Name: Gezielter Knockdown von Genen im Plexus aderoid (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T14:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 43 s
Description: Erfahren Sie Methoden zum gezielten Gen-Knockdown im Plexus choroideus mit ICV-Injektionen und AAV2/5-Vektoren in Mausmodellen. Diese Technik ermöglicht spezifische Genmanipulation für Neurowissenschaften und Multiple-Sklerose-Forschung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir danken der National Natural Science Foundation of China (Zuschuss Nr. 31800903, vergeben an W. Zheng) und dem Wenzhou Science and Technology Project (Nr. Y2020426, vergeben an Y. Y. Weng) für diese Arbeit.

Alle in dieser Studie beschriebenen Tierbehandlungen wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des NIH-Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee der Wenzhou Medical University genehmigt.
1. Tiere
<ol><li>Kaufen Sie männliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen und einem Gewicht von 20-22 g.</li>
	<li>Besorgen Sie sich die transgene Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) Mauslinie und männliche A2AR flox/flox Mäuse.</li>
	<li>Verteilen Sie die Mäuse nach dem Zufallsprinzip auf zwei Gruppen und halten Sie sie 1 Woche lang in Käfigen mit maximal fünf Mäusen pro Käfig unter einem Standardzyklus von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkel.</li>
	<li>Versorgen Sie die Mäuse mit ausreichend Futter und Wasser und halten Sie sie auf einer konstanten Temperatur von 25 °C.</li>
</ol>2. ChP-spezifischer Knockdown von A2ARs mit AAV2/5-shRNA
<ol><li>Wiegen Sie jede Maus und notieren Sie sich die Werte.</li>
	<li>Betäuben Sie die Mäuse intraperitoneal mit 1% Pentobarbital-Natrium in einer Dosierung von 6-8 ml/kg, was 60-80 mg/kg Pentobarbital entspricht, und legen Sie die Maus auf ein Heizkissen, um sie warm zu halten. HINWEIS: Es ist wichtig, die richtige Dosierung von Pentobarbital-Natrium entsprechend dem Gewicht der Maus zu verabreichen, um eine erfolgreiche Operation zu gewährleisten. Die Anästhesie sollte nicht zu tief sein, da dies zur Sterblichkeit führen kann, aber auch nicht zu flach, da die Maus während des Eingriffs aufwachen und die Wirksamkeit der Virusinjektion beeinträchtigen könnte. Überprüfen Sie die richtige Anästhesiedosis, indem Sie die Zehen zusammenkneifen und sicherstellen, dass die Mäuse nicht ansprechen.</li>
	<li>Verwenden Sie einen speziellen Mausrasierer, um die oberen Haare der betäubten Mäuse zu trimmen.</li>
	<li>Tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern, und fixieren Sie die Mäuse auf einem stereotaktischen Apparat, um das Gehirn zu immobilisieren. Decken Sie das Tier mit einem sterilen Tuch ab.</li>
	<li>Sterilisieren Sie die Haut von Kopf und Hals der Mäuse gründlich mit drei Runden Jodophor-Desinfektionsmittel und 75%igem Alkohol, um die postoperative Infektion zu reduzieren. Tragen Sie dann 1% Lidocain topisch auf die Kopfhaut von Mäusen auf und machen Sie einen kleinen Schnitt, um den Schädel unter einem Mikroskop vollständig freizulegen. HINWEIS: Verwenden Sie während des gesamten Eingriffs sterile Instrumente.</li>
	<li>Bereiten Sie zwei 10-μl-Spritzen vor: eine mit gekaufter AAV2/5-A 2A R-shRNA (Titer: 6,27 × 10 9 vg/μl) und die andere mit gekauftem AAV2/5-Scramble (Titer:6,21× 109 vg/μl). HINWEIS: Bei Verwendung der Spritze muss das vordere Ende an eine Glaskapillare angeschlossen werden, und ein Bereich von 10 μl kann durch Steuerung der Länge der Glaskapillare erreicht werden.</li>
	<li>Verwenden Sie das Mikroskop, um das Bregma und das Lambda zu lokalisieren und den Koordinatenpunkt einzustellen (AP: -0,58; ML: ±1,10; DL: -2,20) auf der 10-μl-Spritze (Abbildung 1). Der Koordinatenpunkt basiert auf dem stereotaktischen Atlas15 des Mäusegehirns.</li>
	<li>Bohren Sie am angepassten Koordinatenpunkt ein kleines Loch in den Schädel. HINWEIS: Unter dem Mikroskop wird mit einem sterilen Mikrobohrer gegen die Oberfläche des Schädels gebohrt. Nach dem Bohren wird durch die Entfernung der Hirnhäute, die das Gehirn bedecken, und die Freilegung des darunter liegenden Hirnparenchyms eine Verletzung der Blutgefäße verhindert. Dieser Schritt verhindert, dass die Spitze der Glaskapillare durch die Hirnhäute abgebrochen wird. Der Durchmesser des Bohrlochs sollte ausreichend sein, damit die Nadelspitze in das Hirngewebe eindringen kann.</li>
