Name: マウスで誘導機械的異痛症の倹約神経損傷（SNI）モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 学ぶマウスにおける倹約神経損傷モデルを用いた誘導機械的異痛症の評価方法。坐骨神経の2枝を結紮・切断し、von Freyフィラメントで疼痛閾値を定量化することで、末梢神経障害性疼痛の機序解明や創薬研究に貢献します。

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この作品は、ルンドベック財団、カールスバーグ財団とダグマーマーシャル財団によってサポートされていました。

1。手術前にフォンフレイのベースライン測定フォンフレイテストの手順については、セクション5を参照してください。 2。麻酔/準備<ol><li>動物（ケタミンおよび15 mg / kgのキシラジンを100mg/kgの混合物の腹腔内注射）を麻酔。 </li><li> （例えば、紙タオルで覆われて）完全に麻酔まで、静かな場所で動物を置きます。 </li><li>ピンセットで尾の先端と足をつまんで反射神経をチェックしてください。動物が進む前に応答しないことを確認してください。 </li><li>皮下抗生物質、例えば、アンピシリン（脱水を避けるために、これは簡単な外科的処置であるが、感染を防ぐために）と（バック肩の部分）0.5ミリリットル等張食塩水を注入する。 </li><li>電気シェーバーを使用して、（右利きの人のために左後肢を推奨）をわずかに膝エリ​​アの下からヒップのエリアへの術野を削る。 </li><li>綿棒で目に眼軟膏を適用します。 </li><li>その右側に動物を配置し、それが上昇を維持するために小さなプラットフォーム上で左後肢を置きます。粘着テープで足を固定します。 </li><li>手術部位の外からエタノールとbetadineのスクラブを交互に術野を消毒する。 </li></ol> 3。手術<ol><li>左手の親指で膝の位置を確認し、アプリを作るためにメスを使用してください。膝への近位長手方向に1cmの切開。 </li><li>滅菌はさみの先端を使用して鈍的切開で皮膚を開きます。 </li><li>右はっきりと目に見える血管の隣の鈍的切開により筋層を分離、大腿骨（大腿骨）に近い。正しく行えば、筋肉の層は簡単に右の筋肉の下に坐骨神経を明らかに、あらゆる出血することなく分離されます。 出血が近くに膝に血管への損傷によって、例えば発生した場合は、血液を吸収するために滅菌綿、ウールの芽や視線の部分を使用。出血が止まるまで押します。 </li><li>実体顕微鏡下でマウスを置き、慎重に坐骨神経を可視化するために滅菌ピンセット（nr. 2）のペアで筋肉を区切ります。リトラクターを適用することもできる。 </li><li>坐骨神経からの腓腹神経の枝領域を識別します。腓腹神経は左足で右に分岐、三権の中で最小です。 </li><li>腓腹枝に触れないように非常に注意しながら、依然として並列で実行されている他の二つの枝の周り縫合糸を（6-0縫合糸）（脛骨と総腓骨神経）を適用します。腓腹神経は完全にそのままにする必要があるので、これは重要なステップです。 </li><li>タイトな外科的結び目を作る。第一結び目がタイトである場合は、四肢の収縮が観察されます。 </li><li>ピンセット（nr. 5） 縫合糸でカットする神経を持ってきて、はさみの小さなペアでピンセットの上下に神経を切る。ピンセット上記の最初のカットによって、神経の引き上げが避けられます。 </li><li>マイクロハサミで縫合の端をカットオフし、静かに筋層を閉じます。外科ノットで傷や縫合にリドカインのドロップを追加。 </li></ol> 4。手術後の<ol><li>眼軟膏はまだ十分であるかどうか確認して下さい。 </li><li>快適な姿勢でペーパータオルできれいなケージでマウスを置きます。部屋が冷えている場合、（のみ好ましい場合寒い地域に脱出することができるはずの動物のようなケージの一部の下で）ケージの一部の下に熱パッドを配置。 </li><li>簡単にアクセス可能な水と餌を確認してください。 </li></ol> 5。フォンフレイテスト（ベースライン、および手術後の日から） <ol><li>ワイヤーメッシュのテーブルに置かれた赤い色のプラスチック製のシリンダーが2日間、手術の前日にマウスを置きます。テスト前シリンダーで15分間慣らす。シリンダーの赤い色は、彼らがお互いを参照して暗い領域にあることができないようにマウスはすぐにリラックスするのに役立ちます。 </li><li>マウスが穏やかであることを確認して、足の外側部分にフォンフレイのフィラメントを適用する：0.02 gのフィラメントで起動すると、最初の30秒間（刺激あたり約2秒）の合計期間左足に5回の力を適用し、各アプリケーションの後にマウスの反応を測る。同じフィラメントと、他のマウスの左前足を繰り返してから、次のフィラメントなどに移る前に、最初にマウスの右前足をもう一度初めからやり直します。 <ul><li>マウス1：左足フィラメント0.02グラムで5回</li><li>マウス2：左足フィラメント0.02グラムなどで5回</li><li>マウス1：右足フィラメント0.02グラムで5回</li><li>マウス2：右足フィラメント0.02グラムなどで5回</li><li>マウス1：左足フィラメント0.04グラムで5回</li><li>マウス2：左足フィラメント0.04グラムなどで5回</li></ul></li><li> five刺激のうち3つの応答は、正反応とみなされます。 threshol上記フィラメントdは、しきい値レベルを確認するために適用することができます。 応答=突然の足の撤退、舐める突然尻込み、突然の足。 </li></ol> 6。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/3092/3092fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 80〜10週齢C57BL / 6マウスの年齢の図1。フォンフレイテストは、操作を繰り返し、次の手術前に1日を実施した。 4月8日の動物は、各グループに含まれていた。運営側のフォンフレイテストは、対で表される同側と非駆動制御側で表されます。非操作しながら動物が作動足に重大な過敏症を開発する手術の翌日にはほんのわずかに偽手術したマウスからの相対影響を受けます。 （* &lt;0.05、** &lt;0.01、*** &lt;0.001、対側同側の相対的な）。

