. 10 mM Trolox 10 kat deiyonize su kullanılarak seyreltilerek yapılan 1 mM Trolox ile yıkanarak düzeltilebilir. Bu teknik daha net görüntüler sağlar, ancak akış kanalında iki fazlı mikro kabarcıklar ürettiği için oluşumun meydana gelip gelmediğini değerlendirmek için yararlıdır. Sonuç olarak, nanoyapılar Şekil 4D'degösterildiği gibi iki fazlı arabiriminde görülebilir.</li>
	<li>60x yağ daldırma hedefi ve 1,5 x büyüteç kullanarak TIRF görüntüleme ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak akış kanalını slayt tutucuya ve görüntüye aktarın. Cy3 kanalını izleyerek akış kanalını 60x veya 90x büyütme noktasında tizleyin (Bkz. Şekil 4).</li>
</ol>6. İletim elektron mikroskobu (TEM) görüntüleme
<ol><li>% 1 sulu uranyl asetat leke çözeltisi hazırlamak için distile su 50 mL uranyl asetat 0,5 g tartın. Şırıngaya bağlı 0,2 μm filtre kullanarak %1 sulu uranyal asetat leke çözeltisini filtreleyin. NOT: Alternatif olarak, %2 sulu uranyal asetat ticari bir üreticiden satın alınabilir.</li>
	<li>300 örgü boyutunda ticari olarak kullanılabilir formvar destek katmanı kaplı Bakır ızgaraları satın alın. NOT: Formvar destek tabakasının DMSO gibi çözücüler tarafından 2 dk'dan fazla çözünebileceğini unutmayın. Daha uzun numune kuluçka için, bakır ızgaralarda silikon monoksit ile stabilize edilmiş ticari olarak mevcut formvar, ızgaranın karbon kaplı ızgaralardan daha hidrofilik olmasını sağlayan ve Şekil 5C'degösterildiği gibi güçlü numune koşullarına ve elektron ışınına dayanabilecek şekilde mevcuttur.</li>
	<li>Pipet 4 μL numune 15 s için ızgara üzerine. Filtre kağıdını ızgarayla temas ederek numuneyi yanlardan çıkarmak için bir filtre kağıdı kullanın.</li>
	<li>Hemen 5 s için ızgara üzerine leke çözeltisi 4 μL ekleyin.</li>
	<li>Daha önce olduğu gibi leke kapalı Wick ve ızgara kuru olduğundan emin olmak için 1\u20122 dk için ızgara karşı filtre kağıdı tutun. Örnekler genellikle 1\u20122 h içinde boyandıktan sonra görüntülenmelidir. Alternatif olarak, Şebekenin tamamen kuruolması sağlanırsa, ızgaralar görüntülemeden önce 3 gün kadar TEM ızgara depolama kutusunda saklanabilir.</li>
	<li>10 K ile 150K arasında değişen büyütme ile 80 kV'de işletilen bir iletim elektron mikroskobu kullanarak ızgarayı TEM numune tutucuya ve görüntüye aktarın (Bkz. Şekil 5).</li>
