Name: Subcellulaire fractionering voor de isolatie van synaptische componenten uit het muizenbrein (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 14 s
Description: Leer subcellulaire fractionering voor de isolatie van synaptische componenten uit het muizenbrein. Deze methode maakt gedetailleerde analyse van eiwitlokalisatie en synaptische functie op compartimentniveau mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen P. Colosi bedanken voor em-beeldvoorbereiding. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (R01 NS064963, SSC; R01 NS110354, SSC; R01 NS083846, SSC; R21 NS094971, SSC; T32 NS007224, SMT; T32 NS041228, SMT), het Amerikaanse ministerie van Defensie (W81XWH-17-1-0564, SSC; W81XWH-19-1-0264, VDJ), Aligning Science Across Parkinson's (ASAP) Collaborative Research Network (SSC) en het Michael J. Fox Foundation Target Advancement Program (MJFF-020160, SSC &VDJ). We hebben grafische illustraties gemaakt met behulp van BioRender.com.

Alle experimenten met muizen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de Yale University (Protocol 2021-11117) en uitgevoerd in een faciliteit die is geaccrediteerd door de Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Dierenverzorging en huisvesting voldeden aan de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals33 en werden verstrekt door het Yale Animal Resource Center (YARC). Dieren werden gehouden in een 12 uur licht/donker cyclus met ad libitum toegang tot voedsel en water. Vijf tot acht muizen of twee tot vier ratten per genotype of aandoening zijn vereist voor het volgende protocol. Er zijn minder ratten nodig vanwege hun grotere hersenvolumes. Evenzo kan de leeftijd van de proefdieren van invloed zijn op de fractieopbrengst; extra muizen kunnen nodig zijn voor leeftijden jonger dan 2 maanden. Anders zijn de geschetste procedures van toepassing op zowel muizensoorten als gezonde volwassen dieren van elke leeftijd. De representatieve gegevens die in deze studie werden gepresenteerd, maakten gebruik van wildtype (C57BL / 6J) muizen (leeftijd = 2 maanden; vier mannetjes en vier vrouwtjes per replicaat) verkregen uit een commerciële bron (zie materiaaltabel).
1. Experimentele voorbereiding
OPMERKING: Dit protocol vereist ~ 11 uur voor een enkele onderzoeker om te voltooien. Het wordt ten zeerste aanbevolen om de benchtop-opstelling (figuur 1), buffervoorbereiding (tabel 1), het voorkoelen van centrifuges en rotors tot 4 °C en het verzamelen en etiketteren van benodigde materialen en apparatuur (zie materiaaltabel) de dag voorafgaand aan de uitvoering van het protocol, indien van toepassing, te voltooien.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64574/64574fig01.jpg"> Figuur 1: Benchtop setup. Voorafgaand aan hersendissecties werden (A) Dounce-glashomogenisatoren en (B) alle buffers gekoeld op ijs. (C) Proteaseremmers werden op ijs ontdooid. Een tweede container met nat ijs voor centrifugebuizen, een Dewar van vloeibare stikstof (niet afgebeeld) en (D) een container met droogijs voor kortetermijnopslag van de monsters die in vloeibare stikstof zijn bevroren, werden verkregen. (E) Microcentrifugebuizen werden voor alle monsters vooraf gelabeld, aangezien tijdens deze procedure vier aliquots van elk subcellulair fractiemonster per genotype of toestand werden verzameld (tijdbesparende tip: label alle buizen grondig de dag voordat het experiment wordt uitgevoerd). (F) Een geschikte biohazard afvalcontainer, (G) 70% ethanol, (H) chirurgische hulpmiddelen en (I) een absorberend oppervlak pad. De benodigde centrifugebuizen en disposables werden gereserveerd voor efficiënte toegang tijdens de implementatie van het protocol (niet getoond). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64574/64574fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<ol><li>Bereid de benchtop voor op een operatie en verzamel de schaar en tang die nodig zijn voor hersenexcisie (zie materiaaltabel). Pre-label 1,5 ml microcentrifugebuizen voor muizenstaartbiopten en vier buizen per verzamelde fractie, zoals aangegeven in figuur 2.</li>
	<li>Verkrijg twee containers nat ijs, een container met droogijs en een benchtop vloeibare stikstof Dewar-kolf.</li>
	<li>Ontdooi fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), pepstatine A, aprotinine en leupeptine stockoplossingen op ijs (zie Materiaaltabel). Bereid de nodige buffers voor (tabel 1). OPMERKING: Sucrose-oplossingen kunnen van tevoren worden bereid en bij 4 °C worden bewaard. Proteaseremmers (ontdooide voorraden en tabletten) moeten echter aan het begin van het experiment vers aan alle buffers worden toegevoegd vanwege de instabiliteit van deze reagentia in waterige oplossingen. Verder moeten alle buffers worden bereid met wasmiddelvrij glaswerk en wasmiddelvrij water om intacte synaptokosomen te kunnen verzamelen.</li>
	<li>Koel alle buffers en glazen Dounce homogenisatoren (zie Materiaaltabel) op ijs. Zet de centrifuges op 4 °C en koel de rotoren tot 4 °C.</li>
	<li>Voeg 14 ml buffer A (tabel 1) toe aan een douncehomogenisator op ijs.</li>
</ol>Tabel 1: Samenstelling van de subcellulaire fractioneringsbuffers. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64574/64574_Table%201_revised.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64574/64574fig02.jpg"> Figuur 2: Overzicht van het subcellulaire fractioneringsprotocol. Samenvatting schema van de subcellulaire fractioneringsstappen en verzamelde monsters. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64574/64574fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
2. Hersenexcisie van muizen
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64574/64574fig03.jpg"> Figuur 3: Craniofaciale anatomie. (A) Dorsale weergave van een muizenschedel met relevante schedelstructuren aangegeven. (B) Linker zijwaartse weergave van een muizenschedel en hersenen met relevante schedelstructuren en anatomische richtingen aangegeven. De stippellijnen vertegenwoordigen de locaties waar incisies moeten worden gemaakt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64574/64574fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<ol><li>Verdoof elke muis diep met 100% isofluoraan in een anesthesiekamer in een zuurkast of bioveiligheidskast met behulp van een open druppelmethode34. Offer elke muis op door cervicale wervelkolomdislocatie, snel gevolgd door onthoofding. Wissel af tussen genotypen of experimentele groepen voor elk offer en dissectie12. Verkrijg staartbiopten na euthanasie door 2 mm van de distale staartpunt met een fijne schaar uit te stoten. Bewaar het weefsel voor genotypering.</li>
	<li>Spray de onthoofde kop met 70% ethanol om te voorkomen dat het haar zich tijdens de dissectie aan het weefsel en chirurgische instrumenten hecht.</li>
	<li>Breng een fijne schaar onder de huid in bij de onthoofdingsincisie tot een pericraniale diepte en maak een midsagittale incisie tot aan de interne hechting (figuur 3A) om de hoofdhuid van de schedel terug te trekken.</li>
	<li>Werk vanuit het occipitale gebied naar elk temporeel aspect en trim de fascia en spier om het externe oppervlak van de schedel bloot te leggen voorbij elke externe akoestische meatus (figuur 3B).</li>
	<li>Beveilig de hoofdhuid en het rostrale aspect van de schedel met de niet-dominante hand. Plaats met de andere een fijne schaar 2 mm in de caudale kant van het foramen magnum, waar het ruggenmerg zichtbaar is. Maak een middellijnincisie totdat de schaar het interne oppervlak van het intrapariëtale bot bereikt (figuur 3; stippellijnen). OPMERKING: Tijdens de eerste incisie moet de schaar parallel zijn aan het ruggenmerg met druk op het interne oppervlak van de schedel om schade aan de hersenstam en het cerebellum te voorkomen.</li>
	<li>Verander de hoek van de schaar zodat de messen parallel lopen met het dorsale oppervlak van de schedel. Ga door met het rostrale bevorderen van de midsagittale incisie door de pariëtale en frontale botten, met behulp van de sagittale en interfrontale hechtingen als leidraad. Gebruik constante opwaartse druk om schade aan de cortex te voorkomen. Beëindig de incisie net voorbij de interne hechting (figuur 3A).</li>
	<li>Maak een kleine loodrechte incisie (~ 3 mm) op het neusbeen, rostral op de internasale hechting, door de schaar loodrecht op de schedel te plaatsen met elk mes op een nasale-premaxillaire hechting en maak er een gelijkmatige snede (figuur 3; stippellijnen). OPMERKING: Deze stap verhoogt het gemak van het intrekken van de schedel en is van cruciaal belang voor het verzamelen van de olfactorische bol als dit gebied van belang is.</li>
	<li>Gebruik tijdens het beveiligen van het rostrale aspect één kant van een paar getextureerde tangen om de schedel voorzichtig uit de hersenen op te tillen, vervolgens lateraal en ventraal. Herhaal dit langs de middellijn als dat nodig is, dan voor de andere hemisfeer totdat het hele hersenoppervlak is blootgesteld.</li>
	<li>Gebruik een gebogen tang of een fijne spatel om de rostrale kant van de hersenen voorzichtig op te tillen. Snijd de oog- en hersenzenuwen door om de excisie uit de schedel te voltooien.</li>
	<li>Verzamel voor elke aandoening vijf tot acht muizenhersenen samen in de gekoelde glazen Dounce-homogenisator met 14 ml buffer A (tabel 1).</li>
</ol>3. Synasptosoompreparaat
OPMERKING: De schema's van deze procedure zijn weergegeven in figuur 4.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64574/64574fig04.jpg"> Figuur 4: Synasptosoompreparaat. Schema van stap 3, het genereren van synaptokosomen (P2'). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64574/64574fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<ol><li>Homogeniseer de hersenen met behulp van een glazen Dounce-homogenisator in 12 up-down passes bij 500 tpm (totaal). Pauzeer kort bij elke downstroke om een grondige homogenisatie van het weefsel te garanderen. Homogeniseer bij voorkeur in een ijsbad om opwarming en eiwitdenaturatie te voorkomen. Neem 5 μL aliquots voor de bepaling van de eiwitconcentratie door de bicinchonininezuurtest (BCA, zie materiaaltabel). Neem 100 μL hele hersenen lysaat aliquots voor western blot (WB). Neem voor deze en alle volgende monsters (figuur 2) twee aliquots voor BCA en twee aliquots voor WB. Bevries alle verzamelde aliquots in vloeibare stikstof en bewaar ze bij −80 °C.</li>
	<li>Draai het totale hersenhomogenaat in een snelle ronde bodemcentrifugebuis (14 ml) (zie materiaaltabel) op 800 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om het supernatant (S1) te verkrijgen. Breng S1 over naar een nieuwe centrifugebuis en laat de pellet achter (P1), die intacte cellen en kernen bevat. Vermijd het pipetteren van de donzige, witte, losse, oppervlakkige pellet. Neem 2 x 5 μL S1 voor BCA en 2 x 100 μL S1 voor WB.</li>
	<li>Draai S1 bij 9.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C om het synaptosomale supernatant (S2) en de ruwe synaptosoompellet (P2) te verkrijgen. Neem 2 x 10 μL S2 voor BCA en 2 x 500 μL S2 voor WB. Gooi het supernatant weg na het verkrijgen van aliquots en ga verder met de volgende stap met de pellet.</li>
