Photo-Induced Cross-Linking delle proteine ​​non modificati (PICUP) applicata a peptidi amiloidogenico

Summary

Foto-indotta cross-linking delle proteine ​​non modificato (PICUP) permette la caratterizzazione della distribuzione dimensionale oligomeri in miscele proteiche metastabili. Dimostriamo applicazione di PICUP a tre peptidi rappresentante amiloidogenico il 40 – e 42-residuo forme di β-amiloide, proteina, e la calcitonina, e un peptide di controllo della crescita-fattore di rilascio dell'ormone.

Abstract

L'assemblaggio delle proteine ​​amiloidogenica in oligomeri tossici è un evento fondamentale nella patogenesi delle malattie misfolding, tra cui l'Alzheimer, il Parkinson, la corea di Huntington e le malattie, ereditarie sclerosi laterale amiotrofica, e diabete di tipo 2. A causa della natura metastabile di queste assemblee di proteine, è difficile valutare la distribuzione delle dimensioni oligomero quantitativamente con metodi classici, come l'elettroforesi, cromatografia luce, fluorescenza, o dinamico dispersione. Oligomeri di proteine ​​amiloidogenica esistono come miscele metastabile, in cui gli oligomeri dissociano in monomeri e associare in grandi gruppi contemporaneamente. PICUP stabilizza popolazioni oligomero da covalenti cross-linking e in combinazione con metodi di frazionamento, come il sodio dodecil solfato elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) o la dimensione-cromatografia di esclusione (SEC), PICUP fornisce istantanee delle distribuzioni di dimensioni oligomero che esisteva prima croce -linking. Quindi, PICUP permette la visualizzazione e l'analisi quantitativa delle popolazioni di proteine ​​metastabili e possono essere utilizzati per monitorare le relazioni di assemblaggio e decifrare tra le modifiche sequenza e oligomerizzazione¹. Meccanicisticamente, PICUP coinvolge foto-ossidazione del Ru^{2 +} In un (bipyridyl) tris Ru (II), complessi (RuBpy) alla Ru^{3 +} Per irraggiamento con luce visibile in presenza di un accettore di elettroni. Ru^{3 +} È un forte ossidante di un elettrone in grado di astrarre un elettrone da una molecola di proteina vicini, generando una proteina radicale^1,2. I radicali sono instabili, specie altamente reattiva e quindi scomparire rapidamente attraverso una serie di reazioni intra ed intermolecolari. Un radicale può utilizzare l'energia di un elettrone spaiato a reagire con un altro monomero proteina dimerica formando un radicale, che perde quindi un atomo di idrogeno e forma un stabile, covalentemente legato dimero. Il dimero può quindi reagire ulteriormente attraverso un meccanismo simile con monomeri e dimeri di altri per formare oligomeri di ordine superiore. Vantaggi del PICUP rispetto ad altri foto-chimiche o cross-linking metodi^3,4 Sono brevi (≤ 1 s) l'esposizione a non distruttiva la luce visibile, senza bisogno di<i> Pre facto</iModifica> la stessa sequenza, e di lunghezza zero covalente cross-linking. Inoltre, consente PICUP cross-linking delle proteine ​​all'interno di pH e temperatura, inclusi i parametri fisiologici. In questo studio dimostriamo applicazione di PICUP di cross-linking di tre proteine ​​amiloidogenica il 40 – e 42-β-amiloide residui di proteine ​​varianti (Aβ40 e Aβ42) e la calcitonina, e una proteina di controllo, l'ormone della crescita-releasing factor (GRF).

Protocol

1. Peptide preparazione Pesare ~ 100-200 mg di peptide liofilizzato utilizzando una microbilancia e trasferimento in etichetta, siliconato, a basso adsorbente tubi microcentrifuga. Qui, usiamo le sequenze umano di Aβ40, Aβ42, calcitonina, e GRF. Qui, usiamo peptidi pre-trattati con 1,1,1,3,3,3-esafluoro-2-propanolo (HFIP) per ottenere omogeneo, aggregato senza preparazioni. Questo passaggio è necessario perché preformato aggregati indurre una rapida aggregazione di proteine ​​amiloidogenica,…

Discussion

PICUP è stato sviluppato originariamente per studiare complessi proteici stabili ^2. Il metodo è stato applicato in seguito allo studio quantitativo delle assemblee metastabili proteina amiloide, tra cui Aβ ^10, prioni e le malattie associate PrP ^{Sc 11} e α-sinucleina ^12. I fattori più importanti che devono essere considerati quando si progetta un esperimento PICUP sono la stechiometria dei reagenti, tempo di irradiazione, e la preparazione procedura di esempio. I primi due problemi può richied…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Dolan-Jenner 200-W incandescent lamp	其他	Dolan-Jenner Industries	Model 170-D	The heat generated by the lamp does not affect samples for short incubation periods.
35-mm SLR camera body	Tool	Pentax	SP500 model	In our settings, a bellows is attached to the body of the camera to provide a convenient chamber for irradiation of the sample placed 10 cm away from the light source.
Clear, thin walled PCR tubes	其他	Eppendorf	951010006 supplied by Fisher L22-003-24
Glass vials (1.8 mL)	其他	Kimble Chromatography	60940A 2, supplied by Fisher 03-340-60
GRF	Reagent	Bachem	H-3695
HFIP	Reagent	TCI America	H0424	Use in a fume hood.
Aβ40 and Aβ42	Reagent	UCLA Biopolymers Laboratory
Calcitonin	Reagent	American Peptide	22-1-10
Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate	Reagent	Sigma	224758-1G	Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h.
Ammonium persulfate	Reagent	Sigma	A-7460	Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h.
β-mercaptoethanol	Reagent	Sigma	M7154-25 ML	Can be used when SDS-PAGE analysis is performed.
Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x)	Reagent	Invitrogen	LC1676
XCell SureLock Mini-Cell	Tool	Invitrogen	EI0001
Novex Tricine Gels (10-20%)	其他	Invitrogen	EC6625B0X
Novex Tricine SDS Running Buffer (10x )		Invitrogen	LC1675
Silver Express Staining Kit		Invitrogen	LC6100