测量芽殖酵母的复制寿命

摘要

本文介绍了一种测定酵母母细胞复制寿命的通用实验方案。

摘要

衰老是一种退行性过程，其特征是细胞组分和细胞器进行性退化，最终导致死亡。芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae已被广泛用于研究衰老生物学，且已在包括线虫、果蝇和小鼠在内的多细胞真核生物中发现若干酵母寿命决定因子具有保守性¹. 由于缺乏易于量化的与年龄相关的表型，酵母衰老的研究几乎完全依赖于在不同条件下测量细胞的寿命，目前常用两种不同的寿命研究范式². 时序寿命是指母细胞在非分裂、类似静止状态下的存活时间，被认为可作为多细胞真核生物中终末分化细胞衰老过程的模型。相比之下，复制寿命指的是母细胞在衰老前产生的子代细胞数量，被认为可为有丝分裂活跃细胞的衰老提供模型。本文介绍一种通用的测定芽殖酵母母细胞复制寿命的实验方案。复制寿命测定的目的是确定每个母细胞出芽的次数。通过标准光学显微镜（总放大倍数160倍），如蔡司Axioscope 40或性能相当的其他型号，有经验的研究人员可轻松区分母细胞与子细胞。利用配备光纤针的手动显微操作仪可实现子细胞与母细胞的物理分离。典型的实验室酵母菌株每个母细胞可产生20-30个子细胞，完成一次寿命实验通常需要2-3周。

方案

第1部分：为复制性寿命分析准备菌株和培养皿

本部分介绍了用于复制性寿命实验的固体YEPD平板的制备，以及用于寿命分析的酵母细胞的准备。

1. 采用适当的无菌技术，制备用于培养酵母细胞及进行复制性寿命分析的 YEPD 琼脂平板（1% 酵母提取物，2% 胰蛋白胨，2% 琼脂，2% 葡萄糖）。在寿命实验中，每分析 4–5 株菌株应至少准备 2 块平板。平板应在寿命实验开始前至少 2 天制备，并在实验开始前使其充分干燥。若实验在倒平板后 4–5 天内无法启动，则应将平板置于冷藏培养箱中，并用封口膜或塑料膜包裹，以防脱水。
2. 从冷冻保藏菌种中取出酵母菌株，并在 YEPD 琼脂平板上划线以获得单菌落。通过将平板均分为若干等大的扇形区域，可在同一块 YEPD 平板上轻松划线接种最多 6 株菌株。
3. 将细胞在 30°C 下培养 2 天。
4. 从培养箱中取出平板，挑取单菌落中的细胞，并将其转接到一块新的 YEPD 平板上进行点种。每株菌应从两个不同的单菌落中分别进行两次点种。此时应对待分析的菌株进行编码，以确保复制性寿命实验以“盲法”方式进行，即操作人员在实验过程中不知晓各菌株的具体身份。
5. 将已点种并编码的细胞在 30°C 下继续培养，直至次日晚上。
6. 取出细胞，将每株编码菌株的细胞轻轻点种至新的 YEPD 平板上，这些平板将作为复制性寿命分析的实验平板。细胞应沿 YEPD 平板左侧的垂....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	试剂	Fisher Scientific	DF0145-17-0 (214530)
蛋白胨	试剂	Fisher Scientific	DF0118-17-0 (211677)
酵母提取物	试剂	Fisher Scientific	DF0886-17-0 (288620)
葡萄糖