	<li>Resuspensie P2 in 3 ml ijskoude buffer A met proteaseremmers en centrifugeer bij 9.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C om het supernatant (S2') en gewassen synaptosomen (P2') te verkrijgen. Gooi het supernatant weg en bewaar de pellet.</li>
	<li>Resuspendeer P2' in 3 ml buffer A. Vermijd resuspendatie van het donkerrode gedeelte op de bodem van de pellet, dat voornamelijk mitochondriën bevat. Neem 2 x 20 μL P2' voor BCA en 2 x 100 μL P2' voor WB. OPMERKING: Dit kan worden bereikt door de randen en het oppervlak van de pellet voorzichtig te pipet-mengen om de witgekalkte synaftosomen te resuspenderen terwijl de pipetpunt wegleidt van het rode midden van de pellet.</li>
</ol>4. Hypotone lysis
OPMERKING: De schema's van deze procedure zijn weergegeven in figuur 5.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64574/64574fig05.jpg"> Figuur 5: Hypotone lysis. Schematische van stap 4, de hypotone lysis van synaptosomen om het lysis-supernatant (LS1) en synaptosomale membraanfracties (LP1) te genereren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64574/64574fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<ol><li>Voeg voor de hypotone lysis van gewassen synaposomen 9 volumes gekoelde buffer B (tabel 1) toe aan geresuspendeerde P2' (~27 ml). Homogeniseer de synaptokosomen in een glazen Dounce-homogenisator (drie up-down passages bij 500 tpm).</li>
	<li>Breng de monsters over in conische centrifugebuizen met 50 ml. Draai ze op een buis revolver in een 4 °C koude ruimte gedurende 15 min.</li>
	<li>Centrifugeer P2' bij 25.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C om het lysissupernatant (LS1) en de lysispellet met synaptosomale membranen (LP1) te verkrijgen. Neem 2 x 50 μL LS1 voor BCA en 2 x 400 μL LS1 voor WB. Breng LS1 over in een afgedekte centrifugebuis voor ultracentrifugatie (zie Materiaaltabel).</li>
</ol>5. Synaptische vesikel isolatie
OPMERKING: De schema's van deze procedure zijn weergegeven in figuur 6.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64574/64574fig06.jpg"> Figuur 6: Synaptische vesikelisolatie en synaptische plasmamembraanisolatie. (A) Schematische van stap 5, de isolatie van synaptische cytosol (LS2) en synaptische blaasjes (LP2) fracties, en (B) stap 6, de generatie van myeline (MF), synaptisch plasmamembraan (SPM) en mitochondriale (Mito.) fracties na de ultracentrifugatie van sucrosegradiënten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64574/64574fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<ol><li>Centrifugeer LS1 in een ultracentrifugerotor met vaste hoek (zie materiaaltabel) bij 100.000 x g gedurende 60 minuten bij 4 °C om synaptisch cytosolsupernatant (LS2) en synaptische blaasjespellet (LP2) te verkrijgen. LP2 is klein, doorschijnend en sterk gehecht aan de zijkant van de centrifugebuis.</li>
	<li>Resuspend LP2 in 500 μL buffer A. Met behulp van een naald van 23 G en een spuit van 1 ml schuift u LP2 af met zachte trituratie. Neem 2 x 10 μL LP2 voor BCA en 2 x 250 μL LP2 voor WB.</li>
	<li>Breng LS2 (~30 ml) over op centrifugale filtereenheden met een afsnijding van 10 kDa (zie materiaaltabel). OPMERKING: Als eiwitten kleiner dan 10 kDa van belang zijn, zijn 4 kDa cutoff centrifugaalfiltereenheden beschikbaar, maar dit zal resulteren in langere spintijden.</li>
	<li>Concentraat LS2 tot ongeveer 0,5 ml door te draaien bij 5000 x g gedurende maximaal 1 uur bij 4 °C. Neem 2 x 10 μL geconcentreerd ls2 voor BCA en 2 x 250 μl geconcentreerd ls2 voor wb. Nadat u de spin hebt gestart, gaat u direct verder met stap 6.1.</li>
</ol>6. Synaptische plasmamembraanisolatie
<ol><li>Resuspendeer LP1 (stap 4.3) in 1 ml buffer B (tabel 1). Neem 2 x 10 μL LP1 voor BCA en 2 x 50 μL LP1 voor WB. Stel de resterende LP1 in op een eindvolume van 7,5 ml en een uiteindelijke sucroseconcentratie van 1,1 M met buffer B en buffer C (tabel 1).</li>
	<li>Breng 7,5 ml geresuspendeerde LP1 over in een ultracentrifugebuis van 14 ml (zie materiaaltabel). Leg LP1 voorzichtig overlay met 3,75 ml buffer D (tabel 1) en leg vervolgens over met 1,25 ml buffer A (of een groter volume om net onder de bovenkant van de centrifugebuis te vullen). Vermijd pipetteren langs de zijkant van de buis, die de sucrose gradiënt interfaces zal verstoren. Nadat u elke sucrosefractie hebt bedekt, markeert u de bovenkant van de oplossing met een pen. Balanceer de buizen voor ultracentrifugatie op gewicht, niet volume, met de druppelsgewijze toevoeging van buffer A tot binnen 10 mg. Centrifugeer bij 48.000 x g gedurende 2,5 uur bij 4 °C in een ultracentrifugerotor met zwenkbare emmer (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Verkrijg afbeeldingen van de intacte gradiënten na ultracentrifugatie om de onderscheidendheid van elke sucrose-interface en het succes van fractionering te documenteren.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de oppervlakkige laag van 320 mM sucrose (Buffer A). Herstel de myelinefractie (MF) op de sucrose-interface van 320 mM/855 mM in een volume van 800 μL. Herstel de synaptische plasmamembraanfractie (SPM) op de sucrose-interface van 855 mM/1,1 M in een volume van 1.000 μL. Pipetteer elke fractie op een cirkelvormige manier uit de wand van de buis om ervoor te zorgen dat de volledige fractie wordt verzameld. Zuig de resterende sucrose voorzichtig af en win de mitochondriale pellet (Mito.) terug door 200 μL buffer B te resuspenderen. Neem 2 x 100 μL MF voor BCA en 2 x 10 μL Mito. voor BCA; verdeel de rest van MF en Mito. monsters in tweeën voor WB.</li>
	<li>Verdun de SPM-fractie met 2 volumes buffer B (~ 2 ml) en centrifugeer vervolgens in een rotor met vaste hoek in een centrifugebuis van 3,5 ml (zie materiaaltabel) bij 25.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de SPM-pellet in buffer A voor een eindvolume van 250 μL. Neem 2 x 5 μL SPM voor BCA en verdeel de resterende SPM in tweeën voor WB.</li>
	<li>Voer een BCA uit om de eiwitconcentratie van elk monster te bepalen, rekening houdend met variabel aliquotvolume. OPMERKING: Voor WB-analyse is de voorgestelde werkeiwitconcentratie voor alle subcellulaire fracties 2 μg / μL (of zo hoog als haalbaar voor LS1 en MF).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In hun baanbrekende studies gebruikten Whittaker en collega's vier morfologische criteria om synaptokosomen te identificeren: (1) de structuren hebben een verzegeld plasmamembraan; (2) de structuren bevatten SV's die qua grootte en aantal lijken op die in zenuwklemmen en spataderen in situ; (3) de structuren bezitten een of meer kleine mitochondriën; en (4) het presynaptische membraan wordt vaak gehecht aan een post-synaptische component 11,12,13. Hoewel de eerste twee criteria over het algemeen van toepassing zijn op elke isolatiemethode, zullen in de meest recente protocollen die in dit artikel worden beschreven, niet alle resulterende synaptosomen mitochondriën en bevestigde post-synaptische terminals hebben. Ongeveer 60% van de synaptosomen zal mitochondriën hebben en slechts tot 15% heeft naar schatting post-synaptische terminals bevestigd37. Als post-synaptische componenten van bijzonder belang zijn, is bekend dat het gebruik van een isotone Krebs-achtige homogenisatiebuffer en drukfiltratie voor verrijking hoge concentraties synaptosomen met post-synaptische terminals (ook wel synaptoneurosomen genoemd)22,38 oplevert.
De methode om het dier op te offeren kan de kwaliteit van synaposomen en synaptische subfractions beïnvloeden. Volwassen dieren die worden geofferd met behulp van een euthanasiemethode die geen anesthesie vereist, zullen resulteren in de beste fractiekwaliteit. Verder moeten de hersenen vers worden ontleed, niet bevroren en gehomogeniseerd met behulp van een 1:10 verhouding van homogenisatiebuffer (gewicht / volume) voor de meest levensvatbare synaptische fracties22. De hersenen hebben een heterogene populatie van synapsen die kunnen worden onderscheiden door het type neurotransmitters dat ze dragen. Synaptosoomvorming wordt over het algemeen niet beïnvloed door synapstype of neurotransmittergehalte13. Een uitzondering zijn bemoste vezels in het cerebellum, waarvan bekend is dat ze in optimale omstandigheden worden verstoord voor het verkrijgen van synaptosomen uit de rest van de hersenen39,40. Verwijdering van het cerebellum voorafgaand aan hersenhomogenisatie wordt dus aanbevolen als de uitsluiting van dit gebied het experimentele doel niet beïnvloedt. Als u geïnteresseerd bent in het isoleren van synaptosomen van een bepaald neurotransmitterkarakter, kunnen gebieden van de hersenen die zijn verrijkt voor neuronen die de neurotransmitter van belang bevatten, eerst worden geïsoleerd. Deze aanpak zal echter beperkingen opleggen aan de uiteindelijke fractieopbrengst, afhankelijk van de grootte van het gebied van belang (de leeftijd van dieren is daarom ook een overweging). Er zijn immunochemische methoden voor de isolatie van neurotransmitterspecifieke synaptosomen, maar de levensvatbaarheid en opbrengst zullen aanzienlijk in gevaar komen22. Als het beoordelen van de metabole levensvatbaarheid van synaptosomen belangrijk is, kan de meting van neurotransmitterafgifte 41,42 of bepaalde enzymatische assays43 worden gebruikt.
Veel voorkomende verontreinigingen in synasptosoompreparaten zijn microsomen, vrije mitochondriën, SV's en neuronale en gliamembranen. Verontreiniging kan worden verminderd door het aantal wasbeurten bij de P1- en P2-fracties22 te verhogen en resuspensie van de rode mitochondriale pellet in volgende stappen te voorkomen. In experimenten waar metabole levensvatbaarheid en tijd cruciaal zijn, zal het verminderen van het aantal wasbeurten en het gebruik van Ficoll- of Percoll-gradiënten over sucrosegradiënten nuttig zijn 44,45,46. Deze methoden verminderen ook de vervuiling aanzienlijk. Het oorspronkelijke protocol van Whittaker leverde hoogwaardige SV's op. Verdere optimalisatie door Nagy et al.23, opgenomen in deze methode, produceert SV's met opmerkelijke homogeniteit en zuiverheid zonder significant in te leveren op opbrengst36. Als specifieke SV-subtypen van belang zijn, zoals glutamaterge (VGLUT-1-bevattende) of GABAerge (VGAT-1-bevattende) SV's, kan immuno-isolatatie met behulp van specifieke antilichamen worden uitgevoerd47,48. Er zijn ook alternatieve methoden beschikbaar voor het isoleren van CCV's van synaptokosomen, die vanwege de differentiële dichtheid mogelijk niet op hetzelfde grensvlak aanwezig zijn als SV's die met deze methode worden verkregen 20,49,50.
Over het algemeen kan het huidige protocol om synaptische componenten te isoleren verder worden geoptimaliseerd om fracties te verkrijgen met verbeterde homogeniteit en levensvatbaarheid op basis van de kwaliteit en kwantiteit van het bronhersenweefsel en de experimentele doelen. Voor verdere details over het oplossen van problemen, moet men verwijzen naar boekhoofdstukken van Dunkley en Robinson22 en Ganzella et al.36.