	<li>Verabreichung von 2 μl AAV2/5-A2AR-shRNA-Virus in die Hirnkammer durch laterale Injektion mit einer konstanten Rate von 100 nL/min. Halten Sie die Nadel 10 Minuten lang an Ort und Stelle, bevor Sie sie zurückziehen. Beachten Sie, dass das Virus mit einseitiger Injektion verabreicht wurde.</li>
	<li>Versiegeln Sie die verletzte Haut umgehend mit medizinischem Biofibrin-Kleber, um Virusverlust zu verhindern, der nach dem Entfernen der Nadel mit Liquor ausgespült werden kann, wenn der Kleber nicht schnell aufgetragen wird. Verwenden Sie auch keine Wattestäbchen, um den Liquor abzuwischen, da dies ebenfalls zu Virenverlust führen kann.</li>
	<li>Um die Regeneration zu erleichtern, legen Sie die Maus auf ein Heizkissen, um die Körpertemperatur bei 37,0 ± 0,5 °C zu halten, und tragen Sie 1% Lidocain topisch auf die Kopfhaut der Maus auf. Lassen Sie die Mäuse 2 Wochen lang erholen, bevor Sie das EAE-Modell induzieren, da dieser Zeitraum für die Expression des AAV2/5-A 2A R-shRNA-Virus und den anschließenden A2AR-Knockdown erforderlich ist.</li>
</ol>3. ChP-spezifischer Knockdown von A2AR mit einem Cre/Locus von X-overP1 (Cre/LoxP) System
HINWEIS: Die folgenden Verfahren können mit der zuvor beschriebenen Methode erreicht werden. In den Schritten 2.1 bis 2.11 finden Sie detaillierte Informationen zu den Injektionsmethoden.
<ol><li>Injizieren Sie 2 μl CRE-TAT-Rekombinase in jeden Seitenventrikel einer Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato-Maus als Versuchsgruppe und 2 μl sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) als Kontrollgruppe. Unter Verwendung des gleichen Protokolls wie oben (Abschnitt 2) werden 2 μl CRE-TAT-Rekombinase in jeden der lateralen Ventrikel von A2AR-Flox/Flox-Mäusen zusammen mit 2 μl sterilem PBS als Kontrollgruppe injiziert.</li>
	<li>Bereiten Sie gefrorene Gewebeschnitte vor und führen Sie 2 Wochen nach der CRE-TAT-Rekombinase-Injektion eine Kernfärbung durch. Weitere Informationen finden Sie in den Schritten 4.1 bis 4.3.</li>
</ol>4. Transkardiale Perfusion bei Mäusen
<ol><li>Verabreichen Sie 60-80 mg/kg Pentobarbital-Natrium, um die Mäuse tief zu betäuben. Bestätigen Sie die Anästhesieebene durch eine Zehenkneifung und führen Sie eine transkardiale Perfusion mit 40 ml steriler PBS-Lösung gefolgt von 20 ml 4%igem Paraformaldehyd (PFA) durch. HINWEIS: Eine erfolgreiche Perfusion wird durch eine weiße Farbe in der Leber angezeigt, während das Vorhandensein einer vergrößerten Lunge oder eines PBS-Abflusses aus dem Mund während der Perfusion auf ein Versagen des Verfahrens hindeutet.</li>
	<li>Schnelles Extrahieren des Mäusegehirns, um einen minimalen Proteinabbau zu gewährleisten.</li>
	<li>Tauchen Sie das Mäusegehirn über Nacht zur Nachfixierung in 4 % PFA/PBS ein, gefolgt von einem Ersatz durch 30 % Saccharose-PB-Lösung für 72 Stunden. HINWEIS: Es ist wichtig, eine übermäßige Dehydrierung des Hirngewebes zu vermeiden, daher sollte das Gehirn nicht zu lange in der Saccharose-PB-Lösung belassen werden.</li>
</ol>5. Schneiden und Färben von gefrorenem Gewebe
<ol><li>Betten Sie das zuvor dehydrierte Mäusegehirn in OCT-Kleber (Optimum Cutting Temperature) ein, frieren Sie das eingebettete Gehirn ein und schneiden Sie mit einem gleitenden Mikrotom koronale Schnitte mit einer Dicke von 20 μm.</li>
	<li>Legen Sie die Hirnabschnitte auf den Objektträger. Sobald die Hirnabschnitte getrocknet sind, lagern Sie sie für nachfolgende Experimente in einem -20 °C heißen Kühlschrank.</li>
	<li>Legen Sie jeden Objektträger in ein Rahmengehäuse und tauchen Sie den Rahmen in einen mit PBS gefüllten Behälter, um den Objektträger gründlich abzuspülen. Spülen Sie die Objektträger dreimal vorsichtig mit PBS-Lösung ab, jeweils 10 Minuten lang. HINWEIS: Es ist Vorsicht geboten, um zu verhindern, dass die Hirnabschnitte vom Objektträger fallen.</li>
	<li>Färben Sie die Objektträger 10 Minuten lang mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Lösung.</li>
	<li>Spülen Sie die Objektträger 5 Minuten lang mit PBS-Lösung.</li>
	<li>Tragen Sie einen Tropfen Antifade-Eindeckmittel auf die Gehirnabschnitte auf.</li>