<ol><li>Costigan, M., Scholz, J., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathic+pain%3A+a+maladaptive+response+of+the+nervous+system+to+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuropathic pain: a maladaptive response of the nervous system to damage.</a> Annu. Rev. Neurosci. 32, 1-32 (2009).</li>
<li>Decosterd, I., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spared+nerve+injury%3A+an+animal+model+of+persistent+peripheral+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Spared nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain.</a> Pain. 87, 149-158 (2000).</li>
<li>Bourquin, A. -F., Süveges, M., Pertin, M., Gilliar, N., Sardy, S., Davidson, A. C., Spahn, D. R., Decosterd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+and+analysis+of+mechanical+allodynia-like+behavior+induced+by+spared+nerve+injury+%28SNI%29+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Assessment and analysis of mechanical allodynia-like behavior induced by spared nerve injury (SNI) in the mouse.</a> Pain. 122, 14.e1-14.e14 (2006).</li>
<li>Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+tactile+allodynia+in+the+rat+paw%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw.</a> J. Neurosci. Methods. 53, 55-63 (1994).</li>
<li>Bennett, G. J., Xie, Y. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peripheral+mononeuropathy+in+rat+that+produces+disorders+of+pain+sensation+like+those+seen+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man.</a> Pain. 33, 87-107 (1988).</li>
<li>Seltzer, Z., Dubner, R., Shir, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+behavioral+model+of+neuropathic+pain+disorders+produced+in+rats+by+partial+sciatic+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">A novel behavioral model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury.</a> Pain. 43, 205-218 (1990).</li>
<li>Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+and+sensitive+method+for+measuring+thermal+nociception+in+cutanous+hyperalgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutanous hyperalgesia.</a> Pain. 32, 77-88 (1988).</li>
<li>Erichsen, H. K., Blackburn-Munro, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+characterization+of+the+spared+nerve+injury+model+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Pharmacological characterization of the spared nerve injury model of neuropathic pain.</a> Pain. 98, 151-161 (2002).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

重要なステップ腓腹神経の損傷は、脛骨と総腓骨神経の損傷後そのまま腓腹神経の病理学的変化を研究するために避けるべきである。腓腹神経への巻き添え被害が麻痺につながる可能性がありますので、操作後肢のドラッグとして可視化することができる。 足の唯一の側面は脇に置いて腓腹神経で神経支配と、それゆえ、唯一のこの領域は、神経障害を開発しています。 transected神経によって支配さ、他の領域のテスト、バイアス変更された機械的なしきい値の評価を強くできる。 実行可​​能な変更ライゲーションの他のタイプは、そのような慢性的収縮損傷などの末梢神経損傷後の病理学的な痛みの条件を研究するという点で補足、[5]または部分的な神経結紮[6]があります。前術後の試験に考慮すべき明確な表現型の変化の各実験操作の結果。 この表現型は少ない堅牢な以下のSNIですがさらに、そのような熱痛覚過敏のような他の感覚テストは、[7]を適用してもよい。 将来のアプリケーションこの技術は、機械的異痛症の開発や保守を変える薬物のテストに使用することができる[8]。坐骨神経の分析、後根神経節（DRG）および/または腰部脊髄は、誘導表現型の原因分子メカニズムの研究を可能にする。 動物実験は、デンマークとヨーロッパの規制に完全に準拠優良試験所の状況にしたがって実施した。全ての実験は、法務省（許可番号2006/561-1206）でデンマークの動物実験検査官によって承認された。