Synapsen zijn de elementaire computationele eenheden van de hersenen waardoor neuronen communiceren en diverse en buitengewoon complexe functies uitoefenen. Synapsen zijn dus fundamenteel voor de gezondheid van de hersenen1; synaptische disfunctie is betrokken als een bron of gevolg van vele aandoeningen2. Synapsen worden gevormd door pre- en post-synaptische terminals, uitbreidingen van twee verschillende neuronen die nauw worden aangesteld en gescheiden door een synaptische spleet doorkruist door synaptische adhesiemoleculen. Informatie stroomt van het pre- naar post-synaptische compartiment in de vorm van chemische boodschappers genaamd neurotransmitters1. De moleculaire processen die betrokken zijn bij neurotransmissie zijn actieve onderzoeksgebieden 3,4,5. Het begrijpen van de pathogene processen binnen synaptische terminals en de reactie van synapsen op pathologie in andere neuronale subcompartimenten zijn cruciale stappen om hersenaandoeningen aan te pakken 1,2. Verschillende methodologische ontwikkelingen, voornamelijk toegepast op muizenmodellen, hebben dit streven bevorderd6. De isolatie van synaptische fracties door differentiële centrifugatie is zo'n paradigma-verschuivende methode die de gedetailleerde evaluatie van synaptische processen in gezondheid en ziekte mogelijk heeft gemaakt.
Het volwassen menselijk brein bestaat uit 80-90 miljard neuronen 7,8. Onder muizensoorten bevat het rattenbrein ongeveer ~ 200 miljoen neuronen, terwijl muizen ~ 70 miljoen 9,10 hebben. Elk neuron vormt duizenden specifieke synaptische verbindingen met een netwerk van sterk gepolariseerde neuronen vermengd met gliacellen en dichte vasculatuur. In zulk complex en heterogeen weefsel was het ooit ondenkbaar om synapsen als een onafhankelijk systeem te isoleren en te bestuderen. In de jaren 1960 maakten Victor Whittaker, Catherine Hebb en anderen dit mogelijk door intacte synaptische terminals te isoleren met behulp van subcellulaire fractionering 11,12,13,14. In een poging om synaptische blaasjes (SV's) te isoleren, homogeniseerden ze de hersenen door middel van vloeibare schuifkracht in iso-osmotische (0,32 M) sucrose gevolgd door ultracentrifugatie. Ze verkregen afgeknepen, plasmamembraan-ingesloten, intacte zenuwterminals of spataderen, die ze zenuwuiteinddeeltjes (NEPs) noemden 11,13. Omdat de structurele en functionele kenmerken van de synaps in deze structuren bewaard bleven, werden NAP's later "synaptosomen" genoemd voor congruentie met andere subcellulaire organellen13,15. Het is vermeldenswaard dat het werk van Eduardo de Robertis en collega's, die de term "synaptisch blaasje" bedachten, overlapte met dat van Whittaker en collega's en bijdroeg aan de validatie van "synaptosoom" isolatie en karakterisering 16,17,18.
Synaptosomen zijn fysiologisch actieve structuren die alle cellulaire en moleculaire eigenschappen bevatten die nodig zijn voor de opslag, afgifte en heropname van neurotransmitters 13,18. Het behoud van belangrijke synaptische kenmerken in vitro en de vrijheid van niet-synaptische componenten dragen ook bij aan het nut van deze isolatiemethode. Synaptosomen hebben enorm bijgedragen aan het begrip van de chemische en fysiologische eigenschappen van neurotransmissie en worden nu gebruikt om synaptische moleculaire processen en hun veranderingen in ziekte te bestuderen 19,20,21,22,23. Synaposomen zijn ook het initiële bronmateriaal voor het isoleren van synaptische componenten zoals SV's, clathrine-gecoate blaasjes (CCV's), synaptisch cytosol, synaptisch plasmamembraan, synaptische mitochondriën, synaptische adhesiemoleculen en andere componenten van belang, die het begrip van de moleculaire mechanismen van synaptische functie kunnen vergemakkelijken 18,19,20,24,25,26, 27,28. Deze sub-synaptische componenten kunnen worden verkregen door de osmotische lysis van synaposomen en sucrosedichtheidsgradiënt ultracentrifugatie15,29. Hoewel bekend is dat de oorspronkelijke subcellulaire fractioneringsmethode van whittaker's onderzoeksgroep efficiënt is in het isoleren van kwaliteitssynadosomen en SV's13,30, verbeteren recente optimalisaties de zuiverheid van de subcellulaire fracties 22,23,31,32. Dit artikel biedt een zeer gedetailleerde en toegankelijke versie van een klassiek protocol voor de subcellulaire fractionering van muizenhersenweefsel om synaptosomen, SV's en andere sub-synaptische componenten te isoleren.