	<li>Legen Sie ein Deckglas auf die Hirnschnitte, versiegeln Sie das Deckglas mit Nagellack und analysieren Sie die Schnitte mit einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop.</li>
</ol>6. EAE-Induktion
HINWEIS: Führen Sie die EAE-Induktion nach 2 Wochen der shRNA- oder CRE-TAT-Rekombinase-Injektiondurch 11.
<ol><li>Stellen Sie eine wässrige Lösung her, indem Sie 2,5 mg Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG35-55) mit 2 ml PBS mischen. Bereiten Sie eine vollständige Freunds-Adjuvans-Öllösung (CFA) vor, indem Sie M. tuberculosis (H37Ra) mit unvollständigem Freunds-Adjuvans (IFA) mischen.</li>
	<li>Mischen Sie die wässrige und die Öllösung im Verhältnis 1:1. Verwende ein T-Rohr, um die Mischung in einen Öl-in-Wasser-Zustand zu bringen. HINWEIS: Das T-Rohr wird auch als Dreiwegerohr bezeichnet. Es handelt sich um ein Kunststoffrohr, das die Richtung der fließenden Lösung steuern kann, um MOG35-55 und CFA vollständig zu mischen.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Hochgeschwindigkeits-Homogenisator, um die MOG-Antigen-Emulsion für das EAE-Modell unter Eisbadbedingungen herzustellen.</li>
	<li>Die Mäuse werden intraperitoneal mit 1% Pentobarbital-Natrium in einer Dosierung von 6-8 ml/kg entsprechend 60-80 mg/kg Pentobarbital anästhesiert.</li>
	<li>Subkutan injizieren Sie die MOG-Antigen-Emulsion in vier verschiedene Punkte (Nacken, Rücken, linke und rechte Hüfte) in einem Volumen von 10 ml/kg für jeweils vier Injektionen. HINWEIS: Es ist wichtig, die Injektionsstelle sorgfältig auszuwählen, da verschiedene Stellen unterschiedliche Auswirkungen auf die Morbidität und Mortalität von Mäusen haben können. Darüber hinaus können wiederholte MOG-Injektionen zu einer Immuntoleranz führen, so dass das Forschungsteam eine einzige Injektionsmethode wählte, um dieses potenzielle Problem zu verhindern.</li>
	<li>Nach der MOG-Injektion werden sofort 500 ng/ml Pertussistoxin (PT) intraperitoneal in einer Dosierung von 5 mg/kg injiziert. HINWEIS: PT erhöht die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke (BHS) und erleichtert die Infiltration von T-Zellen in das Gehirn.</li>
	<li>Nach 48 h wird die PT-Lösung im gleichen Volumen intraperitoneal injiziert.</li>
</ol>7. Neurologischer Defizit-Score
<ol><li>Bewerten und bewerten Sie die Mäuse täglich anhand einer Bewertungsskala16 von 0 bis 15, um die Inzidenz und den Schweregrad von EAE anhand der folgenden neurologischen Defizite zu beurteilen: Schwanz: 0 zeigt keine Anzeichen an, 1 steht für einen halb gelähmten Schwanz und 2 für einen vollständig gelähmten Schwanz. Gliedmaßen: 0 steht für keine Anzeichen, 1 für einen schwachen oder veränderten Gang, 2 für Parese und 3 für eine vollständig gelähmte Gliedmaße.</li>
	<li>Weisen Sie einem querschnittsgelähmten Tier mit vollständiger Lähmung einen Wert von 12 zu und weisen Sie der Mortalität einen Wert von 15 zu.</li>
</ol>8. Hämatoxylin-Eosin (H&E)-Färbung
<ol><li>Nimm das dehydrierte Mäusegehirn und bette es in geschmolzenes Paraffin ein. Lassen Sie den Paraffinblock abkühlen und für die spätere Verwendung fest werden. HINWEIS: Der Paraffinblock sollte vollständig trocken und kühl sein, um Gewebeschäden zu vermeiden.</li>
	<li>Schneiden Sie den Paraffinblock für das Mäusegehirn in 5 μm dicke Objektträger. Den Paraffin-Mäuse-Hirnschnitt auf einen Objektträger legen und im 60 °C heißen Ofen 3 h trocknen.</li>
	<li>Tauchen Sie die Objektträger nacheinander für 10 Minuten in Xylollösung I, Xylollösung II für 10 Minuten, 100% Alkohol I für 3 Minuten, 100% Alkohol II für 3 Minuten, 95% Alkohol für 3 Minuten, 90% Alkohol für 3 Minuten, 80% Alkohol für 3 Minuten, 70% Alkohol für 3 Minuten und destilliertes Wasser für 1 Minute.</li>
</ol>9. Quantitative Analyse der Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)
<ol><li>Nachdem Sie die Mäuse mit PBS durchblutet haben, entfernen Sie das ChP aus den Ventrikeln und extrahieren Sie die RNA mit Trizol. Synthetisieren Sie die cDNA mit dem ersten Strang-cDNA-Synthesekit.</li>
	<li>Führen Sie die qPCR-Analyse mit Ex Taq SYBR-green Premix und einem Real-Time-PCR-System durch. Verwenden Sie die folgenden A2AR-Primer: vorwärts - GCCATCCCATTCGCCATCA; umgekehrt - GCAATAGCCAAGAGGCTGAAGA.</li>
</ol>

