Шаг за шагом ведет к генерации целевого химерных эмбрионов данио путем трансплантации в бластулы или гаструлы.
Abstract
Один из самых мощных инструментов, используемых, чтобы разобраться в сложных процессах развития является анализ химерных эмбрионов. Химера определяется как организм, который содержит клетки, из более чем одного животного; мозаики являются одним из типов химер, в которых клетки из более чем одного генотипа смешиваются, обычно дикого типа и мутанта. В данио, химеры могут быть легко сделаны трансплантации клеток от донора эмбриона в хост эмбриона на соответствующие зачаточном состоянии. Меченых клеток донора генерируются путем инъекции линии маркера, такие, как флуоресцентный краситель, в один-клеточной стадии эмбриона. Меченые клетки донора будут удалены из доноров эмбрионов и внедрена в немеченого эмбрионов хоста с помощью масла контролируемого пипетки стекла установлен на любой соединения или рассекает микроскопом. Донорские клетки в некоторых случаях может быть направлена на конкретного региона или ткани развивающихся бластулы или гаструлы зародыш хост этапе, выбрав трансплантации сайта в принимающей эмбрион на основе четко установленных карт судьбы.
Protocol
Шаг за шагом ведет к генерации целевого химерных эмбрионов данио путем трансплантации в бластулы или гаструлы. Один из самых мощных инструментов, используемых, чтобы разобраться в сложных процессах развития является анализ химерных эмбрионов. Химера определяется как ?…
Discussion
Легкость, с которой трансплантации может быть использована для выпуска целевых химеры является одной из великих держав данио, как позвоночных модели. Модификации этого протокола, не описанные выше, позволяет анализ материнской функции гена генов с существенную роль в зиготических ра?…
Acknowledgements
Благодаря членам лаборатории Moens для полезной информации во время написания этой статьи. HK является после защиты докторской диссертации поддерживается NIH / NICHD грант № 5R01HD037909-08. CBM является следователь Медицинского института Говарда Хьюза.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Injection rig
Applied Scientific Instrumentation
MPPI-3
Foot pedal can be ordered separately
Pronase
Sigma
P5147
“protease type XIV”
Pen-Strep
Sigma
P4458
100x stock
Methyl cellulose
Sigma
M-0387
Fluorescent dextrans
Molecular Probes/ Invitrogen
various
Eg. lysine-fixable rhodamine dextran (D7162)
Injection pipettes (1.2mmx0.94mmx10cm)
Sutter
BF120-94-10
Transplant pipette option 1
World Precision Instruments
TW100-4
Transplant pipette option 2
VWR
#53508-400
micromanipulator
Narishige
UMJ-3FC (?)
Micromanipulator magnetic stand
Narishige
GJ-1
Transplant apparatus
Sutter Instrument Co.
MI-10010
Fine micromanipulator
Narishige
MMO-203
Depression slides
Fisher
12560A
Agar molds for injection and transplants
AL-AN Mfg, Inc.
Reagents: Recipes for many of the reagents used for these procedures are found in The Zebrafish Book, which is available in full online at http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Recipes are provided there for preparation of Fish Water, Embryo Medium with and without antibiotics, pronase for dechorionating, fluorescent dextrans, and methyl cellulose.
Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation. J. Vis. Exp. (29), e1394, doi:10.3791/1394 (2009).