<table><tbody><tr><td>1 mL TB Syringe</td><td>BD</td><td>309649</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf Tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2500</td><td></td></tr><tr><td>14 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube</td><td>Beckman Coulter</td><td>344060</td><td>Compatibel met SW 40 Ti</td></tr><tr><td>23 Gauge Precision Glide Hypodermic Needle</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>26.3 mL, Polycarbonate Bottle met Cap Assembly</td><td>Beckman Coulter</td><td>355618</td><td>Compatibel met Ti70</td></tr><tr><td>3.5 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube</td><td>Beckman Coulter</td><td>349623</td><td>Compatibel met TLA-100.3</td></tr><tr><td>50 mL Falcon Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6279</td><td>1 mg/mL in diH2O</td></tr><tr><td>Avanti J-26 XP Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>B22984</td><td><26.000 rpm</td></tr><tr><td>Benchtop HDPE Dewar Flask</td><td>Thermo Scientific</td><td>5028U19</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Muizen</td><td>The Jackson Labs</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628168</td><td><14.000 rpm</td></tr><tr><td>complete, Mini, EDTA-vrije Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Voeg 1 tablet toe per 50 mL van de oplossing</td></tr><tr><td>Curved Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11273-20</td><td></td></tr><tr><td>Fine Surgical Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>8r</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Col Tissue Homogenizing System</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-04369-15</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11650-10</td><td></td></tr><tr><td>High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes</td><td>ThermoFisher</td><td>3117-0500</td><td>Compatibel met JA20</td></tr><tr><td>Isofluoraan</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>JA-20 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>334831</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>American Bio</td><td>AB01108</td><td>1 mg/mL in diH2O</td></tr><tr><td>N-[2-Hydroxyethyl] piperazine-N’-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)</td><td>American Bio</td><td>AB00892</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-80 XP Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td><100.000 rpm</td></tr><tr><td>Optima TLX Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td><120.000 rpm</td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>Thermo Scientific</td><td>78436</td><td>1 mg/mL in DMSO</td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>American Bio</td><td>AB01620</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23335</td><td>Voor bepaling van de eiwitconcentratie</td></tr><tr><td>Pipette Tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>SW 40 Ti Swinging-Bucket Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>331301</td><td></td></tr><tr><td>Teflon-Coated Pestle and Mortar Tissue Grinder</td><td>Thomas Scientific</td><td>3431D94</td><td></td></tr><tr><td>Ti70 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>TLA-100.3 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>349490</td><td></td></tr><tr><td>Tube Revolver</td><td>Dot Scientific</td><td>DTR-02VS</td><td></td></tr></tbody></table>