</ol>7. ΓPNA-DNA melezleri için DNA ile selektif replasmana dayalı farklı morfolojiler
<ol><li>Standart tuzsuzlama kullanarak 25 nmol ölçekte sentezlenen ticari oligonükleotid üreticilerinden belirtilen dizilerin DNA oligomerlerini (Bkz. Tablo 5'e bakınız). 20 μM stok konsantrasyonlarında RNase içermeyen deiyonize su kullanarak bu DNA dizilerini yeniden askıya alın.</li>
	<li>DNA ile bitişik γPNA iplikçik değişimleri için, D3, D5 ve D9 dizileri p3, p5 ve p9 iplikçiklerinin yerini alabilir. Benzer şekilde, DNA ile çapraz γPNA iplikçik değişimleri için, D1, D4 ve D7 dizileri p1, p4 ve p7 iplikçiklerinin yerini alabilir.</li>
	<li>Aliquot 1 μL her γPNA veya DNA oligomer için 20 μM alt stokları ve adım 2.7 gibi bir 200 μL PCR tüp ekleyin. Son hacmi 40 μL'ye çıkarmak için 30 μL susuz DMSO ve 1 μL RNase içermeyen deiyonize su ekleyin (bkz. Tablo 6).</li>
	<li>4.2 adımda belirtilen protokolü kullanarak anneal toplu işlerini termal döngücöre ve anneal'a yükleyin.</li>
	<li>Bölüm 5'teki adımları izleyerek veya bölüm 6'da belirtilen TEM görüntüleme protokolünü kullanarak TIRF protokolünü kullanarak γPNA-DNA hibrid nanoyapıları karakterize edin (Bkz. Şekil 6).</li>
</ol>8. SDS değişen konsantrasyonlarda γPNA nanofibers için farklı morfolojileri
<ol><li>20 mg SDS ölçerek ve 100 μL deiyonize suyla eriterek %20 (wt/v) SDS ana stokhazırlayın.</li>
	<li>%20 SDS stoğundan 3 μL'lik bir işlem yaparak ve deiyonize su kullanarak hacmi 10°L'ye çıkararak %6 (wt/v) SDS alt stoku hazırlayın.</li>
	<li>5.25 mM ve 17.5 mM SDS son konsantrasyonlarda γPNA oligomerleri aşağıdaki gibidir. Aliquot 1 μL her γPNA oligomer için 20 μM alt stokları ve adım 2.7 gibi bir 200 μL PCR tüp ekleyin. Sırasıyla 5,25 mM ve 17,5 mM'lik SDS son konsantrasyonlarını elde etmek için son hacmi 40 μL'ye çıkarmak için 30°L susuz DMSO ve %6 ve %20 SDS ekleyin (bkz. Tablo 7).</li>
	<li>4.2 adımda belirtilen protokolü kullanarak, farklı SDS konsantrasyonlarından oluşan anneal toplu işlerini termal döngüce ve anneal'a yükleyin.</li>
	<li>Bölüm 5'teki adımları izleyerek VEYA bölüm 6'da belirtilen TEM görüntüleme protokolünü kullanarak TIRF protokolünü kullanarak SDS varlığında γPNA nanoyapılarını karakterize edin (Bkz. Şekil 7).</li>
</ol>

