מהיר רגיש Colloidal Coomassie G-250 מכתים עבור חלבונים ג'ל polyacrylamide
Summary
וידאו זה יהיה פופולרי colloidal Coomassie G-250 פרוטוקול מכתים פי קאנג<em> Et al.</em> לצורך זיהוי של חלבון 4 ממוצע ng ב ג'לים. מכתים הושלם בתוך 2 שעות ללא כל מאמץ. אנו משתמשים באופן שגרתי פרוטוקול של קאנג למטרות אנליטיות הג'ל מבוסס proteomics.
Abstract
Coomassie מבריק כחול (CBB) הוא צבע נפוץ עבור להדמיה של חלבונים מופרדים על ידי SDS-PAGE, המציע הליך מכתים פשוט quantitation גבוהה. יתר על כן, הוא תואם לחלוטין עם הזדהות המונית חלבון spectrometric. אך למרות יתרונות אלה, CBB נחשב להיות רגישים פחות כסף או stainings הקרינה ולכן רק לעתים נדירות נעשה שימוש לצורך זיהוי של חלבונים הג'ל מבוסס גישות אנליטיות proteomic.
שיפורים אחדים המקורי Coomassie פרוטוקול 1 נעשו כדי להגדיל את הרגישות של CBB. שני השינויים העיקריים שהוכנסו על מנת לשפר את הזיהוי של נמוכה שפע חלבונים ידי המרת מולקולות צבען לחלקיקים colloidal: בשנת 1988 חל נייהוף ועמיתיו מתנול 20% ו ריכוזים גבוהים יותר של אמוניום סולפט לתוך פתרון ה-G-250 מכתים CBB מבוסס 2, ובשנת 2004 Candiano et al. הוקמה כסף כחול באמצעות CBB G-250 עם חומצה זרחתית בנוכחות סולפאט אמוניום, מתנול 3. עם זאת, כל השינויים האלה רק לאפשר זיהוי של חלבון כ 10 ננוגרם. פרוטוקול fameless נרחב מכתים Coomassie colloidal פורסם על ידי קאנג et al. בשנת 2002 שונה שם הם מכתים פרוטוקול colloidal של נייהוף CBB לגבי חומרים complexing. במקום אמוניום סולפט הם השתמשו סולפט אלומיניום מתנול הוחלף 4 אתנול פחות רעיל. אלומיניום מבוסס הרומן מכתים במחקר של קאנג הראו רגישות מעולה שמזהה נמוך כמו 1 ng / להקה (phosphorylase ב) עם וריאציה קצת רגישות בהתאם חלבונים.
הנה, אנחנו מדגימים יישום פרוטוקול של קאנג עבור מכתים מהיר ורגיש Coomassie colloidal של חלבונים למטרות אנליטיות. נדגים את פרוטוקול מהירה וקלה באמצעות דו מימדי ג'לים ביצע באופן שגרתי בקבוצת העבודה שלנו.
Protocol
Discussion
חדשני או רק עוד פרוטוקול Coomassie?
כרגע קיימים פרוטוקולים מרובים עבור מכתים נהלים Coomassie כחול מבריק. רובם תוצאה של שינויים קלים או גדולים של אחד הפרוטוקולים הנפוצים ביותר על ידי נייהוף ועמיתיו 2. כמו כן, פרוטוקול של קאנג מבוסס על …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד"ר ניקולה Wiethölter עבור הכנת מכתים של 1-D ג'לים.
עבודה זו מומנה על ידי מענק מטעם דויטשה Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 ל ND ו – SM) ונתמך על ידי מענק מחקר מן Manchot יורגן Stiftung ל ND.
Materials
| Name of product | Company | Catalogue No. | Comments |
| For IEF and SDS-PAGE: | |||
| Immobiline DryStrip gels | GE Healthcare | 17-6001-94 | Can even be used 2 years after expire date. |
| Immobiline DryStrip Reswelling Tray | GE Healthcare | 80-6371-84 | Do not clean with organic solvents. Designed for 7-18 cm IPG-strips. |
| Immobiline DryStrip Kit | GE Healthcare | 18-1004-30 | Includes a tray, electrode holder, anode and cathode electrodes, aligner and sample cup bar and sample cups. |
| EPS 3501 XL Power Supply | GE Healthcare | 18-1130-05 | Supplies voltage up to 3500 V. |
| Multiphor II Electrophoresis Unit | GE Healthcare | 18-1018-06 | Movable electrodes enable IEF in IPG strips of all length (7-24 cm IPG strips) |
| PerfectBlue gel system Twin S | Peqlab | 45-1010-C | SDS-PAGE in 10×10 cm mini-gel format. Gel chamber includes a cooling system. |
| For colloidal Coomassie G-250 staining: | |||
| staining dishes with lids | VWR | 216-3412 | Fits for mini-gels. Stackable on shaker. |
| aluminium sulfate-18-hydrate | Merck | 1.01102.5000 | We made best experience with Merck. Just available in 5 kg package. |
| orthophosphoric acid | Prolabo | 20 624.295 | Sold in glass bottles. |
References
- Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips. Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).
- Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).
- Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).