subcellulaire fractionering voor de isolatie van synaptische componenten uit het muizenbrein

Subcellular Fractionation for the Isolation of Synaptic Components from the Murine Brain

Synaptische terminals zijn de primaire plaatsen van neuronale communicatie. Synaptische disfunctie is een kenmerk van veel neuropsychiatrische en neurologische aandoeningen. De karakterisering van synaptische subcompartimenten door biochemische isolatie is daarom een krachtige methode om de moleculaire bases van synaptische processen op te helderen, zowel in gezondheid als ziekte. Dit protocol beschrijft de isolatie van synaptische terminals en synaptische subcompartimenten uit muizenhersenen door subcellulaire fractionering. Ten eerste worden verzegelde synaptische terminale structuren, bekend als synaptosomen, geïsoleerd na homogenisatie van hersenweefsel. Synaposomen zijn neuronale pre- en post-synaptische compartimenten met afgeknepen en afgedichte membranen. Deze structuren behouden een metabolisch actieve toestand en zijn waardevol voor het bestuderen van synaptische structuur en functie. De synaposomen worden vervolgens onderworpen aan hypotone lysis en ultracentrifugatie om synaptische subcompartimenten te verkrijgen die zijn verrijkt voor synaptische blaasjes, synaptisch cytosol en synaptisch plasmamembraan. Fractiezuiverheid wordt bevestigd door elektronenmicroscopie en biochemische verrijkingsanalyse voor eiwitten die specifiek zijn voor sub-synaptische compartimenten. De gepresenteerde methode is een eenvoudig en waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van de structurele en functionele kenmerken van de synaps en de moleculaire etiologie van verschillende hersenaandoeningen.