<ol><li>Fu, T. J., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-crossover+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA double-crossover molecules.</a> Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).</li>
<li>Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+self-assembly+of+two-dimensional+DNA+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals.</a> Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).</li>
<li>Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+1.7-kilobase+single-stranded+DNA+that+folds+into+a+nanoscale+octahedron%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron.</a> Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).</li>
<li>Rothemund, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+self-assembly+of+DNA+into+symmetric+supramolecular+polyhedra%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra.</a> Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).</li>
<li>Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+DNA+into+nanoscale+three-dimensional+shapes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes.</a> Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).</li>
<li>Andersen, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+a+nanoscale+DNA+box+with+a+controllable+lid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid.</a> Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).</li>
<li>Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+DNA+into+twisted+and+curved+nanoscale+shapes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes.</a> Science. 325 (5941), 725-730 (2009).</li>
<li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+origami+with+complex+curvatures+in+three-dimensional+space%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space.</a> Science. 332 (6024), 342-346 (2011).</li>
<li>Liu, Y., Kumar, S., Taylor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mix-and-match+nanobiosensor+design%3A+Logical+and+spa421+tial+programming+of+biosensors+using+self-assembled+DNA+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs+Nanomedicne+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Mix-and-match nanobiosensor design: Logical and spa421 tial programming of biosensors using self-assembled DNA nanostructures.</a> WIREs Nanomedicne Nanobiotechnology. 10, 1518(2018).</li>
<li>Chworos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+programmable+jigsaw+puzzles+with+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Building programmable jigsaw puzzles with RNA.</a> Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).</li>
<li>Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+intracellular+reactions+with+rationally+designed+RNA+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies.</a> Science. 333 (6041), 470-474 (2011).</li>
<li>Wang, X., Lim, H. J., Son, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+denaturation+and+renaturation+of+DNA+for+DNA+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+health+and+toxicology%22%5BJournal%5D)">Characterization of denaturation and renaturation of DNA for DNA hybridization.</a> Environmental health and toxicology. 29, 2014007(2014).</li>
<li>Bonner, G., Klibanov, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+stability+of+DNA+in+nonaqueous+solvents%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Structural stability of DNA in nonaqueous solvents.</a> Biotechnology and Bioengineering. 68, 339(2000).</li>
<li>Kumar, S., Pearse, A., Liu, Y., Taylor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+self-assembly+of+gamma-modified+peptide+nucleic+acids+in+organic+solvent+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Modular self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids in organic solvent mixtures.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-10 (2020).</li>
<li>Barluenga, S., Winssinger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PNA+as+a+biosupramolecular+tag+for+programmable+assemblies+and+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+chemical+research%22%5BJournal%5D)">PNA as a biosupramolecular tag for programmable assemblies and reactions.</a> Accounts of chemical research. 48, 1319-1331 (2015).</li>
<li>Berger, O., Gazit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+self-assembly+using+peptide+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">Molecular self-assembly using peptide nucleic acids.</a> Peptide Science. 108, 22930(2017).</li>
<li>Rothemund, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+characterization+of+programmable+DNA+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Design and characterization of programmable DNA nanotubes.</a> Journal of American Chemical Society. 126, 16344-16352 (2004).</li>
<li>Yin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+DNA+tube+circumferences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Programming DNA tube circumferences.</a> Science. 321, 824-826 (2008).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+DNA+rings+from+scaffold-free+DNA+tiles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of DNA rings from scaffold-free DNA tiles.</a> Nano Letters. 13, 1862-1866 (2013).</li>
<li>Sahu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+conformationally+preorganized%2C+%28R%29-diethylene+glycol-containing+-peptide+nucleic+acids+with+superior+hybridization+properties+and+water+solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Organic+Chemisty%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of conformationally preorganized, (R)-diethylene glycol-containing -peptide nucleic acids with superior hybridization properties and water solubility.</a> Journal of Organic Chemisty. 76, 5614-5627 (2011).</li>
<li>DNA Sequence Design Tools. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.dna.caltech.edu/DNA_Sequence_Design_Tools/">http://www.dna.caltech.edu/DNA_Sequence_Design_Tools/</a> (2020).</li>
<li>Dirks, R. M., Lin, M., Winfree, E., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradigms+for+computational+nucleic+acid+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Paradigms for computational nucleic acid design.</a> Nucleic Acids Research. 32 (4), 1392-1403 (2004).</li>
<li>Sen, A., Nielsen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+stability+of+peptide+nucleic+acid+duplexes+in+the+presence+of+organic+solvents%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">On the stability of peptide nucleic acid duplexes in the presence of organic solvents.</a> Nucleic Acids Research. 35, 3367-3374 (2007).</li>
<li>Yang, Z., Williams, D., Russell, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+protein-containing+polymers+in+organic+solvents%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Synthesis of protein-containing polymers in organic solvents.</a> Biotechnology and Bioengineering. 45, 10-17 (1995).</li>
<li>Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+peptide+synthesis%3A+from+standard+procedures+to+the+synthesis+of+difficult+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences.</a> Nature Protocols. 2, 3247(2007).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.