Selektives Gen-Silencing im Plexus choroideus

<ol><li>Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+secretion+by+the+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus.</a> Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).</li>
<li>Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+functions+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).</li>
<li>Wolburg, H., Paulus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus%3A+biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus: biology and pathology.</a> Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).</li>
<li>Solar, P., Zamani, A., Kubickova, L., Dubovy, P., Joukal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus and the blood-cerebrospinal fluid barrier in disease.</a> Fluids Barriers CNS. 17 (1), 35(2020).</li>
<li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+plexus+in+health+and+in+disease%3A+dialogues+into+and+out+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain.</a> Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).</li>
<li>Myung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+plexus+is+an+important+circadian+clock+component%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The choroid plexus is an important circadian clock component.</a> Nature Communications. 9 (1), 1062(2018).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+FOXJ1-Cre+system+for+gene+inactivation+in+ciliated+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A transgenic FOXJ1-Cre system for gene inactivation in ciliated epithelial cells.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (5), 515-519 (2007).</li>
<li>Johansson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Otx2+regulates+choroid+plexus+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Otx2 regulates choroid plexus development and function.</a> Development. 140 (5), 1055-1066 (2013).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus+NKCC1+mediates+cerebrospinal+fluid+clearance+during+mouse+early+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus NKCC1 mediates cerebrospinal fluid clearance during mouse early postnatal development.</a> Nature Communications. 12 (1), 447(2021).</li>
<li>Spatazza, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid-plexus-derived+Otx2+homeoprotein+constrains+adult+cortical+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Choroid-plexus-derived Otx2 homeoprotein constrains adult cortical plasticity.</a> Cell Reports. 3 (6), 1815-1823 (2013).</li>
<li>Zheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus-selective+inactivation+of+adenosine+A2A+receptors+protects+against+T+cell+infiltration+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus-selective inactivation of adenosine A2A receptors protects against T cell infiltration and experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 52(2022).</li>
<li>Steffensen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotransporter-mediated+water+transport+underlying+cerebrospinal+fluid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cotransporter-mediated water transport underlying cerebrospinal fluid formation.</a> Nature Communications. 9 (1), 2167(2018).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Klotho+controls+the+brain-immune+system+interface+in+the+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Klotho controls the brain-immune system interface in the choroid plexus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (48), E11388-E11396 (2018).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+serotypes+of+adeno-associated+virus+vector-+and+lentivirus-mediated+tropism+in+choroid+plexus+by+intracerebroventricular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Different serotypes of adeno-associated virus vector- and lentivirus-mediated tropism in choroid plexus by intracerebroventricular delivery.</a> Human Gene Therapy. 31 (7-8), 440-447 (2020).</li>
<li>Konsman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">The mouse brain in stereotaxic coordinates.</a> Psychoneuroendocrinology. 6 (28), 827-828 (2003).</li>
<li>Weaver, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+elevated+matrix+metalloproteinase+%28MMP%29+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis+is+protective+by+affecting+Th1%2FTh2+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">An elevated matrix metalloproteinase (MMP) in an animal model of multiple sclerosis is protective by affecting Th1/Th2 polarization.</a> FASEB J. 19 (12), 1668-1670 (2005).</li>
<li>Kertser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticosteroid+signaling+at+the+brain-immune+interface+impedes+coping+with+severe+psychological+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress.</a> Science Advances. 5 (5), 4111(2019).</li>
<li>Kaiser, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEIS-WNT5A+axis+regulates+development+of+fourth+ventricle+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus.</a> Development. 148 (10), (2021).</li>
<li>Compston, A., Coles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis.</a> Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).</li>
<li>Reboldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-C+chemokine+receptor+6-regulated+entry+of+TH-17+cells+into+the+CNS+through+the+choroid+plexus+is+required+for+the+initiation+of+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">C-C chemokine receptor 6-regulated entry of TH-17 cells into the CNS through the choroid plexus is required for the initiation of EAE.</a> Nature Immunology. 10 (5), 514-523 (2009).</li>
<li>Jovanova-Nesic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus+connexin+43+expression+and+gap+junction+flexibility+are+associated+with+clinical+features+of+acute+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus connexin 43 expression and gap junction flexibility are associated with clinical features of acute EAE.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1173, 75-82 (2009).</li>
<li>Jovanova-Nesic, K., Jovicic, S., Sovilj, M., Spector, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+brain+stimulation+upregulates+adhesion+and+prevents+Eae%3A+MMP-2%2C+ICAM-1%2C+and+VCAM-1+in+the+choroid+plexus+as+a+target%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Magnetic brain stimulation upregulates adhesion and prevents Eae: MMP-2, ICAM-1, and VCAM-1 in the choroid plexus as a target.</a> International Journal of Neuroscience. 119 (9), 1399-1418 (2009).</li>
<li>Mills, J. H., Alabanza, L. M., Mahamed, D. A., Bynoe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+adenosine+signaling+induces+CX3CL1+expression+in+the+brain+to+promote+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Extracellular adenosine signaling induces CX3CL1 expression in the brain to promote experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 193(2012).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Offenlegungen zu deklarieren haben.