De gepresenteerde methode resulteert in 11 subcellulaire fracties van de hersenen die kunnen worden onderworpen aan verdere zuivering en verschillende vormen van downstream-analyse35,36. De gouden standaardmethode om de kwaliteit van synaptokosomen, SV's23 en andere componenten te beoordelen, is elektronenmicroscopie (EM) (figuur 7). Kwantitatieve immunoblotting voor eiwitten die aanwezig zijn in specifieke subcellulaire fracties kan ook worden uitgevoerd om markers van fractiezuiverheid te beoordelen (figuur 8). Immunoblotanalyse van fracties onthult bijvoorbeeld de verrijking van N-cadherine (CDH2, UniProt-naam) in de synaptische plasmamembraanfractie (SPM), α-synucleïne (SYUA) in het synaptische cytosol (LS2), synaptophysine (SYPH) in de synaptische blaasjesfractie (LP2) en myelinebasiseiwit (MBP) in de myelinefractie (MF) in vergelijking met eiwitniveaus in het initiële homogenaat van de hele hersenen (totaal) (figuur 8) ). Zodra de fractiezuiverheid is vastgesteld (let bijvoorbeeld op de afwezigheid van CDH2 in de LS2-fractie of de veelvoudige toename van SYPH in de LP2-fractie), kan kwantitatieve immunoblotting worden gebruikt om de lokalisatie van interessante eiwitten te bepalen of verschillen in eiwitverdeling tussen genotypen of behandelingen te onderzoeken. Inzicht in de subcellulaire lokalisatie van synaptische eiwitten kan de dissectie van voorheen onbeschreven eiwitfuncties mogelijk maken. Verder kan deze methode traffickingdefecten of synaptische disfunctie in ziektetoestanden ophelderen, vooral in combinatie met functionele assays. Ons team heeft deze methode bijvoorbeeld gebruikt om een pool van enzymatisch actief palmitoyleiwit thioesterase 1 te identificeren dat is verrijkt in het synaptische cytosol19.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64574/64574fig07.jpg"> Figuur 7: Elektronenmicroscopie (EM) van synaptosomen. (A) Representatieve EM-afbeelding van een synaptosoom dat synaptische blaasjes bevat (pijl). (B) Representatief EM-beeld van een synaptosoom met zowel pre- (pijl) als post-synaptische componenten (dubbele pijl). (C) Representatief EM-beeld van een synaptosoom dat synaptische blaasjes bevat en een mitochondrion (pijl) (schaalstaven = 100 nm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64574/64574fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64574/64574fig08.jpg"> Figuur 8: Immunoblotanalyse van subcellulaire fracties. (A) Markers van subcellulaire fractiezuiverheid (aangegeven met UniProt-nomenclatuur) zijn passend gelokaliseerd in vergelijking met het gehele hersenhomogenaat (totaal): N-cadherine (CDH2) in de synaptische plasmamembraanfractie (SPM), synaptophysine 1 (SYPH) en synaptojanine 1 (SYNJ1) in de synaptische blaasjesverrijkte fractie (LP2), α-synucleïne (SYUA) in het synaptische cytosol (LS2), en myeline basiseiwit (MBP) in de myelinefractie (MF). (B) Immunoblot-kwantificeringsanalyse onthult de verrijking (vouwverandering ten opzichte van totaal) van fractiezuiverheidsmarkers. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie op een log10-schaal. De stippellijn geeft een 1,5-voudige verandering aan (y = 0,176) (n = 3 replicatie-experimenten met 8 wildtype muizen; leeftijd = 2 maanden; n = 4-5 vlekken voor SYPH, SYUA, MBP, met n = 3 uitgezette waarden eerder gepubliceerd door Gorenberg et al.19; n = 5 voor SYNJ1; n = 1 voor CDH2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64574/64574fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit protocol presenteert een robuuste, gedetailleerde methode om zeer zuivere synaptosomen, synaptische blaasjes en andere synaptische fracties uit het muizenbrein te verkrijgen. Deze methode maakt de evaluatie van synaptische processen mogelijk, inclusief de biochemische analyse van eiwitlokalisatie en -functie met compartimentale resolutie.

Subcellulaire fractionering voor de isolatie van synaptische componenten uit het muizenbrein

Synaptic terminals are the primary sites of neuronal communication. Synaptic dysfunction is a hallmark of many neuropsychiatric and neurological ...