Bu makale, mevcut nükleik asit nanoteknoloji protokollerinin organik çözücü karışımlarına uyarlanması ve iyileştirilmesi üzerine odaklanılmıştır. Burada açıklanan yöntemler, belirli polar aprotik organik çözücülerin tanımlanmış deneysel alanı içinde modifikasyonlar ve sorun giderme üzerine odaklanmaktadır. Bu alana adapte olacak diğer çekirdekik asit nanoteknoloji protokolleri için henüz keşfedilmemiş bir potansiyel vardır. Bu genellikle benzer organik çözücüler25,26</...

Çok sayıda karmaşık nanoyapıların başarılı yapısı1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12doğal olarak oluşan nükleik asitler kullanılarak yapılan sulu veya önemli ölçüde sulu medya 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 ve RNA11,12 önceki çalışmalarda gösterilmiştir. Ancak, doğal olarak oluşan nükleik asitler dupleks sarmal konformasyonel değişikliklere uğrar veya organik çözücü karışımlarında termal stabiliteleri azaltmıştır13,14.
Daha önce laboratuvarımız gama-peptit nükleik asitler (γPNA)15 (Şekil 1A)adı verilen gama pozisyonu modifiye edilmiş sentetik nükleik asit taklitleri kullanarak 3 sarlisli nanofiberlerin yapımına yönelik bir yöntem bildirmiştir. Böyle bir gelişme ve sentetik nükleik asit taklit PNA potansiyel uygulamaları için ihtiyaç alan16,17içinde ele alınmıştır. Biz göstermiştir ki, DNA nanoyapılar için sunulan tek iplikli karo (SST) stratejisinin bir adaptasyon yoluyla18,19,20, 9 sırayla farklı γPNA oligomerler DMSO ve DMF gibi belirli polar aprotik organik çözücü karışımları 3-sarmalı nanofiberler oluşturmak için tasarlanmış olabilir. ΓPNA oligarmerleri ticari olarak (R)-dietilen glikol (mini-PEG) modifikasyonları ile sipariş edildi üç γ pozisyonlarında (1, 4 ve 8 baz-pozisyonlar) her 12-baz oligomer Boyunca Sahu ve arktarafından yayınlanan yöntemlere dayalı . 21 Bu gama modifikasyonları, γPNA'nın değiştirilmemiş PNA'ya göre daha yüksek bağlayıcı yakınlığı ve termal stabilitesi ile ilişkili sarmal ön organizasyona neden olur.
Bu makale, solvent çözeltisi ve DNA ile ikame γPNA tabanlı nanoyapıların oluşumu üzerindeki etkilerini araştırmak bildirilen çalışmamızın biruyarlamasıdır 15. Bu makalenin amacı, γPNA nanofiber'in kendi kendine montajı ve karakterizasyonu için geliştirilen solvent uyarlanmış yöntemler için ayrıntılı protokollerin yanı sıra tasarımın ayrıntılı açıklamalarını sağlamaktır. Böylece, ilk modüler SST stratejisi, sentetik nükleik asit pna taklit kullanarak nanoyapı tasarımı için genel bir platform tanıtmak.
PNA dupleksleri için sarmal adım 10,5 baz başına bir dönüş geçmesi DNA dupleksler ile karşılaştırıldığında dönüş başına 18 baz olduğu bildirilmiştir(Şekil 1B). Bu nedenle, gösterilen γPNA SST'lerin etki alanı uzunluğu, üç üçgen dizili helikler arasındaki etkileşimi etkinleştirmek için tam dönüşün üçte birini veya 120° döndürmeyi karşılamak üzere 6 tabanda ayarlanmıştır. Ayrıca, önceki SST motiflerinin aksine, her SST sadece 2 etki alanı içerir ve üç sarlis demeti oluşturmak için sarar 1 boyutlu şerit benzeri bir yapı oluşturur(Şekil 1C). Her 12-baz γPNA oligomer genel SST motifi arasında mini PEG gruplarının düzgün aralıklı dağılımını sağlamak için 1, 4 ve 8 pozisyonlarda gama modifiye edilir. Ayrıca, motif içinde, oligomerler iki türü vardır: tek bir sarlis ve sarlak yayılan "crossover" iplikçikleri üzerinde var "bitişik" iplikçikler(Şekil 1D). Buna ek olarak, oligomerler P8 ve P6 floresan Cy3 ile etiketlenir (yeşil yıldız) ve biotin (sarı oval), sırasıyla(Şekil 1D),floresan mikroskop ile yapı oluşumunun tespitini sağlamak için. SST motifi, her bir etki alanının komşu bir oligomer üzerindeki ilgili etki alanına programlı tamamlayıcılığı yoluyla 3 sarli salık nanofiberoluşumunu mümkün kılmak için toplam 9 oligomerden oluşur(Şekil 1E).