In der Studie wurden zwei unterschiedliche Ansätze für den gezielten Knockdown von ChP-Genen vorgestellt. Der erste Ansatz beinhaltete die ICV-Injektion von CRE-TAT, das Cre-Rekombinase enthält, in A2AR-Flox/Flox-Mäuse. Der zweite Ansatz beinhaltete die ICV-Injektion von AAV2/5, das shRNA von A2AR trägt. Durch die Verwendung dieser beiden Strategien gelang es der selektiven Knockdown von A 2A R innerhalb der ChP und konnte die schützende Wirkung der Hemmung des A2AR-Signalwegs ...

Es wurde oft angenommen, dass der Plexus choroideus (ChP) zur Aufrechterhaltung der funktionellen Homöostase des Gehirns beiträgt, indem er Liquor cerebrospinalis (CSF) und den vom Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktor (BDNF) sezerniert1,2. Zunehmende Forschung in den letzten drei Jahrzehnten hat gezeigt, dass das ChP einen eindeutigen Weg für die Infiltration von Immunzellen in das zentrale Nervensystem (ZNS) darstellt.
Die Tight Junctions (TJs) des ChP, die aus einem monoschichtigen ChP-Epithel bestehen, halten die immunologische Homöostase aufrecht, indem sie verhindern, dass Makromoleküle und Immunzellen in das Gehirn eindringen3. Unter bestimmten pathologischen Bedingungen erkennt und reagiert das ChP-Gewebe jedoch auf gefahrenassoziierte molekulare Muster (DAMPs) im Liquor und im Blut, was zu einer abnormalen Immuninfiltration und einer Dysfunktion des Gehirns führt 4,5. Trotz seiner entscheidenden Rolle machen es die geringe Größe und die einzigartige Lage des ChP im Gehirn schwierig, seine Funktion zu untersuchen, ohne andere Gehirnregionen zu beeinträchtigen. Daher ist die spezifische Manipulation der Genexpression im ChP ein idealer Ansatz, um seine Funktion zu verstehen.
Ursprünglich wurden transgene Linien von Cyclisierungsrekombinationsenzymen (Cre), die Cre unter der Kontrolle von Promotoren exprimieren, die für Gene spezifisch sind, die in der ChP exprimiert werden, verwendet, um Zielgene durch Züchtung mit floxierten Kandidatengenen zu löschen 6,7,8. Zum Beispiel wird der Transkriptionsfaktor Forkhead box J1 (FoxJ1) ausschließlich im ChP-Epithel des pränatalen Mäusegehirns exprimiert7. So wurde die FoxJ1-Cre-Linie häufig verwendet, um Gene zu löschen, die sich im ChP 6,9 befinden. Der Erfolg dieser Strategie hängt jedoch stark von der Spezifität des Projektträgers ab. Nach und nach wurde entdeckt, dass das FoxJ1-Expressionsmuster nicht ausgeprägt genug war, da FoxJ1 auch in Flimmerepithelzellen in anderen Teilen des Gehirns und des peripheren Systems vorhanden war7. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde eine intrazerebroventrikuläre (ICV) Injektion von Cre-Rekombinase durchgeführt, um Rekombinase in die Ventrikel von gefloxten transgenen Linien zu bringen. Diese Strategie zeigte eine hohe Spezifität, was durch das Vorhandensein von tdTomato-Fluoreszenz allein im ChP-Gewebe belegtwird 10,11. Diese Methode ist jedoch noch durch die Verfügbarkeit von floxierten transgenen Mauslinien begrenzt. Um dieses Problem anzugehen, haben Forscher die ICV-Injektion des Adeno-assoziierten Virus (AAV) eingesetzt, um einen ChP-spezifischen Knockdown oder die Überexpression von Zielgenen zu erreichen12,13. Eine umfassende Untersuchung verschiedener AAV-Serotypen für eine ChP-Infektion ergab, dass AAV2/5 und AAV2/8 starke Infektionsfähigkeiten in der ChP aufweisen, während sie andere Hirnregionen nicht infizieren. Es wurde jedoch festgestellt, dass AAV2/8 das Ependym um die Ventrikel herum infizierte, während die AAV2/5-Gruppe keine Infektion aufwies14. Diese Methode hat den Vorteil, dass sie die Einschränkungen beim Erwerb von transgenen Tieren überwindet.
Dieser Artikel beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für den Gen-Knockdown im ChP mit zwei Methoden: ICV von AAV2/5, das shRNA des Adenosin-A2A-Rezeptors (A 2A R) trägt, und Cre-Rekombinase-Protein, das aus einer TAT-Sequenz (CRE-TAT)-Rekombinase besteht, um einen ChP-spezifischen Knockdown von A2A R zu erreichen. Die Studienergebnisse deuten darauf hin, dass der Abbau von A2AR in der ChP die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) lindern kann. Dieses detaillierte Protokoll bietet nützliche Hinweise für ChP-Funktionsstudien und den spezifischen Knockdown von Genen im ChP.