Synapsen zijn de basis computationele eenheden van de hersenen. De gepresenteerde methode is een eenvoudig en waardevol hulpmiddel om de synapsen en hun moleculaire processen te bestuderen en ook om te begrijpen hoe ze kunnen worden veranderd bij verschillende hersenaandoeningen. Deze techniek omvat een fractionering van synaptosoomstructuren geïsoleerd uit de hersenen.Dit stelt de onderzoeker in staat om effecten vast te leggen die mogelijk worden gecompartimenteerd op de synaps. De distributieniveaus en activiteit van specifieke eiwitten kunnen ook worden geanalyseerd met subsynaptische resolutie. Deze procedure duurt ongeveer 11 uur voor een individuele onderzoeker om te voltooien als alles soepel verloopt.Een persoon die deze techniek nog nooit heeft uitgevoerd, kan moeite hebben met de duur van deze procedure, omdat het natuurlijk iets langer duurt voor iemand die niet bekend is met de stappen. Vanwege de lengte van deze experimentele dag, raden we ten zeerste aan om de dissecties uit te voeren met een partner die u kan helpen bij het vergemakkelijken van snelle weefselverzameling om ervoor te zorgen dat er geen monsters langer op ijs worden gezet dan nodig is. We raden ook aan om buffers en bench top materialen de dag voorafgaand aan het uitvoeren van dit experiment voor te bereiden, zodat alles binnen handbereik is wanneer dat nodig is.Dit geldt met name voor de verzamelbuizen. Meerdere aliquots van in totaal 11 subcellulaire fracties zullen tegen het einde van deze procedure worden verzameld. Dus als je deze buizen van tevoren duidelijk hebt gelabeld, wordt je dag veel gemakkelijker.Om te beginnen, plaats een fijne schaar onder de huid bij de onthoofdingsincisie naar een peri craniale diepte en maak een mid sagittale incisie tot aan de intranasale hechting om de hoofdhuid uit de schedel terug te trekken. Werk vanuit het occipitale gebied naar elk temporeel aspect en trim de fascia en spier om het externe oppervlak van de schedel voorbij elke externe akoestische meatus bloot te leggen. Beveilig de hoofdhuid en het rostrale aspect van de schedel met de niet-dominante hand en steek met de andere hand een fijne schaar twee millimeter in de caudale kant van het foramen magnum waar het ruggenmerg zichtbaar is.Maak een middellijnincisie totdat de schaar het interne oppervlak van het intrapariëtale bot bereikt. Verander de hoek van de schaar zodat de messen parallel lopen aan het dorsale oppervlak van de schedel. Ga door met het bevorderen van de midsagittale incisie rostrale door de pariëtale en frontale botten met behulp van de sagittale en interfrontale hechtingen als leidraad en beëindig de incisie net voorbij de internasale hechting.Maak vervolgens een drie millimeter loodrechte incisie naar het neusbeen, rostral naar de interne hechting, door de schaar loodrecht op de schedel te plaatsen met elk mes op een nasale premaxillaire hechting en er een gelijkmatige snede te maken. Gebruik tijdens het beveiligen van het rostrale aspect één kant van een getextureerde tang om de schedel voorzichtig uit de hersenen op te tillen en vervolgens lateraal en ventraal op te tillen. Herhaal dit langs de middellijn als dat nodig is, dan voor de andere hemisfeer totdat het hele hersenoppervlak is blootgesteld.Met behulp van een gebogen tang of een fijne spatel tilt u voorzichtig de rostrale kant van de hersenen op. Snijd de oog- en hersenzenuwen door om de excisie uit de schedel te voltooien. Homogeniseer de hersenen met behulp van een glazen dons homogenisator geplaatst op een ijsbad in 12 up down passes bij 500 rpm.Pauzeer kort bij elke downstroke om een grondige homogenisatie van het weefsel te garanderen. Breng het totale hersenhomogenaat over naar een 14 milliliter hoge snelheid ronde bodemcentrifugebuis en draai het op 800 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius om het supernatant genaamd S1.transfer S1 naar een nieuwe centrifugebuis te verkrijgen, gooi de pellet weg. Neem twee vijf microliter aliquots van S1 voor de bicinchonininezuurtest en twee 100 microliter aliquots van S1 voor de western blot.Draai S1 op 9.000 G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius om het synaptische somale supernatant, of S2, en ruwe synaptosoompellet of P2 te verkrijgen. Neem twee, 10 microliter aliquots van S2 voor de bicinchoninic acid assay en twee 500 microliter aliquots van S2 voor de western blot. Gooi het supernatant weg na het verkrijgen van de aliquots. na centrifugeren bij 9.000 G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius, verkrijg het supernatant S2'en gewassen synaptosoom, P2'Gooi het supernatant weg en resuspendeer P2'in drie milliliter buffer A.Vermijd resuspendatie van het donkerrode gedeelte aan de onderkant van de pellet, die voornamelijk mitochondriën bevat.Neem twee 20 microliter aliquots P2'voor de bicinchonininezuurtest en twee 100 microliter aliquots van P2' voor de western blot. Voeg voor de hypotone lyse van gewassen synaptosoom negen volumes gekoelde buffer B toe om P2 te resuspenderen en homogeniseer het synaptosoom in een glazen donshomogenisator. Breng de monsters over naar 50 milliliter afgedekte conische centrifugebuizen en draai ze gedurende 15 minuten op een buis revolver in een koude ruimte van vier graden Celsius.Centrifugeer de gelyseerde P2'at 25.000 G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius om het lysis-supernatant of LS1 en de lysispellet met synaptosomale membranen of LP1 te verkrijgen. Neem twee, 50 microliter aliquots LS1 voor de bicinchonininezuurtest en twee 400 microliter aliquots LS1 voor de western blot. Breng LS1 over in een afgedekte centrifugebuis voor ultracentrifugatie.Centrifugeer LS1 in een vaste hoek ultracentrifuge rotor op 100, 000 G gedurende 60 minuten bij vier graden Celsius om synaptisch cytosol supernatant, of LS2, en synaptische blaasjes pellet, of LP2 te verkrijgen. Resuspendeer LP2 in 500 microliter buffer A en gebruik een naald van 23 gauge en een spuit met één milliliter sheer LP twee met zachte trituratie. Neem twee, 10 microliter aliquots LP2 voor de bicinchonininezuurtest en twee, 250 microliter aliquots LP2 voor de western blot.Breng ongeveer 30 milliliter LS2 over naar centrifugale filtereenheden met een afsnijding van 10 miliDalton en concentreer de LS2 tot ongeveer 0,5 milliliter door te draaien op 5.000 G gedurende maximaal een uur bij vier graden Celsius. Neem twee, 10 microliter aliquots geconcentreerd LS2 voor de bicinchoninische assay, en twee, 250 microliter aliquots van geconcentreerde LS2 voor de western blot. Resuspendeer LP1 in één milliliter buffer B, En neem twee, 10 microliter aliquots LP1 voor de bicinchonininezuurtest en twee 50 microliter aliquots LP1 voor de western blot.Stel de resterende LP1 in op een eindvolume van 7,5 milliliter en een uiteindelijke sucroseconcentratie van 1,1 molair met buffer B en buffer C.Breng vervolgens 7,5 milliliter van de geresuspendeerde LP1 over in een ultracentrifugebuis van 14 milliliter. Leg de LP1 voorzichtig over elkaar met 3,75 milliliter buffer D en markeer de bovenkant van de oplossing met een pen. Vervolgens overlay met ongeveer 1,25 milliliter buffer A.En markeer op dezelfde manier de bovenkant van de oplossing met een pen.Balanceer de buizen voor ultracentrifugatie op gewicht, niet volume, met de druppelgewijze toevoeging van buffer A tot binnen 10 milligram. Centrifugeer bij 48.000 G gedurende 2,5 uur bij vier graden Celsius in een zwaaiende emmer ultracentrifugerotor en verkrijg beelden van de intacte gradiënten om de onderscheidendheid van elke sucrose-interface en het succes van fractionering te documenteren. Verwijder voorzichtig de oppervlakkige laag van 320 millimolaire sucrose en herstel de myelinefractie op de 320 millimolar, 855 millimolaire sucrose-interface in een volume van 800 microliter.Pipetteer op een cirkelvormige manier uit de buiswand om ervoor te zorgen dat de volledige fractie wordt verzameld. Herstel vervolgens de SPM-fractie op de 855 millimolaire, 1,1 millimolaire sucrose-interface in een volume van 1000 microliter. Zuig voorzichtig de resterende sucrose af en win de mitochondriale pellet terug door resuspendatie in 200 microliter buffer B.Verdun de SPM-fractie met twee volumes buffer B en centrifugeer vervolgens in een rotor met vaste hoek in een centrifugebuis van 3,5 milliliter.Gooi het supernatant weg en resuspenseer de SPM-pellet in buffer A voor een eindvolume van 250 microliter. Neem twee, vijf microliter aliquots SPM voor de bicinchonininezuurtest en deel de resterende SPM in tweeën voor de western blot. Elektronenmicroscopiebeelden van synaptosoom worden in deze figuur getoond.Een synaptosoom dat synaptische blaasjes bevat, zowel pre- als post-synaptische componenten en synaptische blaasjes in een mitochondrion, worden hier weergegeven. Immunoblotanalyse van subcellulaire fracties werd uitgevoerd om markers van fractiezuiverheid te beoordelen. In vergelijking met het initiële homogenaat van de hele hersenen, onthulde de analyse de verrijking van n-cadherine in de synaptische plasmamembraanfractie, alfa-synucleïne in het synaptische cytosol, synaptofysine in de synaptische blaasjesfractie en myelinebasisineteiwit in de myelinefractie.Zodra de zuiverheid van de fractie is vastgesteld, kan kwantitatieve immunoblotting worden gebruikt om de lokalisatie van interessante eiwitten te bepalen, of om verschillen in eiwitverdeling tussen genotypen of behandelingen te onderzoeken. Wanneer u deze procedure probeert, zorg er dan voor dat u reinigingsmiddelvrij glaswerk gebruikt, zodat intact synafptosoom kan worden verzameld. Wees ook voorzichtig bij het voorbereiden van sucrosegradiënten om ervoor te zorgen dat u duidelijke interfaces krijgt.Hiermee kunt u de synaptische plasmamembraanfractie met succes isoleren. Verschillende structurele en functionele analyses kunnen worden uitgevoerd om de kwaliteit van synaptische fracties zoals elektronenmicroscopie, immunoblotting, proteomics en andere moleculaire methoden te ondersteunen. Neurotransmitterafgifte of enzymatische assays kunnen ook worden uitgevoerd om de metabole levensvatbaarheid van synaptosoom te ondersteunen.De isolatie van synasptosoomstructuren was een paradigmaverschuivingstechniek voor de analyse van synapsfunctie en -samenstelling. Omdat we vroege synaptische disfunctie in neurodegeneratie zien, zal de zorgvuldige dissectie van moleculaire veranderingen op synapsniveau ons helpen de moleculaire mechanismen van deze aandoeningen te onderzoeken.

