Tüm Plazmidler Homemade Sitesi Yönetmen Mutagenez
Summary
Tüm plazmid Site directed mutagenesis özgün bir plazmid biraz farklı varyasyonlarını oluşturmak için basit bir yoludur. Burada temel yerine plazmid kullanarak standart reaktifleri tanıtmak için kolay ve maliyet etkin bir şekilde göstermektedir.
Abstract
Tüm plazmid Site directed mutagenesis özgün bir plazmid biraz farklı varyasyonlarını oluşturmak için basit bir yoludur. Bu yöntem ile klonlanmış hedef gen doğrudan bir plazmid içine birkaç üslerinden ikame, silme veya ekleme tarafından değiştirilebilir. Sadece olmayan bir PCR tabanlı thermocycling reaksiyon, tüm plazmid yükseltme çalışır. Reaksiyon sırasında istenilen mutasyonu taşıyan mutajenik primerler, yeni sentezlenmiş plazmid entegre edilmiştir. Bu video öğretici bir plazmid temel yerine tanıtmak için kolay ve maliyet etkin bir şekilde göstermektedir. Protokol standart reaktifleri ile çalışır ve genellikle çok pahalı ticari kitleri, bağımsız. Bu protokolü uygulamak bazı ticari kitleri kullanılarak maliyeti ne sekizde bir tepkimenin toplam maliyetini düşürebilir. Bu video da sürecinde kritik adımlar yorum ve mutajenik primerler dizayn konusunda ayrıntılı talimatlar vermek.
Protocol
Discussion
Sitesi directed mutagenesis bir plazmid tarafından taşınan bir gen mutasyona hızlı bir şekilde sağlayan bir mutagenez yöntemdir. Tüm reaksiyon sadece bir gün içinde yapılabilir. Bu yöntemle, istenilen mutasyonları taşıyan ücretsiz primerler sadece bir çift ve Pfu-Polimeraz gibi bir redaksiyon polimeraz gerekecektir. Yeni sentezlenmiş plazmid restriksiyon enzim DpnI ile reaksiyon sindirerek ebeveyn plazmid ayrılabilir. Bu enzim sadece metillenmiş DNA sindirir. Bu nedenle sadece yeni sentezlenmiş pla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Pfu polymerase (recombinant or native) | fermentas | EP0571 or EP0501 | ||
| dNTP mix 10 mM | fermentas | R0191 | ||
| DpnI or DpnI Fast digest | fermentas | ER1701 | ||
| primers | invitrogen | desalted |
References
- Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. QuikChange site-directed mutagenesis. Strategies. 9, 3-4 (1996).