<table><tbody><tr><td>A2ARflox/flox Mäuse</td><td>State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV2/5-A2AR-ShRNA-Virus</td><td>Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD</td><td>pt-4828</td><td></td></tr><tr><td>Antifade-Einbettmedium</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikatglas Kapillare</td><td>Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd</td><td>B100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Gehirn stereotaktische Apparatur</td><td>RWD, Shenzhen</td><td>69100</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 Mäuse</td><td>Beijing Vital Charles River Labor Animal Technology Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CRE-TAT Rekombinase</td><td>Millipore</td><td>SCR508</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Absin</td><td>B25A031</td><td></td></tr><tr><td>Schneidemaschine für Tiefkühlprodukte</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>H37Ra</td><td>Becton Dickinson and company</td><td>231141</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Spritze</td><td>Hamilton, American</td><td>P/N:&nbsp; 86259</td><td></td></tr><tr><td>unvollständig Freunds Adjuvans</td><td>Sigma</td><td>F5506</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Lasermikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM900</td><td></td></tr><tr><td>MOG35-55</td><td>Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., Ltd</td><td>4010006243</td><td></td></tr><tr><td>OCT Kleber</td><td>Epredia</td><td>6502p</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Chengdu Kelong Chemisches Reagenz Unternehmen</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital-Natrium</td><td>Boyun Biotech PC13003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettenpistole</td><td>Eppendorf</td><td>N45014F</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit</td><td>Takara</td> <td>& 6110A</td><td></td></tr><tr><td>Real-Time PCR System</td><td>BioRad</td><td>CFX96</td><td></td></tr><tr><td>Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato Mäuse</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sangon Biotech</td><td>A502792-0500</td><td></td></tr><tr><td>Super-High-Speed-Homogenisator</td><td>IKA</td><td>3737025</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Xylollösung</td><td>Chengdu Kelong Unternehmen für chemische Reagenzien</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr></tbody></table>