subcellular-fractionation-for-isolation-synaptic-components-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een methode om translationeel actief, intact synaptoneurosomes (SNS) voor te bereiden van de hersenen van muizen cortex wordt beschreven. De methode maakt gebruik van een discontinue Percoll-sucrose dichtheidsgradiënt waardoor voor de snelle bereiding van actieve SNS.

De voorbereiding van Synaptoneurosomes van Mouse Cortex met behulp van een Discontinue Percoll-Sucrose dichtheidsgradiënt

In this video, we perform the isolation of mononuclear cells from a mouse’s brain using density gradient centrifugation. The isolated mononuclear cell suspension can be used for further downstream analysis.

Mononuclear Cell Isolation from Mouse Brain: A Density Gradient Centrifugation Technique to Isolate Brain Resident Mononuclear Cells

This video demonstrates a method to isolate fluorescently labeled neurons from a mouse brain.

Isolating Fluorescently Labeled Neurons from a Murine Brain

Dit artikel beschrijft de verrijking van eiwitten geassocieerd met de synaptische plasmamembraan door ultracentrifugatie op een discontinue sucrose gradiënt. De verdere uitwerking van postsynaptische dichtheid eiwit wordt ook beschreven. Eiwitpreparaten zijn geschikt voor western blotting of 2D DIGE analyse.

Voorbereiding van Synaptic plasmamembraan en Postsynaptische Density eiwitten met behulp van een discontinue sucrosegradiënt

De identificatie van moleculen en routes die synaptische plasticiteit en geheugen beheersen, is nog steeds een grote uitdaging in de neurowetenschappen. Hier wordt een workflow beschreven die zich richt op de relatieve kwantificering van synaptische eiwitten die vermoedelijk betrokken zijn bij de moleculaire reorganisatie van synapsen tijdens het leren en het consolideren van geheugen in een auditief leerparadijm.

High Resolution Kwantitatieve Synaptic Proteome Profilering van Mouse Brain Regio Na Auditieve discriminatie Learning

Hier presenteren wij een breukmembraan fractioneringsprotocol dat een robuuste procedure voor het isoleren van eiwitten uit verschillende synaptische compartimenten vertegenwoordigt.

Breinmembraanfractie: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Aanpak om de subsynaptische eiwit lokalisatie te beoordelen

Elektroconvulsietherapie overname (ECS) is een experimentele diermodel van elektroconvulsieve therapie voor ernstige depressie. ECS stimuleert wereldwijd activiteit in de hippocampus, wat leidt tot synaptogenese en synaptische plasticiteit. Hier beschrijven we methoden voor ECS inductie bij ratten en voor subcellular versplintering van hun hippocampi te onderzoeken van inbeslagneming-geïnduceerde veranderingen in synaptic eiwitten.

Elektroconvulsietherapie vangsten bij ratten en versplintering van hun Hippocampi te onderzoeken van inbeslagneming-geïnduceerde veranderingen in postsynaptisch dichtheid eiwitten

We bieden een protocol voor isolatie van Microglia uit verschillende ontleed gebieden van een volwassen muis hersen halfrond, gevolgd door semi-geautomatiseerde bibliotheek voorbereiding voor diepe eencellige RNA-sequencing van volledige lengte transcriptomes. Deze methode zal helpen om functionele heterogeniteit van Microglia in gezondheid en ziekte te verhelmaken.

Isolatie van regiospecifieke Microglia van één volwassen muis hersen halfrond voor diepe eencellige RNA-sequencing

Dit neurale celdissociatieprotocol is bedoeld voor monsters met een lage hoeveelheid uitgangsmateriaal en levert een zeer levensvatbare eencellige suspensie op voor downstream-analyse, met optionele fixatie- en kleuringsstappen.

Gecombineerde mechanische en enzymatische dissociatie van hippocampusweefsel van muizenhersenen

Dit werk beschrijft een protocol voor de kwantificering van globale histonmodificaties met behulp van intranucleaire flowcytometrie in geïsoleerde hersenmicroglia. Het werk bevat ook het microglia-isolatieprotocol dat werd gebruikt voor het verzamelen van gegevens.

Kwantificering van globale histon posttranslationele modificaties met behulp van intranucleaire flowcytometrie in geïsoleerde microglia in de hersenen van muizen

Leer subcellulaire fractionering voor de isolatie van synaptische componenten uit het muizenbrein. Deze methode maakt gedetailleerde analyse van eiwitlokalisatie en synaptische functie op compartimentniveau mogelijk.

Subcellulaire fractionering voor de isolatie van synaptische componenten uit het muizenbrein

Meer video's verkennen