<table><tbody><tr><td>&gama; PNA iplikçikleri / oligomerleri</td><td>Trucode Gen Onarım A.Ş.</td><td></td><td>Bölüm 2.1</td></tr><tr><td>UV-Vis Spektrofotometre</td><td>Agilent</td><td>Varian Cary 300</td><td>Bölüm 3.1.2</td></tr><tr><td>Kuvars küvetler</td><td>Starna</td><td>29-Q-10</td><td>Bölüm 3.1.1</td></tr><tr><td>Termal döngüleyici</td><td>Bio Rad</td><td>C1000 touch</td><td>Bölüm 4.1</td></tr><tr><td>0.2 mL PCR tüpleri</td><td>VWR</td><td>53509-304</td><td>Bölüm 4.5</td></tr><tr><td>Susuz DMF</td><td>VWR</td><td>EM-DX1727-6</td><td>Bölüm 4.6</td></tr><tr><td>Susuz DMSO</td><td>VWR</td><td>EM-MX1457-6</td><td>Bölüm 4.6</td></tr><tr><td>Susuz 1,4-Dioksan</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC615121000</td><td>Bölüm 4.6</td></tr><tr><td>10X Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td><td>VWR</td><td>75800-994</td><td>Bölüm 3.1.1</td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları</td><td>VWR</td><td>89085-399</td><td>Bölüm 5.2</td></tr><tr><td>Cam kapak fişleri</td><td>VWR</td><td>48382-126</td><td>Bölüm 5.2</td></tr><tr><td>Amil asetat</td><td>sigma-aldrich</td><td>9817'de</td> %2 kolodion <td>Bölüm 5.2</td></tr><tr><td>İzoamil Asetat</td><td>VWR</td><td>200001-180</td><td>Bölüm 5.2</td></tr><tr><td>Biyotinile Sığır Serum Albümini (Biotin-BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8549</td><td>Bölüm 5.3</td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td>Bölüm 5.4</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>189730</td><td>Bölüm 5.5</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813</td><td>Bölüm 5.7</td></tr><tr><td>Toplam İç Yansıma Floresan mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>Nikon Ti2-E</td><td>Bölüm 5.8</td></tr><tr><td>Transmisyon Elektron Mikroskobu</td><td>Joel</td><td>JEM 1011</td><td>Bölüm 6.6</td></tr><tr><td>Cımbız</td><td>Dumont</td><td>0203-N5AC-PO</td><td>Bölüm 6.3</td></tr><tr><td>Uranil Asetat Elektronu</td><td> Mikroskopi Bilimleri</td><td>22400</td><td>Bölüm 6.1</td></tr><tr><td>Formvar, 300 ağ, Bakır ızgaralar</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>1701-F</td><td>Bölüm 6.2</td></tr><tr><td>Formvar-Silikon monoksit Tip A, 300 ağ, Bakır ızgaralar</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>1829</td><td>Bölüm 6.2</td></tr><tr><td>DNA oligomerleri/iplikleri</td><td>IDT</td><td></td><td>Bölüm 7.1</td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)</td><td>VWR</td><td>97064-860</td><td>Bölüm 8.1</td></tr></tbody></table>

organik Çözücü karışımlarında gama modifiye peptit nükleik asitlerin kompleks nanoyapılara kendi kendine montajı

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

DNA ve RNA nanoteknolojisindeki mevcut stratejiler, sulu veya önemli ölçüde sulu ortamda çeşitli nükleik asit nanoyapıların kendi kendine biraraya ılmasını sağlar. Bu makalede, organik çözücü karışımlarında nanofiber mimarilerin, benzersiz adreslenebilir, tek iplikli, gama modifiye peptid nükleik asit (γPNA) karolarının kendi kendine montajı yoluyla inşa edilmesini sağlayan ayrıntılı protokolleri açıklıyoruz. Her tek iplikli döşeme (SST), her biri 6 bazdan oluşan iki modüler etki alanından oluşan 12 bazlı bir γPNA oligomerdir. Her etki alanı, uzunlukta mikronlara büyüyebilen nanofiberler oluşturmak için programlanmış tamamlayıcılık kullanarak komşu ipliklerde bulunan karşılıklı olarak ücretsiz bir etki alanına bağlanabilir. SST motifi, 3 sarli salik nanofiberlerin oluşumunu sağlamak için toplam 9 oligomerden yapılmıştır. Çap-monodisperse yapılar oluşturan benzer DNA nanoyapılarının aksine, bu γPNA sistemleri organik çözücü karışımlarında kendi kendine montaj sırasında genişlikleri boyunca biraraya gelen nanolifler oluştururlar. Bu nedenle burada açıklanan kendi kendine montaj protokolleri de geleneksel bir yüzey aktif içerir, Sodyum Dodecyl Sülfat (SDS), donanmış etkilerini azaltmak için.