<table border="1"><tbody><tr><td>麻酔：ケタミンとキシラジン</td><td>外科用メス</td></tr><tr><td>眼軟膏</td><td>ピンセットNRのペア。 2 </td></tr><tr><td>電気かみそり</td><td>ピンセットNRのペア。 5 </td></tr><tr><td>手袋</td><td>鈍的切開用はさみ</td></tr><tr><td> 70％（v / v）エタノール</td><td>マイクロはさみ</td></tr><tr><td>コットンウールのつぼみ/視線</td><td> 6.0 Prolene非吸収性縫合糸</td></tr><tr><td>ステレオ顕微鏡</td><td> 2 ×針ホルダー</td></tr><tr><td>接着テープ</td><td>熱パッド</td></tr><tr><td colspan="2">フォンフレイフィラメント（0.02〜2.0グラムのマウス用）（Stoelting） </td></tr></tbody></table>

マウスで誘導機械的異痛症の倹約神経損傷（sni）モデル

The Spared Nerve Injury (SNI) Model of Induced Mechanical Allodynia in Mice

末梢神経因性疼痛は外傷から末梢神経系の感覚神経につながる可能性重度慢性疼痛治療​​の条件です。免れる神経損傷（SNI）モデルが原因で、通常痛みを伴う応答を誘発しない触覚刺激するような機械的異痛症すなわち痛などの神経因性疼痛の症状を誘導する[1]。 腓腹神経はそのまま残っている間、SNIのマウスモデルは、坐骨神経（脛骨神経と総腓骨神経）の三権の二つのライゲーションを含む[2]。脇に置いて腓腹神経によって支配されている足の外側の領域で著しい過敏症の病変の結果。マウスの非手術側を対照として使用することができます。 SNIモデルの利点は、応答の頑健性であり、それが専門家顕微スキルを必要としないこと。 機械的な疼痛反応のしきい値が繰り返し足の外側の領域に押圧されているの増加曲げ力のフォンフレイフィラメント、でテストすることによって決定される[3]、[4]。肯定的な痛みの反応は、フィラメントによって誘発されるなめると/または足を尻込み、突然の足の撤退として定義されています。 5人に3つの反復刺激の肯定応答は、疼痛閾値として定義されています。 ビデオのプロトコルで示すように、C57BL / 6マウスは、手術の翌日には早くも深遠な異痛症を経験し、数週間のためにこれを維持する。

免れる神経損傷の動物モデルは、残りの腓腹神経はそのままに、脛骨と総腓骨神経の枝をlesioningによって坐骨神経の部分的除神経以下の末梢神経因性疼痛のマウスモデルとしてここで説明されています。機械的異痛症に起因する行動修正は、von Freyのフィラメントによって定量化される。

マウスで誘導機械的異痛症の倹約神経損傷（SNI）モデル

末梢性神経障害性疼痛は、末梢神経系の感覚神経への外傷によって引き起こされる可能性のある、重篤な慢性疼痛疾患である。温存された...

