Dissection de Saccharomyces cerevisiae Asques

Summary

Micromanipulation des cellules de levure est nécessaire pour l'analyse génétique méiotique ou pour sélectionner les zygotes diploïdes. Ces micromanipulations sont effectuées en utilisant le micro-aiguille d'un microscope à dissection. La micro-aiguille est utilisée pour déplacer des cellules et est contrôlé par un micromanipulateur qui sont disponibles avec différents degrés d'automatisation.

Abstract

La levure est un système modèle très souple qui est utilisé pour étudier de nombreux processus cellulaires différents. La souche de laboratoire commun<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Existe soit dans un état haploïde ou diploïde. La capacité de combiner des allèles de deux haploïdes et la capacité d'introduire des modifications du génome nécessite la production et la dissection des asques. La production de cellules haploïdes Asques commence par l'accouplement de deux souches haploïdes de levure avec les types d'accouplement compatibles pour produire une souche diploïde. Ceci peut être accompli dans un certain nombre de façons, soit sur support solide ou en liquide. Il est avantageux de choisir pour les diploïdes en milieu qui favorise leur croissance de manière sélective par rapport à l'une des deux souches haploïdes. Les diploïdes sont alors autorisés à sporuler sur pauvres en éléments nutritifs milieu pour former asques, un faisceau de quatre cellules filles haploïdes résultant de la reproduction méiotique des diploïdes. Un mélange de cellules végétatives et asques est ensuite traité avec les enzymes pour digérer zymolyase loin le sac membrane entourant les ascospores de l'ASCI. Par micromanipulation avec une micro-aiguille sous un microscope de dissection on peut ramasser individuels asques et séparée et relocaliser les quatre ascopores. Asques disséqués sont cultivés pendant plusieurs jours et testés pour les marqueurs ou allèles d'intérêt en étalant sur des répliques milieux sélectifs appropriés.

Protocol

Construction de souches diploïdes Protocole pour la production de diploïdes par accouplement Les souches initiale doit être frappé sur milieu YPD, ou sélective, si nécessaire, pour produire des colonies isolées. Les deux souches haploïdes doit être de type sexuel opposé (c.-à-Mata et MATa). En utilisant une boucle d'inoculation stériles ramasser une petite partie d'une colonie de l'un des deux souches haploïdes. Sur une strie plaque YPD nouvelle fois la boucle dans un…

Discussion

Dissection La levure est un outil utile pour sélectionner de nouvelles souches avec des marqueurs souhaités. Lors de la détermination du modèle de croissance théorique de quatre ascospores, il est important de regarder le génotype de la cellule végétative. Si un plasmide est présent, il faut savoir s'il est seul exemplaire, faible ou forte que cela aura une incidence qui ascospores (s) de recevoir le plasmide et aura une incidence sur les prévisions et conclusions concernant les souches d'être manipul…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Singer MSM System 200	Microscope	Singer Instruments	NA
D-sorbitol	Reagent	BioShop	SOR508
Tris	Reagent	BioShop	TRS001
Zymolyase 100T	Reagent	Seikagaku Corporation	120493
Yeast extract	Reagent	BioShop	YEX401
Peptone	Reagent	BioShop	PEP 403
D-glucose	Reagent	BioShop	GLU501
Yeast nitrogen base	Reagent	BioShop	YNB406
Bio-tryptone	Reagent	BioShop	TRP402
Sodium chloride	Reagent	BioShop	SOD002
Potassium acetate	Reagent	BioShop	POA 301
Agar	Reagent	BioShop	AGR003
Adenine sulfate	Reagent	BioShop	ADS201
L-uracil	Reagent	BioShop	URA 241
L-tryptophan	Reagent	BioShop	TRP 100
L-histidine	Reagent	BioShop	HIS 200
L-arginine	Reagent	Amresco	0877-100G
L-methionine	Reagent	BioShop	MET 222
L-tyrosine	Reagent	BioShop	TYR 333
L-isoleucine	Reagent	BioShop	ISO 910
L-valine	Reagent	BioShop	VAL 201
L-lysine	Reagent	BioShop	LYS 101
L-phenylalanine	Reagent	BioShop	PHA 302
L-glutamic acid	Reagent	BioShop	GLU 202
L-threonine	Reagent	BioShop	THR002
L-leucine	Reagent	BioShop	LEU 222