Yukarıdaki bölümlerde tartışılan protokoller, dna nanofiberlerinden uyarlanmış bir SST motifinin, birden fazla γPNA oligomerkullanılarak kendi kendine biraraya getirilmiş nanofiber yapıların sağlam nesli için tasarlanmis tasarımını açıklayabilmiştir. Bu bölümde, açıklanan protokollerin başarılı bir şekilde yeniden canlanmasından elde edilen verilerin yorumlanması açıklanmaktadır.
u DMSO'da bulunan γPNA oligomerörneklerinin TIRF görüntülemesi için bölüm 5'te açıklanan protokolü takiben: H2...

Bu makalede, organik çözücü karışımlarında gama modifiye peptit nükleik asit oligomerlerinden nanoyapıların tasarımı ve kendi kendine montajı için protokoller sağlandığı belirtilmiştir.

Organik Çözücü Karışımlarında Gama Modifiye Peptit Nükleik Asitlerin Kompleks Nanoyapılara Kendi Kendine Montajı

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

Bu yeni protokol, sentetik nükleik asit taklit gama PNA'nın belirli organik çözücü karışımlarında nanoyapılar oluşturmak için birden fazla farklı dizinin kullanımını açıklamaktadır. Burada açıklanan tahliller, mevcut nükleik asit nanoteknoloji protokollerinin çok az veya hiç protokol yayınlanmamış organik çözücülere uyarlanma gereğini göstermektedir. Bu tekniğin yeni uygulayıcıları, nanomalzeme PNA'nın toplama eğilimi nedeniyle sulu-zengin ortamlar için geliştirilen mevcut protokolleri organik çözücü açısından zengin ortamlara uyarlamakta zorlanabilirler.Gama PNA stokları hazırlayarak başlayın. Ticari bir üreticiden HPLC sınıfı saflaştırılmış gama PNA iplikçikleri aldıktan sonra, deiyonize sudaki her bir ipliği 300 mikromolar konsantrasyona geri alın. Gama PNA'larını eksi 20 derecede birkaç aya kadar saklayın.Kendi kendine montaj yapmaya hazır olduğunuzda, %75 DMSO, %75 DMF ve %40 1, 4-dioksan toplu iş örnekleri hazırlayın. İlk olarak, ana stoktan 0,67 mikrolitre aliquoting ve 10 mikrolitre son bir hacim için deiyonize su ekleyerek her oligomer 20 mikromolar alt stokları hazırlayın. 20 mikromolar alt hisse senetlerinden her bir oligomerin bir mikrolitresini 200 mikrolitrelik PCR tü

self-assembly-gamma-modified-peptide-nucleic-acids-into-complex

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Peptoids çoğu laboratuarlarda kolayca sentezlenebilir sağlayan temel ekipman ve piyasada bulunan reaktifler içeren basit ve genel bir manuel peptoid sentez yöntemi özetlenmiştir. Amfifilik peptoid 36mer sentezi, saflaştırma ve karakterizasyonu yanı sıra, yüksek sıralı nanosheets olarak kendi montaj olarak açıklanmıştır.

Yüksek Sıralı Nanosheets Peptoid Polimerler ve Self-Meclis Solid-faz Submonomer Sentezi

Bu çalışma, kendi kendine düzeneğinin kendiliğinden işlemi ile yüksek sıralı peptit bazlı yapıların oluşumunu tarif eder. Yöntem, ticari olarak temin edilebilen ve bilinen peptidler laboratuar ekipmanları kullanır. Bu teknik, peptidlerin büyük bir çeşitlilik uygulanabilir ve yeni peptid-bazlı düzeneklerinin keşfine yol açabilir.