この手順の全体的な目的は、末梢神経損傷後の神経性疼痛のマウスモデルを構築することです。まず、マウスを麻酔し、後肢を適切な位置に配置して坐骨神経を露出させることでこれを達成します。次に、坐骨神経の3本のうち2本の枝を縫合し、残り1本の枝をそのままにすることで、規定の神経損傷を導入します。このビデオでは、sorel神経を温存しながら、脛骨神経と総腓骨神経を縫合および切断します。ただし、神経損傷後に他の組み合わせを適用することも可能です。マウスを金網テーブル上の円筒形容器に入れ、馴化させた後、誘発された機械的アロディニアを定量的に測定できるVon Frey法を用いて検査します。校正済みのVon Freyフィラメントを、手術した足底部（paw）の外側に、強度の低い順に適用します。手術した後肢と未処置の後肢における機械的閾値を検出するため、フィラメント刺激時に、足底部の急速な引き込み、ひきつり、または足底部の舐め行動のいずれかが認められた場合を疼痛反応と定義します。最終的に、未処置側と比較して手術側で機械的アロディニアが発現したかどうかは、機械的閾値の経時的なグラフ化によって視覚的に確認でき、これにより末梢神経損傷後のさまざまな分子経路や薬物治療の検討が可能になります。この手法は、神経障害性疼痛の発生に関与する分子経路など、末梢神経損傷の分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。さらに、疼痛の発生を抑制または疼痛症状を緩和することを目的とした薬剤の試験にも適用可能です。手術の2日前から、マウスを静かな部屋の金網テーブル上に設置した赤色のプラスチック製シリンダーに入れます。テストの15分前にシリンダー内でマウスを馴化させ、15分後にマウスが落ち着いていることを確認した後、0.02 gのフィラメントから順に、von Freyフィラメントを昇順に適用します。まず、左後肢の側方に30秒間で計5回力を加え、適用ごとにマウスの反応を測定します。同じフィラメントを用いて別のマウスの左後肢でも同様に繰り返し、その後、次のフィラメントに移る前に右後肢で同様の操作を行います。陽性の疼痛反応は、フィラメントによって誘発される急激な足底の引き込み、趾の開いた状態、および／または過剰な足底の舐め動作と定義し、5回の繰り返し刺激のうち3回で陽性反応を示した場合を疼痛閾値と定義します。ケタミンとキシラジン混合液を腹腔内投与して動物を麻酔し、完全に麻酔がかかるまで静かな場所に置きます。尾の先端と足底をピンセットでつまんで反射を確認し、動物に反応がないことを確かめてから手順を進めてください。次に、脱水を避け、感染を防止するため、抗生物質を含む等張生理食塩水を0.5 milliliters皮下注射します。電気シェーバーを用いて、膝よりわずかに下の領域から股関節付近まで手術部位を剃毛します。右利きの場合、左後肢を操作するのが最も都合が良いと考えられます。綿棒を用いて眼に軟膏を塗布します。動物を右側臥位にし、左後肢を小さなプラットフォームに乗せて高く保持し、粘着テープで脚を固定します。動物の配置が完了したら、手術部位から外側に向かってエタノールとベタジンで交互に洗浄し、手術領域を消毒して乾燥させます。左手の親指で膝の位置を確認し、メスを用いて膝の近位側に縦方向に小さな切開を加えます。ハサミの先端を用いて鈍的に剥離し、皮膚を開きます。次に、マウスを実体顕微鏡下に置き、大腿骨付近にある視認しやすい血管を確認します。続いて、鈍的剥離によって筋肉層を分離します。正しく行われれば、出血なく容易に筋肉層が分離され、筋肉の直下にある坐骨神経が露出します。付近の血管の損傷により出血が生じた場合は、綿棒またはガーゼ片を用いて、止血するまで圧迫して血液を吸収させます。2番ピンセットを用いて、分離した筋肉層を慎重に広げます。坐骨神経を視認するために、必要に応じてリトラクターを適用し、腓腹神経が坐骨神経から分枝している部位を特定します。腓腹神経（sural nerve）は、左脚の右側に分かれる3本の分枝の中で最も細いものです。C57BL/6マウスにおいて、並行して走行している他の2本の分枝を6-0縫合糸で強く結紮します。その際、腓腹神経の分枝に触れないよう細心の注意を払ってください。5番ピンセットを用いて、縫合部より下方の切断する神経を把持し、神経の牽引を防ぐため、まずピンセットの上方、次に下方から小型の剪刀で切断します。神経を切断した後、剪刀で縫合糸の端を切り取り、慎重に筋層を閉鎖します。通常、リング縫合は必要ありません。創部にリドカインを1滴滴下し、外科結紮で縫合します。眼軟膏が十分に残っているかを確認し、マウスを清潔なケージに入れ、ペーパータオルを敷きます。マウスが快適な姿勢でいられるようにし、容易に届く位置に水と飼料を配置します。室温が低い場合は、手術後の回復から1日経過した後に、ケージの一部にヒートパッドを設置してください。ベースライン測定時の方法と同様に、手術群および偽手術群の両方のマウスからvon fray測定値を収集します。ここでは、4〜6匹のマウスで構成される群におけるVon Fre試験の結果を、手術の1日前および手術後2週間の日次で示しています。手術の翌日、動物は手術側（同側）の足裏に有意な機械的痛覚過敏を示しましたが、非手術側（対側）の足裏には影響が見られませんでした。対側面の閾値は、偽手術群のマウスと比較してわずかに低下しており、手術後のマウスにおいて軽度のMIアロディニアが発生している可能性が示唆されています。このビデオを視聴することで、麻酔下にあるマウスのS神経分枝の特定および操作方法について十分に理解できるはずです。また、フレイアッセイを用いることで、部分的な末梢神経損傷後のトランスジェニック動物や薬物の反応を定量的な機能的アウトカムとして評価することが可能になります。

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マウスで誘導機械的異痛症の倹約神経損傷（SNI）モデル

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