gezielter knockdown von genen im plexus aderoid

Targeted Knockdown of Genes in the Choroid Plexus

Der Plexus choroideus (ChP) dient sowohl unter physiologischen als auch unter pathologischen Bedingungen als kritisches Einfallstor für die Infiltration von Immunzellen in das zentrale Nervensystem (ZNS). Neuere Forschungen haben gezeigt, dass die Regulierung der ChP-Aktivität Schutz vor ZNS-Erkrankungen bieten kann. Die biologische Funktion des ChP zu untersuchen, ohne andere Hirnregionen zu beeinträchtigen, ist jedoch aufgrund seiner empfindlichen Struktur eine Herausforderung. In dieser Arbeit wird eine neue Methode zum Gen-Knockdown in ChP-Gewebe unter Verwendung von Adeno-assoziierten Viren (AAVs) oder Cyclisierungsrekombinationsenzymen (Cre)-Rekombinase-Proteinen, bestehend aus TAT-Sequenzen (CRE-TAT), vorgestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass nach der Injektion von AAV oder CRE-TAT in den lateralen Ventrikel die Fluoreszenz ausschließlich im ChP konzentriert war. Mit diesem Ansatz gelang es in der Studie, den Adenosin-A2A-Rezeptor (A2A R) im ChP mithilfe von RNA-Interferenz (RNAi) oder Cre/Locus von X-overP1 (Cre/LoxP)-Systemen auszuschalten, und zeigte, dass dieser Knockdown die Pathologie der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) lindern könnte. Diese Technik könnte wichtige Implikationen für die zukünftige Forschung über die Rolle des ChP bei ZNS-Erkrankungen haben.

ChP-spezifischerA2AR-Knockdown durch ICV-Injektion von AAV2/5-shRNA oder CRE-TAT Die Rolle von A2AR in der ChP als mächtiger Regulator neuronaler Information in der EAE-Pathogenese bleibt unklar. Das Ausschalten der ChP-spezifischen A 2A R-Expression könnte Aufschluss über die regulatorischen Auswirkungen von A2AR auf das zentrale Immunsystem bei EAE und anderen Entzündungen des Nervensystems geben. In dieser Studie wurde die ICV-Injektion von CRE-TAT verwen...

Hier beschreiben wir eine Methode, um die Genexpression im Plexus choroideus selektiv zu verändern und gleichzeitig Auswirkungen auf andere Hirnareale zu vermeiden.

Gezielter Knockdown von Genen im Plexus aderoid

The choroid plexus (ChP) serves as a critical gateway for immune cell infiltration into the central nervous system (CNS) under both physiological and ...

Das Ziel dieser Forschung ist es, die Techniken zur Manipulation der Genexpression im Plexus choroideus zu untersuchen. Unsere Studie hat die beiden Methoden vorgestellt, die eine Technik ausschließlich im Plexus choroideus ohne erkennbare Auswirkungen auf andere Regionen ermöglichen. Unsere Ergebnisse können möglicherweise zukünftige Funktionsstudien des Plexus choroideus in den Neurowissenschaften verbessern.Unsere Forschung hat gezeigt, dass die Hemmung der T-Zell-Infiltration über den Aderhautplexus durch selektiven Lockdown von Adenosin an einen Rezeptor ausreicht, um Mäuse vor der EAE-Pathologie zu schützen. Dieser Befund stützt die Vorstellung, dass der Nachweis der Gateway-Aktivität im Plexus choroideus eine vielversprechende neue Strategie zur Behandlung von Multipler Sklerose darstellen könnte. In dieser Studie werden zwei alternative Methoden zur Manipulation der Genexpression im Plexus choroideus vorgestellt.ICV-Injektion von Cre-Rekombinase in diese transgenen Mäuse oder ICV-Injektion von AAV2/5 oder gezielte SHI in den WT-Mäusen. Diese Methoden überwinden Probleme bei der Förderung der Spezifität und der transgenetischen Mauszucht.

targeted-knockdown-of-genes-in-the-choroid-plexus

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Eine Methode, bedingt Knockdown ein Zielprotein Ausdruck in der erwachsenen Zebrafisch Retina beschrieben, das geht intravitreal Injektion antisense Morpholinos und Elektroporation sie in der Netzhaut. Das resultierende Protein ist für mehrere Tage, die Prüfung des Proteins Rolle bei der Regeneration oder intakten Netzhaut ermöglicht klopfte.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in die Adult Zebrafisch Retina

In diesem Video demonstrieren wir eine Methode zur Transduktion von lentiviralen shRNA-Vektoren, um stabile Knockdown-Zelllinien in immortalisierten hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (iHSPCs) zu erhalten.

Short Hairpin RNA-vermittelter Gen-Knockdown in iHSPCs in vitro: Ein Lentivirus-basiertes shRNA-Expressionssystem zur Verabreichung in iHSPCs für den Knockdown der spezifischen Genexpression

Wir zeigen eine minimal-invasive Technik genannt Neugeborenen Subventrikulärzone Elektroporation. Die Technik besteht aus Einspritzen Plasmid-DNA in den lateralen Ventrikel neonataler Welpen und Anlegen von elektrischem Strom zu liefern und genetisch zu manipulieren...

Neonatal Subventrikulärzone Elektroporation

In diesem Artikel zeigen wir ein Verfahren zur Manipulation der Genexpression in den Zellen des ventrikulären erwachsenen Zebrafisch telencephalon Verwendung von Antisense-Morpholino-Oligonukleotide. Wir präsentieren diese Methode als eine effiziente und schnelle Protokoll, das für funktionelle Studien in der erwachsenen Gehirn von Wirbeltieren eingesetzt werden können.