Kısa Peptidlerinin Self-meclisi tarafından Sıralı Biyomoleküler Yapıların Oluşumu

Tek veya birden fazla hücre dışı matris proteinleri nanolifler ve karmaşık oluşturulan nano elde etmek için bir yöntem tarif edilmektedir. Bu yöntem, doku mühendisliği ve biyoteknoloji uygulamalarında çeşitli kullanım için ayarlanabilir kompozisyon ve mimarisi ile serbest duran protein bazlı malzemeleri oluşturmak için protein-yüzey etkileşimlerini kullanır.

ECM Protein Nanofiberler ve Nanoyapılar İşlenmiş Kullanılarak Yüzey başlatılan Meclisi

Şablon ücretsiz zeminler üzerine makroskobik nanoparçacık-ligand tek katmanlı filmler işlevselleştirmek ve kendine monte Basit, sağlam ve ölçeklenebilir tekniği bu protokol açıklanmıştır.

Şablon-ücretsiz Substratlarm üzerine makroskobik Nanoparçacık-ligand tabakalı Filmler işlevselleştirmek ve Öz-montajı A Tekniği

Polyamine tabanlı peptid amphiphiles (PPAs) sentezi gruplar bu reaktif işlevler maske korumanın akılcı kullanımı gerektiren birden çok Amin nitrogens, varlığı nedeniyle önemli bir sorundur. Bu yazıda, bu yeni sınıf kendi kendine montaj moleküllerin hazırlanması için facile yöntemi açıklanmaktadır.

Polyamine tabanlı peptid Amphiphiles (PPAs) ve ilgili Biyomalzeme kendi kendine montaj sentezi için facile iletişim kuralı

1,2-dithiolane sentezi için bir protokol peptid ve peptid kendinden montajlı kaynaklanan supramolecular yapıları karakterizasyonu değiştiren.

1,2-Dithiolane malzemelerin ve kendi kendine montaj peptidler değiştirilme tarihi

Bu iletişim kuralı ile lizin-tirozin-fenilalanin (KYF) tripeptit stabilize bir oleik acids-platinum(II) eşlenik nanoemulsion sentezlemek için verimli bir yöntem açıklanır. Nanoemulsion formlar KYF ve eşlenik olmasını, kendinden montajlı yolu ile hafif sentetik koşullar altında.

Tripeptit stabilize Nanoemulsion oleik asit

Bir protokol bilgi kodlanmış peptoid oligomers sentezi için ve dinamik kovalent reaktan çiftleri ve Lewis asidik nadir toprak olarak aminler ve aldehitler kullanarak moleküler merdivenler içine bu peptoidlerin dizi yönelimli kendini montaj için sunulmaktadır metal çok rol reaktifler olarak triflates.

Bilgi taşıyan Peptoidlerin sentezi ve Dizi yönelimli Dinamik Kovalent Öz-montaj

Organik ve sulu çözücülerin arayüzünde, özel ampifilik elastin benzeri proteinler veziküller, lifler ve çevresel parametrelertarafından tetiklenen koaksivatlar gibi karmaşık supramoleküler yapılarda bir araya getirilir. Açıklanan montaj protokolleri, çeşitli kargoların kapsüllemesini sağlayan, tunable özelliklere sahip Protein Membran Tabanlı Bölmeler (PMBCs) verir.

Elastin benzeri Proteinlerin tanımlanmış Supramoleküler Yapılara Yönlendirilmiş Montajı ve Tüp Bebek Tespülasyonu

Bu protokol, peptitlerin hidrojellere kendi kendine montajını tetiklemek için çevresel koşulları kullanan üç hızlı ve basit hazırlama yöntemi sunar. Ek olarak, peptit hidrojellerinin karakterizasyonu açıklanmış olup, bu basit koşullar altında mekanik olarak kararlı peptit hidrojellerin oluşturulabileceğini göstermektedir.

Mekanik Olarak Kararlı Kendinden Montajlı Peptitler Hidrojellerin Hazırlanması

Keşfedin, gama modifiye peptit nükleik asitlerin organik çözücü karışımlarında kendi kendine montajını ve kompleks nanoyapı oluşumunu. Bu yöntem, su bazlı ortamlardan organik çözücülere adaptasyon sağlar.

Organik Çözücü Karışımlarında Gama Modifiye Peptit Nükleik Asitlerin Kompleks Nanoyapılara Kendi Kendine Montajı

Daha fazla video keşfet