ヒト腎臓組織における局所転写論を明らかにするレーザー微小解剖の応用

レーザーマイクロダイセクションは、腎臓組織サンプル内の空間的に定義された領域のトランスクリプトーム分析を可能にします。これにより、疾患による変化が起こった後でも、関心のある構造を特定するユニークな機会が得られます。この方法論の主な利点は、シングルセルRNAシーケンシングなどの他のオミクス技術との相補性です。

優れた組織経済性を実現し、低発現の転写産物の検出も可能にします。組織サンプルを取得した後、摂氏マイナス20度に設定されたクライオスタットを使用して試料を12マイクロメートルの厚さに切断し、スライドアダプターを使用して試料を専用のレーザーマイクロダイセクションスライドに固定します。凍結切片作成から10日以内に、PBS中の89.2マイクロリットルのRNaseフリー10%BSAを、4マイクロリットルのFITCファロイジン、1.5マイクロリットルのDAPI、2マイクロリットルのAlexa Fluor 546に直接結合した目的の抗体、および3.3マイクロリットルのRNase阻害剤と混合します。

スライドをマイナス20°Cの100%アセトンで1分間洗浄し、スライドを湿度チャンバーに入れます。スライドの上部を新しいRNaseフリーPBSで1回の洗浄につき30秒間2回洗浄し、続いてRNaseフリーPBSで10%BSAで30秒洗浄を2回行います。最後の洗浄後、調製した抗体溶液で室温で5分間サンプルを処理し、その後、RNaseフリーPBS中の10%BSAでさらに2回洗浄します。

2回目の洗浄後、スライドを組織培養フードで5分間風乾してから、スライドをレーザーマイクロダイセクションカッティングプラットフォームにロードします。PCR作業に適した、RNA単離キットからの50マイクロリットルの抽出バッファーを含む、オートクレーブ処理された500マイクロ遠心分離用コレクションチューブをデバイスに取り付けます。ロード後、サンプル内の関心領域を染色、形態、および位置によって特定します。

免疫蛍光法を使用して、少なくとも 500, 000 マイクロメートル四方の関心のあるセグメントの輪郭を描きます。次に、レーザーマイクロダイセクションを開始して、40を超えるレーザー出力を使用して領域を切除します。レーザーマイクロダイセクションプロセスが完了したら、マイクロ遠心回収チューブにキャップをし、チューブを激しくフリックして、内容物がキャップからチューブの底に移動することを確認します。

遠心分離後、チューブを摂氏42度の水浴で30分間インキュベートしてから、チューブを再度遠心分離します。次に、上清をマイナス80°Cの貯蔵庫から新しい500マイクロリットルのチューブに移します。腎臓の尿細管サブセグメントの同定は、細胞の形態や構造的ランドマークに加えて、ユニークな尿細管マーカーの抗体染色によって達成されます。

形態学的組織の特徴と組み合わせた蛍光標識および画像構造の空間的配置により、腎臓のサブセグメントを高い信頼性で視覚化することが容易になります。この代表的なダウンストリームシーケンシング解析では、最小解剖面積インプットを満たす成功率が90%を超え、遺伝子検出に利用できる総mRNA量が多くなりました。この分析では、サンプルの100%が少なくとも10, 000遺伝子の最小検出閾値を満たしました。

レーザーマイクロダイセクション後、既知のマーカーの遺伝子発現の濃縮分析を他のコンパートメントのものと比較できます。この解析では、レーザーマイクロダイセクション地域トランスクリプトミクスにより、各サブセグメントに1つのマーカーを同定し、対応するネフロンサブセグメントの特異的な免疫組織化学的染色ももたらしました。レーザーマイクロダイセクションは、解剖対象の構造を正確に特定するために、ユーザーの専門知識に大きく依存していることに注意することが重要です。

この技術により、特定の局所的な遺伝子発現シグネチャの研究が可能になり、疾患の進行に関与する可能性のある経路や健康な組織の生物学を評価するために使用できます。