Mikromanipulation der Genexpression in der Erotik-Zebrafischgehirn Mit cerebroventricular Mikroinjektion von Morpholino Oligonukleotiden

Reporterzelllinien bieten ein Mittel, um zu visualisieren, zu verfolgen und zu isolieren Zellen von Interesse aus heterogenen Populationen. Jedoch Gen-Targeting unter Verwendung von herkömmlichen homologen Rekombination in embryonalen Stammzellen äußerst ineffizient. Hier beschreiben wir Targeting ZNS Mittelhirn spezifischen Transkriptionsfaktor PITX3 Ortes mit EGFP mit Zink-Finger-Nuklease verbesserte homologe Rekombination.

Zinkfinger-Nuklease Verbesserte Gene Targeting in humanen embryonalen Stammzellen

Periventrikulären noduläre Heterotopie (PNH) ist die häufigste Form der Fehlbildung der kortikalen Entwicklung (MCD) im Erwachsenenalter, aber seine genetische Basis bleibt bei den sporadischen Fällen unbekannt. Vor kurzem haben wir eine Strategie, um neue Kandidatengene für MCDs zu identifizieren und direkt ihre ursächliche Rolle in Vivobestätigen.

Eine neuartige Strategie verbindet Array-CGH, ganze Exome Sequenzierung und In Utero Elektroporation bei Nagetieren verursachenden Gene für Hirnfehlbildungen identifizieren

Dieses Protokoll enthält einen Workflow, künstliche MicroRNA-vermittelten RNA-Interferenz mit Optogenetik Förderung insbesondere präsynaptischen Boutons mit reduzierten Expression von selektiven-Gens in intakte neuronale Schaltkreise zu kombinieren.

Kombination von Optogenetik mit künstlichen Mikro-RNAs, die Effekte gen Knockdown präsynaptischen Funktion innerhalb intakte neuronale Schaltkreise zu charakterisieren

In der vorliegenden Studie wird die Expression von zwei nachgeschalteten Signalkomponenten des PERK-Signalwegs, dem zytoprotektiven Calcineurin und dem pro-apoptotischen CHOP, unter Verwendung spezifischer shRNAs abgeschaltet. Auf entgegengesetzte Weise modulieren diese die Anfälligkeit primärer kortikaler Neuronen für Neuritenatrophie nach Induktion von endoplasmatischem Retikulumstress.

Molekulare Modulation durch Lentivirus-gelieferte spezifische shRNAs in endoplasmatischen Retikulum-gestressten Neuronen

Wir haben einen neuartigen Loss-of-Function-Ansatz entwickelt, der die Einführung und genomische Integration künstlicher Mikro-RNA-Sequenzen in Kükenembryonen unter Verwendung der In-ovo-Elektroporation und des Tol2-Transposon-Systems beinhaltet. Diese Technik bietet eine robuste und stabile Gen-Knockdown-Methode für Studien der Genfunktion während der Entwicklung.

Loss-of-Function-Ansatz in der embryonalen Küken-Netzhaut unter Verwendung von Tol2-Transposon-vermittelter transgener Expression künstlicher microRNAs

Die Elektroporation von Hirnorganoiden von Primaten bietet einen präzisen und effizienten Ansatz, um transiente genetische Modifikationen in verschiedene Vorläufertypen und Neuronen in einem Modellsystem einzuführen, das der (patho)physiologischen Neokortexentwicklung von Primaten nahe kommt. Dies ermöglicht die Untersuchung neurologischer Entwicklungs- und Evolutionsprozesse und kann auch für die Modellierung von Krankheiten eingesetzt werden.

Gezielte Mikroinjektion und Elektroporation von Hirnorganoiden von Primaten zur genetischen Modifikation

Hier stellen wir die akute genetische Manipulation von geschnittenen menschlichen kortikalen Organoiden durch Elektroporation vor. Diese kortikalen Organoidmodelle eignen sich besonders gut für die Injektion, da ventrikelähnliche Strukturen nach dem Schneiden leicht identifiziert werden können, was die funktionelle Untersuchung der kortikalen Entwicklung des Menschen, neurologischer Entwicklungsstörungen und der kortikalen Evolution ermöglicht.

Elektroporation von geschnittenen humanen kortikalen Organoiden zur Untersuchung der Genfunktion

Erfahren Sie Methoden zum gezielten Gen-Knockdown im Plexus choroideus mit ICV-Injektionen und AAV2/5-Vektoren in Mausmodellen. Diese Technik ermöglicht spezifische Genmanipulation für Neurowissenschaften und Multiple-Sklerose-Forschung.

Gezielter Knockdown von Genen im Plexus aderoid

Weitere Videos entdecken